ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

DƢƠNG VĂN THẮNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH AURAMINE O TRONG THỰC PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP VON - AMPE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2018

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

DƢƠNG VĂN THẮNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH AURAMINE O TRONG THỰC PHẨM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP VON - AMPE

Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ KIM THƯỜNG




2.2.1. Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp CV ...........................................30
2.2.2. Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ
SqW, DP ....................................................................................................................31
2.3. Quy trình xử lý mẫu ....................................................................................... 32
2.3.1 Mẫu thịt gà ................................................................................................32
2.3.2. Mẫu nước dưa ..........................................................................................34
2.4. Trang thiết bị và hóa chất............................................................................... 35
2.4.1. Trang thiết bị ............................................................................................35
2.4.2. Hóa chất và dung môi ..............................................................................35
2.4.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất..............................................................36
2.4.3.1. Pha dung dịch gốc Auramine O 10- 3 M ............................................... 36
2.4.3.2. Pha dung dịch đệm BR có pH (2 đến 12) ............................................ 36
2.5. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích ....................... 36
2.5.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .......................36
2.5.2. Độ lặp lại của phương pháp .....................................................................37
2.5.3. Hiệu suất thu hồi ......................................................................................38
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 39
3.1. Nghiên cứu đặc tính điện hóa của Auramine O bằng phương pháp von ampe vòng (CV) ........................................................................................................ 39
3.1.1. Đặc tính điện hóa của Auramine O trên điện cực HMDE và GCE .........39
3.1.1.1. Đặc tính hấp phụ của AO trên HMDE.................................................39
3.1.1.2. Đặc tính hấp phụ của AO trên điện cực GCE ......................................41
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng pH ............................................................................42
3.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng pH trên điện cực HMDE .....................................42

4


3.1.2.2. Khảo sát ảnh hưởng pH trên điện cực GCE ........................................43

3.4.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của etanol trên điện cực GCE .............................71
3.4.2. Xây dựng đường chuẩn xác định AO trong nền mẫu thịt gà ................... 73
3.4.2.1. Đường chuẩn xác định AO trong nền mẫu thịt gà đo trên HMDE ......73
3.4.2.2. Đường chuẩn xác định AO trong nền mẫu thịt gà trên GCE ...............74
3.5. Áp dụng phân tích mẫu thật ........................................................................... 76
3.5.1. Áp dụng phân tích mẫu thật trên điện cực HMDE...................................76
3.5.2. Áp dụng phân tích mẫu thịt gà đo trên điện cực GCE và đo đối chiếu trên
LC - MS .....................................................................................................................77
3.5.3. So sánh ý nghĩa thống kê giữa hai phương pháp AdSV - DP và phương
pháp LC - MS ............................................................................................................81
3.6. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp ........................................................... 83
3.6.1. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp trên điện cực HMDE ...................84
3.6.2. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp trên điện cực GCE ......................84
3.7. Áp dụng phân tích Auramine O trong mẫu thịt gà ........................................ 85
3.7.1. Xây dựng đường chuẩn xác định AO trong nền mẫu dưa đo trên điện cực
GCE ...........................................................................................................................85
3.7.2. Áp dụng phân tích một số mẫu dưa trên thị trường .................................86
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 89
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 90

6


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Tiếng anh

Tiếng việt


Voltammetry
4

Auramine O

Vàng ô

AO

5

Britton – Robinson buffer

Britton - Robinson

B-R

6

Carbon Paste Electrodes

Điện cực than nhão

CPE

7

Cathodic Stripping



10

Voltammetry
11

Glassy carbon

Điện cực than gương

GCE

12

Hanging Mercury

Điện cực giọt thủy ngân

HMDE

Dropping Electrode

treo

7


13

High Perfomance Liquid


17

Liquid chromatography –

Sắc ký khối phổ

LC - MS

14

HPLC

IARC

mass spectrometry
18

Mercury Film Electrodes

Điện cực màng thủy ngân

MFE

19

Pararosalin

Pararosalin



Chiết pha rắn

SPE

24

Square Wave Voltammetry

Von ampe sóng vuông

SqW

25

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SD

26

Static Mercury Drop

Điện cực thủy ngân tĩnh

SMDE

Electrode

Bảng 1.3: Kết quả nghiên cứu xác định AO, PA, RB bằng phương pháp HPLC .... 21
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát tốc độ quét bằng đường CV trên HMDE ..................... 44
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát tốc độ quét bằng đường CV trên GCE ......................... 45
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng trên HMDE .... 47
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng trên GCE ........ 50
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ đến cường độ dòng trên
HMDE ...................................................................................................................... 52
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng trên
GCE .......................................................................................................................... 54
Bảng 3.8: khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ đến cường độ dòng trên
HMDE ...................................................................................................................... 56
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ đến cường độ dòng
trên GCE ................................................................................................................... 59
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét đến cường độ dòng trên
HMDE ...................................................................................................................... 60
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét đến cường độ dòng trên
GCE .......................................................................................................................... 62
Bảng 3.12: Các điều kiện tối ưu xác định AO trên GCE ......................................... 63
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ Auramine O đến cường độ dòng trên HMDE 64
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ AO đến cường độ dòng trên
GCE .......................................................................................................................... 66
Bảng 3.15: Đo độ lặp lại ở hai mức nồng độ 10-7 M; 1,2.10- 6 M trên HMDE ......... 68

10


Bảng 3.16: Đo độ lặp lại ở hai mức nồng độ 4.10- 8 M và 2.10- 7 M trên GCE ........ 69
Bảng 3.17: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thành phần dung môi trên
HMDE ...................................................................................................................... 70
Bảng 3.18: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thành phần dung môi trên GCE . 72

HMDE ...................................................................................................................... 53
Hình 3.16: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào giá trị thế hấp phụ trên
HMDE ...................................................................................................................... 53
Hình 3.17: Đường von - ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ trên GCE ......... 54
Hình 3.18: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào giá trị thế hấp phụ trên GCE ..... 55

12


Hình 3.19: Đường von - ampe hòa tan khi thay đổi thời gian hấp phụ ở nồng độ
10- 6 M trên HMDE ................................................................................................... 57
Hình 3.20: Đường von - ampe hòa tan khi thay đổi thời gian hấp phụ ở nồng độ
2,4.10-7 M trên HMDE ............................................................................................. 57
Hình 3.21: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào thời gian hấp phụ trên HMDE ... 58
Hình 3.22: Đường von - ampe hòa tan khi thay đổi giá trị thời gian hấp phụ trên
GCE .......................................................................................................................... 59
Hình 3.23: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào thời gian hấp phụ trên GCE ....... 59
Hình 3.24: Đường von - ampe hòa tan phụ thuộc của cường độ dòng vào giá trị tốc
độ quét trên HMDE .................................................................................................. 61
Hình 3.25: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào giá trị tốc độ quét trên HMDE ... 61
Hình 3.26: Đường von - ampe hòa tan của AO phụ thuộc vào tốc độ quét trên
GCE .......................................................................................................................... 62
Hình 3.27: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào giá trị tốc độ quét trên GCE ...... 63
Hình 3.29: Cường độ dòng pic phụ thuộc vào sự thay đổi nồng độ AO trên
HMDE ...................................................................................................................... 64
Hình 3.30: Đường chuẩn của AO trong khoảng nồng độ 4.10- 8 M đến 6,4.10- 7 M
trên HMDE ............................................................................................................... 65
Hình 3.31: Đường von - ampe phụ thuộc vào nồng độ của AO trên GCE .............. 66
Hình 3.32: Đường chuẩn AO từ khoảng nồng độ 1.10-



14


MỞ ĐẦU
Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là một vấn đề nhạy cảm, nhức
nhối, và gây xôn xao dư luận. Hàng loạt các vụ việc vi phạm an toàn vệ sinh thực
phẩm bị phát hiện: rau có thuốc trừ sâu; hoa quả có tồn dư chất kích thích, rượu giả,
sữa nhiễm độc.... Đặc biệt, gần đây việc lạm dụng các chất phụ gia, thuốc nhuộm
trong thực phẩm đã gây nhiều bức xúc và là một vấn đề gây ảnh hưởng tiêu cực đến
sức khỏe con người. Auramine O là chất màu tổng hợp, chỉ được sử dụng trong
công nghiệp để nhuộm nhiều sản phẩm như vải, giấy, gỗ…và dùng để làm màu sơn
quét tường, không được dùng trong thực phẩm. Theo Cơ quan nghiên cứu ung thư
quốc tế của Tổ chức y tế thế giới (WHO/IARC), Auramine O là chất đứng hàng thứ
5 trong 116 chất gây ung thư hàng đầu trên thế giới. Tuy nhiên, vì lợi nhuận trước
mắt, nhiều người kinh doanh thực phẩm đã dùng chất Auramine O để nhuộm màu
vào thực phẩm như măng tươi, thịt gà,dưa muối, nước tương, bim bim… làm tăng
màu vàng, nhìn cho đẹp mắt để có thể bán thực phẩm với giá thành cao. Khi người
tiêu dùng sử dụng những thực phẩm đó sẽ dễ hấp thụ luôn lượng Auramin O còn
tồn dư, dẫn tới nguy cơ bất lợi cho sức khỏe và có thể gây ung thư. Do đó, cần có
phương pháp để kiểm tra hàm lượng Auramine O trong mẫu thực phẩm.
Trên cơ sở đánh giá tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước, chúng tôi thấy
rằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và sắc kí lỏng ghép nối khối phổ xác
định Auramine O trong mẫu thực phẩm có độ nhạy cao nhưng giá thành thiết bị và
giá thành phân tích cao, thời gian phân tích lâu. Phương pháp von - ampe hòa tan
hấp phụ là phương pháp phân tích có độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình phân
tích không quá phức tạp, thiết bị phân tích không đắt, không tốn dung môi, chi phí
phân tích không cao. Hơn nữa, chưa có công trình nào xác định Auramine O trong
thực phẩm bằng phương pháp von- ampe hòa tan hấp phụ nên việc lựa chọn đề tài
rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Mặt khác, cần có phương pháp kiểm tra nhanh,



Bảng 1.1: Khối lượng sản xuất Auramine O ở một số quốc gia năm 2008 [18]
Năm

Sản lượng Auramine O (103 pounds)

1986

10 - 500

1994

10 - 500

1998

10 - 500

Trong y học: Auramine O có thể được dùng như chất huỳnh quang để xác
định vi khuẩn axit có trong đờm, mô nhiễm bệnh. Auramine O còn được sử dụng
kết hợp cùng thuốc rhodamine để phát hiện các vi khuẩn mycobacterium
tuberculosis. [24]
Trong công nghiệp: Auramine O là chất nhuộm màu tổng hợp, được sử dụng
trong công nghiệp để nhuộm các sản phẩm như vải, gỗ, giấy... và được dùng để làm
màu sơn quét tường. [27]
Trong quân sự: Auramine O được sử dụng tạo khói màu trong các ứng dụng
quân sự.
Ngoài ra, trước đây Auramine O đã từng bị phát hiện sử dụng để làm thuốc
nhuộm tóc, sử dụng trong tạo màu thực phẩm. [16]

Ý nghĩa

- Ung thư gan:

- P < 0,05 cả

đực 4/15; cái 3/15.

hai giới tính

- Ung thư hạch

- P < 0,01, F

- Thức ăn chứa 0,1 % AO
trong 52 tuần ( 728 mg /chuột).
- 15 chuột đực và 15 chuột cái
- 15 chuột đực và 15 cái: 2 lần
/tuần tiêm dưới da

đực 3/15; cái 8/15
- 15 chuột đực và 15 chuột cái

- Ung thư hạch:

Chuột nhắt

cho ăn thức ăn có hàm lượng

Chuột đực 4/7,

trong 52 tuần (3640 mg/chuột).

- 12 chuột đực ăn thức ăn chứa
Chuột [22]

0,1 % AO trong 87 tuần

11/12

(10g/con)

Chuột [24]

- Ung thư gan:

20 chuột đực và 20 chuột cái

- Chuột đực 13/20,

được cho ăn chế độ ăn uống có

8/20, 10/20

chứa AO ở mức 0, 50, 100 và

- Chuột cái 19/20,

200 ppm

18/20, 15/20, 19/20

Rhodamin B

Auramine O

Pararosalin

0,05 đến 100

0,05 đến 100

0,05 đến 50

Đánh giá phương pháp

LOD = 0,0125

LOD = 0,05

LOD = 0,0125

(µg/ml)

LOQ = 0,05

LOQ = 0,125

LOQ = 0,05

Độ thu hồi (%)


và 0,004 mg/kg cho safranine T. [32]
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detecter khối phổ
phân tích: α - Naphatol, β - Naphatol và AO trong sản phẩm đậu. Thành phần pha

21


động: ACN và H2O (7 : 3), khoảng tuyến tính từ 0,1 đến 20,0 μg/mL với hệ số
tương quan là 0,9999. Độ thu hồi của α - Naphatol, β - Naphatol và Auramine O
trong khoảng 5,0 đến 15,0 mg/kg dao động từ 88,8 % đến 93,0 % với RSD từ 0,67
% đến 1,66 % (n = 6). Giới hạn phát hiện của α - Naphatol, β - Naphatol và
Auramine O: 0,05 mg/kg. Với độ thu hồi cao, LOD thấp, phương pháp này thích
hợp cho việc xác định α - Naphatol, β - Naphatol và Auramine O trong sản phẩm
đậu. [26]
1.2.3. Phương pháp quang phổ
Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – Vis xác định AO dựa trên sự tạo phức
của AO với Albumin (huyết thanh bò). Các điều kiện đo: đệm B – R có pH = 7,
bước sóng tại 339 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,16 µm đến 50 µM với LOD
là 0,05 µM. [30]
Phương pháp phát quang hoá học (CL) được sử dụng để xác định Auramine
O dựa trên xúc tác của các hạt cacbon rỗng với phản ứng phát quang hóa học giữa
H2O2 và Na2CO3. Cường độ CL tỷ lệ thuận với nồng độ của AO trong khoảng tuyến
tính từ 10−7 M đến 10−5 M, và giới hạn phát hiện là 3,5.10−8 M. Phương pháp này
xác định AO trong cá hổi và bồ hoàng (1 loại thuốc chữa bệnh) có độ thu hồi từ
95% tới 105%. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) nhỏ hơn 3,1 % (đo lặp lại 7 lần ở
10−6 M). [25]
Phương pháp quang phổ bức xạ kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến
(2DCOS - PLSR) xác định AO trong thảo mộc và thực phẩm với Rc = 0,9978,
RMSEC = 0,554 %, RPD = 15,38; RP = 0,9962; RMSEP = 0,7527 %. [31]
1.2.4. Phương pháp điện di mao quản

(glassy carbon, paste carbon…), điện cực so sánh có thế không đổi thường là điện
cực calomen (Hg, Hg2Cl2 | KCl ||) hoặc điện cực bạc clorua (Ag, AgCl | KCl ||) có
bề mặt lớn và điện cực phụ trợ Pt. Nắp bình điện phân còn có một đường dẫn luồng
khí trơ (N2, Ar,…) vào bình dung dịch phân tích để loại bỏ Oxi hòa tan trong dung
dịch.

23


1.4.1. Các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hoà tan chất cần phân tích
Kỹ thuật xung vi phân (DDP)
Kỹ thuật Von - Ampe xung vi phân được dùng phổ biến nhất để ghi đường
Von - Ampe hòa tan. Theo kỹ thuật này, những xung thế có biên độ như nhau
khoảng 10  100 mV và bề rộng xung không đổi khoảng 30  100 ms được đặt
chồng lên mỗi bước thế.
Dòng được đo hai lần: trước khi nạp xung (I1) và trước khi ngắt xung (I2),
khoảng thời gian đo dòng thông thường là 10  30 ms.
Ở thời điểm t1: I1 = Ikt1 + Ic1
Ở thời điểm t2: I2 = Ikt2 + Ic2
Với I1, I2, Ikt1, Ikt2 , Ic1, Ic2 lần lượt là dòng ghi được, dòng khuếch tán và dòng
tụ điện ở hai thời điểm t1 và t2.
Dòng thu được là hàm của thế đặt lên điện cực làm việc IP= f(EWE) và có giá
trị là hiệu của hai giá trị dòng đó (IP = I2  I1).
Khi xung thế được áp vào, dòng tổng cộng trong hệ sẽ tăng lên do sự tăng
dòng Faraday (IF) và dòng tụ điện (Ic). Dòng tụ điện giảm nhanh hơn nhiều so với
dòn Faraday, vì:
IC  IC0 . e- t/RC*
Ở đây, t: thời gian, R: điện trở, C*: điện dung vi phân của lớp kép.
Theo cách ghi dòng như trên, dòng tụ điện ghi được trước lúc nạp xung và
trước lúc ngắt xung là gần như nhau và do đó, hiệu số dòng ghi được chủ yếu là

phụ làm giàu thường diễn ra tương đối nhanh so với quá trình điện phân làm giàu.
Trong quá trình hấp phụ làm giàu điện cực làm việc được giữ ở một thế chọn trước
không tương ứng với dòng giới hạn. Quá trình này không liên quan tới sự trao đổi e
trên điện cực.
Bản chất hấp phụ ở đây có thể là sự hấp phụ hóa học hoặc hấp phụ điện hóa
trong 1 số trường hợp là tổng của 2 quá trình. Kết quả phân tích thường ổn định nếu
hấp phụ là đơn lớp.
Phương pháp von – ampe hòa tan hấp phụ gồ m ba giai đoa ̣n:

25