ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

NGUYỄN THỊ BƢỞI

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT
TỪ CẶN CHIẾT ETHYL ACETAT VỎ QUẢ
CÂY BẢY LÁ MỘT HOA
(Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H. Hara)
TRỒNG Ở LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

Ngƣời thực hiện: NGUYỄN THỊ BƢỞI

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT
TỪ CẶN CHIẾT ETHYL ACETAT VỎ QUẢ
CÂY BẢY LÁ MỘT HOA
(Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H. Hara)
TRỒNG Ở LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa: QH.2012.Y
Ngƣời hƣớng dẫn:

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 06 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Bƣởi


Ký hiệu
BLMH
CC
DCM
EtOAC
EtOH
GI50
HPLC
IC50
LD50
M
MeOH
MS
NMR
PP
PPC
PPY
SKLM
TGI
TLC
TT
UV
VKH&CNVN

đoạn EtOAc và các hợp chất phân lập đƣợc 32
Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1-3........................................... 33
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1.......................................................... 34
Hình 3.7. Sắc ký đồ TLC trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) của hợp
chất 1 và chất chuẩn stigmasterol

34

Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2.......................................................... 35
Hình 3.9. Phổ DEPT của hợp chất 2...............................................................36
Hình 3.10. Phổ ESI-MS của hợp chất 3..........................................................36
Hình 3.11. Phổ 1H-NMR của hợp chất 3........................................................ 37
Hình 3.12. Phổ 13C-NMR (A) và HSQC (B) của hợp chất 3..........................38


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...............................................................................................................
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................
DANH MỤC BẢNG BIỂU ..........................................................................................
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN................................................................................... 2
1.1.

1.2.

Tổng quan về chi Paris................................................................................ 2
1.1.1.

Phân loại thực vật và phân bố chi Paris................................................. 2

1.2.5.

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học........................................................ 14

1.2.6.

Cách trồng........................................................................................... 16

1.2.7.

Thu hái và chế biến.............................................................................. 16

1.2.8.

Công dụng và cách dùng..................................................................... 16

CHƢƠNG 2 – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................18
2.1.

Đối tƣợng................................................................................................... 18

2.2.

Hoá chất, trang thiết bị............................................................................... 18

2.3.

2.2.1.

Hoá chất.............................................................................................. 18


3.1.5.

Định tính glyco

3.1.6.

Định tính coum

3.1.7. Định tính chất béo, caroten, sterol ......................................

3.1.8. Định tính đƣờng khử, acid amin, acid hữu cơ ...................
3.1.9.

Định tính polys

3.2.

Chiết xuất ........................................................................................

3.3.

Khảo sát và phân lập các hợp chất trong cao ethyl acetat ..............

3.3.1. Khảo sát bằng SKLM .........................................................

3.3.2. Phân lập bằng phƣơng pháp sắc ký cột ..............................
3.4.

Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất đã phân lập đƣợc ...

của các hợp chất thiên nhiên để phát triển nguồn tài nguyên dƣợc liệu theo hƣớng
hiện đại ngày càng đƣợc chú trọng.
Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinenis) và những loài khác cùng chi
là những cây thuốc quý hiếm, thƣờng đƣợc sử dụng trong dân gian để tiêu sƣng
nhọt, chữa rắn cắn…[6], từ lâu Trung Quốc đã sử dụng vị thuốc này để điều trị ung
thƣ. Hiện nay, tác dụng dƣợc lý đặc biệt là tác dụng chống ung thƣ của Bảy lá một
hoa đang đƣợc các nhà khoa học trên thế giới đi sâu nghiên cứu. Một số tác dụng
dƣợc lý của loài Paris là tác dụng chống ung thƣ, điều hòa miễn dịch, cầm máu,
chống oxy hóa, kháng virus, kháng nấm, chống ký sinh trùng, hạ sốt, giảm đau, an
thần,….[1]. Về thành phần hóa học, các hợp chất đã phân lập đƣợc từ một số loài
Paris là saponin, flavonol, sphingolypid và các glycosid khác [7]. Tại Việt Nam đã
có một số nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của các bộ phận
trên mặt đất, dƣới mặt đất, thân rễ, tuy nhiên chƣa có nghiên cứu về phần vỏ quả
của Bảy lá một hoa.
Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng nhƣ giá trị sử dụng của loài
Paris polyphylla var. chinenis nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Chiết xuất,
phân lập một số hợp chất từ cặn chiết ethyl acetat vỏ quả cây Bảy lá một hoa
(Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H. Hara) trồng ở Lào Cai” với mục
tiêu phân lập và xác định cấu trúc 3 hợp chất hóa học từ cặn chiết ethyl acetat vỏ
quả cây Bảy lá một hoa thông qua việc thực hiện các nội dung sau:
- Định tính các nhóm hợp chất có trong vỏ quả bằng các phản ứng hóa học
đặc trƣng.
- Chiết xuất và phân lập các hợp chất.
- Xác định và nhận dạng cấu trúc của một số chất phân lập đƣợc trong phân
đoạn ethyl acetat.

1


CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN

trứng ngƣợc, mềm, gân bên rõ, không có cuống hoặc có cuống dài hoặc ngắn. Hoa
thƣờng đơn độc hoặc một vài hoa mọc ở đỉnh, to, màu lục, đều, lƣỡng tính, mẫu 3 5, cuống dài, thẳng đứng. Đài (2) 3 - 5 (10), rời nhau, hình mũi giáo, màu lục hoặc
màu trắng, thƣờng to hơn cánh hoa, xếp lợp hoặc hơi vặn. Cánh hoa 2 (3) - 5 (10),
dạng dải hoặc hình trứng, bằng nhau, màu sắc khác nhau. Nhị 3 - 22 chiếc, phần lớn

2


là 6 - 12; chỉ nhị dẹt, ngắn, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính
gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình cầu hoặc hình sợi hoặc
không kéo dài. Bầu thƣợng, tròn hoặc có cạnh, 3 - 12 lá noãn, nhiều ô, với kiểu
đính noãn trung trụ hoặc 1 ô với kiểu đính noãn bên, mỗi bên nhiều noãn; vòi nhụy
3 - 5, rời hoặc dính nhau phần gốc; đầu nhụy 3 - 5. Quả mọng hoặc quả nang, mở ở
lƣng ô. Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nƣớc hoặc
không, nội nhũ rắn chắc hoặc nạc, chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc
hình trứng [7].
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Paris L. ở Việt Nam [6],[ 7]
Loài
Paris delavayi Franch.
(Trọng lâu kim tiền)
Paris polyphylla Smith.
(Trọng lâu nhiều lá)
Paris dunniana Levl.
(Trọng lâu hải nam)
Paris fargesii Franch.

Paris chinensis Franch.
(Bảy lá một hoa, Tảo hƣu)

Paris yunnanensis Franch.

Các saponin này thƣờng có phần aglycon là diosgenin hoặc pennogenin hoặc
dạng bị hydroxyl hóa của hai dạng trên ở vị trí C-23, C-24 hoặc C-27. Các saponin
này có từ 1 đến 4 đƣờng và thƣờng liên kết với phần aglycon tại C-3. Một số
pennogenin saponin bị hydroxyl hóa tại vị trí C-23, C-24 và C-27 đƣợc phân lập
bởi Chen và cộng sự [14,15,41] từ loài P. axialis và PPY. Các saponin spirotan (hình
1.1) đã phân lập đƣợc là:
Diosgenin (1) phân lập từ thân và lá loài PPY [37]
Trillin (2), Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→4)-β-D-Glc (3) phân lập từ thân rễ
PP [39], thân và lá PPY [37]
Paris V (4) phân lập từ thân rễ PPC [30], thân và lá PPY [37]
Polyphyllin C (5) phân lập từ thân rễ PP [43]
Diosgenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-β-D-Glc (6) phân lập từ thân rễ PP [31]
Polyphyllin D/ Paris I (7) phân lập từ thân rễ PPC [30], thân rễ PPY [47]

4


Dioscin/Paris III (8) phân lập từ thân rễ Paris axialis, thân lá PPY [16]
Diosgenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-[α-L-Rha-(1→3)]-β-D-Glc (9) phân lập từ
thân rễ PP [43]
Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→2)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (10) phân lập từ
loài PPC [49]
Gracillin (11) phân lập từ loài PP [50], thân rễ PPY [47]
Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→4)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (12) phân lập từ
thân rễ PP [39]
Paris II (13) phân lập từ thân rễ PP, thân và lá PPY [50]
Polyphyllin F (14), Polyphyllin E (15) phân lập từ thân rễ PP [43]
Diosgenin-3-O-β-D-Glc-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-[α-L-Rha-(1→3)]-β-DGlc (16) phân lập từ thân rễ PP [50]
Reclinatosid (17), Loureirosid (18) phân lập từ thân rễ PP [51]
Diosgenin-3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)-β-D-Glc (19) phân lập từ

(25R)-26-O-β-D-Glc-22-hydroxy-5-en-furost-3β,26-diol-3-O-α-L-Rha(1→2)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (31) phân lập từ cây Paris quadriforia L. [33]
Parisaponin I (32) phân lập từ thân rễ PP [29]
Parisyunnanosid A (33), Th (34), Pseudoproto-Pb (35), Parisyunnanoside B
(36) phân lập từ thân rễ PP [51]
 Các saponin pseudo-spirostanol và pregnan
Chen và cộng sự lần đầu tiên phân lập đƣợc hai nhóm saponin pseudospirostanol và pregnan từ chi Paris, trong đó nhóm saponin pseudo-spirostanol
(1995) [17] gồm nuatigenin và isonuatigenin, năm 1990 công bố nhóm saponin
pregnan [14,18].
Các saponin pregnan (hình 1.3) đã công bố gồm:
Pregna-5,16-dien-3-ol-20-on-3-O-α-L-Rha-(1→2)-[α-L-Ara-(1→4)]-β-D-Glc
(37) [14]
Hypoglaucin H (38) phân lập từ lá PPY [37]
Chonglouosid SL-7 (39), Chonglouosid SL-8 (40) phân lập từ thân và lá PPY
[36]

Hình 1.3. Cấu trúc của các saponin pregnan
 Các saponin sterol khác
Năm 2009, Xiao và cộng sự phân lập đƣợc parispseudosid A và
parispseudosid B (41) [48]. 26-O-β-D-Glc-(25R)-Δ(5,6),(17,20)-dien-16,22-dion-

7


cholestan-3β,26-diol-3-O- α-L-Ara-(1→4)-[α-L-Rha-(1→2)]-β-D-Glc (42) đƣợc
phân lập từ thân rễ PP [51]. Hợp chất 18-norspirostanol đƣợc phân lập từ loài P.
quadrifolia bởi Nohara năm 1982 [33]. Năm 2016 Qin và cộng sự [35] đã phân lập
đƣợc hai sterol là 7α-hydroxy stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (43) và 7βhydroxy sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44).

Hình 1.4. Một số saponin steroid khác đƣợc phân lập từ các loài thuộc chi Paris
b. Các saponin triterpen


Một số phytosterols chính chứa stigmasterol (70), β-sitosterol (71), và chất
chuyển hóa của chúng trong chi Paris, Daucosterol (72) đƣợc phân lập từ P.
delavayi bởi Liu et al [50].

9


Bảng 1.2. Các flavonoid đƣợc phân lập từ chi Paris [50]

Hợp
chất
60

61

62

63

64 Glc-(1→6)-Glc RhaH 3-O-β-Dglucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid
65

Glc-(1→6)-Glc

66 Glc-(1→2)-RhaHOCH3 Isorhamnetin-3-O-β-D-runtinosid
67
68
69


Tên nƣớc ngoài: Parisette, Herbe – Paris (Pháp) [1].
Họ Trọng lâu (Trilliaceae) [1,10].

11


1.2.2. Đặc điểm thực vật
Bảy lá một hoa là cây thảo nhiều năm, cao 40 - 100 (130) cm; thân rễ gần
hình trụ ngắn, nằm ngang, đƣờng kính khoảng 2 cm; thân trên mặt đất thẳng đứng,
đơn độc không phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Lá 5 - 6
(7), xếp thành 1 vòng trên thân; phiến lá mỏng, màu lục, hình trứng ngƣợc, hình
thuôn, kích thƣớc 25 (27)  (5 – 7) cm, 5 - 7 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp
nhọn, gốc tròn hoặc hình nêm, cuống dài 2,5 - 4 (6) cm. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh
thân, to, đều, lƣỡng tính; cuống dài 15 - 40 cm, thẳng đứng. Đài 5 - 6 (7), dạng lá,
rời nhau, hình mũi giáo, kích thƣớc (3,5) 5 - 8 (9) × ((1) 1,5 - 2,5 (3,5)) cm, màu
lục. Cánh hoa 5 - 6 (7), màu vàng, dạng dải, kích thƣớc ((3) 4,5 - 6 (7))  0,1 cm,
bằng nhau. Nhị 10 - 12, dài 1,5 - 3 cm; chỉ nhị dẹp, dài 0,5 - 1,2 cm, đính ở gốc
mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới
kéo dài thành hình kim, dài 1 - 3 mm. Bầu thƣợng, hình trứng, 4 - 5 lá noãn, 5 - 6 ô,
đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhuỵ 5 - 6, dính nhau phần gốc; đầu
nhụy 5 – 6. Quả nang, mở ở lƣng ô. Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục,
nhẵn, vỏ hạt mọng nƣớc hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc chứa dầu, mỡ,
tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [7].

Hình 1.6. Các bộ phận sinh dƣỡng và sinh sản của Bảy lá một hoa – Paris polyphylla
var. chinenis Franchet đƣợc trồng tại Sapa, Lào Cai [11]

A. Thân khí sinh mang lá và hoa; B. Một lá; C. Thân rễ; D. Lát
cắt ngang thân rễ; E. Đài hoa; F. Cánh hoa; G. Nhị; H. Nhụy; I.
Quả; K. Hạt

Nguyễn Thị Thu, Trần Ngọc Lân, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Đắc Bình Minh,
Đào Thùy Dƣơng, Nguyễn Thị Duyên (2016), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi
học của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, 21( 4), 242-247.

Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Thị Thu, Phạm
Quốc Long (2016), “Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất Bảy lá một

13


hoa (Paris polyphylla var. chinensis Franchet) họ Trọng lâu (Triliaceae)”, Tạp chí
khoa học và công nghệ 56 (2C), 472-478
Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Hà, Trần Vũ Thắng, Nguyễn Quyết Chiến, Phạm
Quốc Long, “Thành phần hóa học cao phân đoạn etyl axetat cây Bảy lá một hoa
(Paris polyphylla var. chinensis Franchet) trồng tại Việt Nam”, Tạp chí Hóa học.
Những nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu tổng quan về thành phần hóa học chi Paris gồm hơn 70 hợp chất
đƣợc công bố, tuy nhiên hầu hết các hợp chất đều đƣợc phân lập từ Paris
polyphylla var. yunnanensis. 20 hợp chất đƣợc phân lập từ PPC và đều là các
saponin sterol gồm saponin diosgenin (12 hợp chất), saponin pennogenin (6 hợp
chất), hợp chất 39 và 42. Các hợp chất này đều đƣợc glycosid hóa tại vị trí C-3
trong đó saponin diosgenin là 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 và saponin
pennogenin là 21, 22, 23, 24, 25, 26.
1.2.5. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
1.2.5.1.

Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Theo nghiên cứu của Yoshihiro Mimaki và cộng sự phân lập đƣợc 10 saponin
steroid là: 4, 7, 11, 20, 21, 22, 24, 25, 26 và 28 từ cao methanol phần thân rễ Paris

B1 và CDK1 đồng nghĩa với việc làm tế bào không thể phân chia (Pha M của chu
trình tế bào). Dioscin cũng làm tăng quá trình apotosis của tế bào 17,18%±2,58%,
24,75%±2,72% và 54,91%±3,35% ứng với các mức liều 10, 50 và 250 μg/ml. Cơ
chế đƣợc cho là dioscin kích thích tăng giải phóng cytochrom C từ ti thể dẫn đến
tăng nồng độ enzym caspase-3 kích thích quá trình apotosis tế bào SGC-7901. Sau
2+

24h ủ dioscin, hợp chất này làm tăng vận chuyển Ca vào tế bào phụ thuộc nồng độ
41% ± 4,72%, 66% ± 5,61%, và 86% ± 7,25% tƣơng ứng với các liều 10, 50 và 250
μg/ml. Mặt khác, các nghiên cứu trƣớc chỉ ra sự gia tăng quá mức của nồng độ
2+

Ca . Sau 24h dùng thuốc, dioscin ức chế dòng tế bào ung thƣ dạ dày SGC-7901
2+

thông qua việc dừng chu kỳ tế bào tại pha G2/M và quá trình Ca - cytochrome Capoptosis [21].
Năm 2015, Hao Jiang và cộng sự nghiên cứu tác dụng chống ung thƣ phổi
của Paris saponin I (7) từ Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch) Hara và
Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch) Hand-Mazz. Kết quả cho thấy 7
ức chế dòng tế bào ung thƣ phổi kháng gefitinib PC-9-ZD in vitro với IC50 là
2,5132 μg/ml sau 24 h, giảm tỉ lệ kháng thuốc 1,77 lần. Tác dụng này là do 7 làm
tăng tính nhạy cảm của dòng tế bào này với phƣơng pháp xạ trị. Cơ chế đƣợc cho
là do 7 gây gián đoạn chu kì tế bào ở pha G2/M và gây ra quá trình chết tế bào do
làm tăng enzym caspase-3, yếu tố làm tăng giải phóng cytochrom C Bax, enzym
chặn chu kỳ tế bào P21

waf1/cip1

, giảm sản xuất Bcl-2 – yếu tố ức chế giải phóng


thống, hoạt huyết tán ứ, tiêu thũng [6].
Thƣờng dùng trị rắn độc cắn và sâu bọ đốt, viêm não truyền nhiễm, viêm mủ
da, lao màng não, hen suyễn. Còn dùng trị yết hầu, bạch hầu, trẻ em lên sởi có viêm
phổi, quai bị, lòi dom. Ngày dùng 6 – 15 g rễ, dạng thuốc sắc; nếu có ác tính, dùng
tới 15 – 30 g [6] .
Trung Quốc, vị thuốc tảo hƣu đƣợc chế biến từ thân rễ nhiều loài cây
thuộc chi Paris L. mọc ở những tỉnh miền Tây Nam Trung Quốc đã đƣợc dùng chủ
yếu làm thuốc chữa sốt, giải độc và chữa ho [1]. Cũng có khả năng trị kinh phong
lắc đầu, lè lƣỡi. Cũng có thể trị bệnh phổi và giang mai. Dân gian thƣờng dùng làm
mát khi bị sƣng đau và hen suyễn [6].
Ở

16