TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
--------------------

NGUYỄN THỊ MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
TẠO NƯỚC GIẢI KHÁT TỪ TẢO XOẮN SPIRULINA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh học

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
--------------------

NGUYỄN THỊ MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA
ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN
TẠO NƯỚC GIẢI KHÁT TỪ TẢO XOẮN SPIRULINA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh học

Người hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Minh Phương


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật,
đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em. Tất cả những số liệu đều
được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không có số
liệu sao chép, bịa đặt. Đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình
nghiên cứu của các tác giả khác.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác,
em xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, ngày…..tháng 04 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Minh Phương


BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

1. TCN

: Trước côngnguyên

2. VK

: Vi khuẩn


1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina ................................................................ 3
1.1.1. Lịch sử về tảo xoắn Spirulina ................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm phân loại.................................................................................. 4
1.1.3. Đặc điểm cấu tạo của tảo xoắn................................................................ 4
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng trong tảo xoắn Spirulina .................................. 6
1.2. Vi sinh vật và quá trình lên men tạo nước giải khát từ tảo xoắn
Spirulina ............................................................................................................ 6
1.2.1. Vi khuẩn Lactic ....................................................................................... 6
1.2.2. Vi khuẩn giấm ......................................................................................... 8
1.2.3. Nấm men ................................................................................................. 9
1.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên
men tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina ................................................. 10
1.2.5. Cơ chế của quá trình lên men lactic ...................................................... 14
1.3. Ứng dụng của Spirulina ........................................................................... 14
1.3.1. Ứng dụng trong thực phẩm ................................................................... 14
1.3.2. Ứng dụng trong xử lý môi trường......................................................... 15
1.3.3. Ứng dụng trong y học ........................................................................... 17
1.3.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm ..................................................................... 17


1.3.5. Ứng dụng tảo làm thức ăn cho vật nuôi ................................................ 18
1.4. Tình hình nghiên cứu của tảo xoắn Spirulina hiện nay ........................... 18
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới........................................................ 18
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 22
2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu ............................................................. 22
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 22
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm ............................................................... 22
2.2. Các loại môi trường.................................................................................. 23
2.2.1. Môi trường phân lập giống vi khuẩn lactic: MRS thạch (g/l)............... 23

Hình 3.1. Dịch lên men từ bột tảo xoắn .......................................................... 29
Hình 3.2. Mẫu thử hoạt tính catalaza .............................................................. 33
Hình 3.3. Mẫu thử khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Ufelmann ........ 34
Hình 3.4. Vòng phân giải CaCO3 của chủng Lactobacillus L5 ..................... 35
Hình 3.5. Khả năng lên màng của chủng vi khuẩn Lactobacillus L5 ............. 36
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn số lượng tế bào ở các mức nhiệt độ khác nhau
trong môi trường lên men của các nhóm vi sinh vật đã tuyển chọn. ............. 38
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH, acid tổng số, ethanol................ 39
Hình 3.8. Sự biến thiên của hàm lượng đường sót ở các ................................
40 hàm lượng giống bổ sung khác nhau ..............................................................
40
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH theo thời gian lên men .............. 42
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH theo thời gian lên men ............ 42
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH theo thời gian lên men ............ 42


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và kích thước của vi khuẩn lactic trong các
mẫu phân lập ................................................................................................... 31
Bảng 3.2. Kích thước vòng phân giải của 9 chủng vi khuẩn Lactobacillus ... 35
Bảng 3.3. Đánh giá khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus ................................................................................................... 36
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ............................. 46
của các chủng vi sinh vật tuyển chọn.............................................................. 46
Bảng 3.5. Sự biến đổi thành phần hóa học trong quá trình lên men............... 46
tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina ......................................................... 46


MỞ ĐẦU

Hơn nữa, các công trình nghiên cứu về tảo xoắn ở nước ta vẫn chưa đầy đủ,
hoàn chỉnh. Đặc biệt là những nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi
trường tới quá trình lên men tạo nước giải khát từ tảo xoắn. Vì vậy, tôi quyết

2


định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến
quá trình lên men lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulia”.
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình lên men
lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulia.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men từ tảo
xoắn Spirulina để tạo nước giải khát.
3.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình lên men
lactic tạo nước giải khát từ tảo xoắn Spirulina.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tế
4.1 Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng cơ sở khoa học của quá trình lên men lactic để nghiên cứu ảnh
hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo Nước giải khát từ
tảo xoắn Spirulina.
4.2 Ý nghĩa thực tế
Là một trong những công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu ảnh
hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng lên men dịch tảo xoắn
Spirulina để sản xuất nước giải khát. Từ đó cho ra sản phẩm nước giải khát
đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng.
5. Đóng góp của đề tài
5.1. Phân lập được 15 chủng vi khuẩn lactic và dựa vào đặc điểm hình thái,
kích thước tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng xác định là vi khuẩn

và dược liệu quý, đặc biệt trong chống lão hóa và chống suy dinh dưỡng. Hai
mươi năm sau, vào những năm cuối của thập kỉ 80 thế kỉ XX - nhiều giá trị
dinh dưỡng và chức năng sinh học của tảo Spirulina đã được khám phá và
công bố rộng rãi không chỉ ở Pháp và ở cả nhiều nước khác trên thế giới như
Mỹ, Nhật, Canada, Mehico, Đài Loan...

4


1.1.2. Đặc điểm phân loại
Tảo Spirulina là các vi sinh vật có hình xoắn sống trong nước mà ta
quen gọi là Tảo xoắn với tên khoa học là Spirulina platensis. Thực ra đây
không phải là một sinh vật thuộc ngành Tảo (Algae) vì Tảo thuộc giới sinh
vật có nhân thật (Eukaryotes). Spirulina thuộc ngành Vi khuẩn lam
(Cyanobactera), chúng thuộc giới sinh vật có nhân sơ hay nhân nguyên thủy
(Prokaryotes). Những nghiên cứu mới nhất lại cho biết chúng cũng không
phải thuộc chi Spirulina mà lại thuộc chi Arthrospira [14].
Về phân loại khoa học [14, 22], tảo Spirulina thuộc:
- Giới (domain): Bacteria
- Ngành (phylum): Cyanobactera
- Lớp (class): Chroobacteria
- Bộ (order): Oscillatoriales
- Họ (family): Phormidiaceae
- Chi (genus): Arthrospira
-

Loài (species): Anthrospira platensis

Vì có cấu tạo và chức năng khác các loài thông thường nên Spirulina
còn có tên là vi khuẩn lam hay phiêu sinh thực vật.

các hạt cyanophycin, thể polyhedral, các hạt poliglucan, hạt lipid, các
hạt poliphotphat. Các hạt cyanophycin, hay còn gọi là các hạt dự trữ, có vai
trò quan trọng do các hợp chất hoá học tự nhiên của chúng và các nhóm sắc
tố của chúng. Thể polyhedral hay carboxysome cho phép cố định CO2 trong

6


hệ thống quang hợp và có thể mang ra một cơ quan dự trữ. Các hạt
polyglucan

7


hoặc glycogen hoặc hạt α là những polyme glucose, nhỏ, tròn và khuếch tán
rộng trong thylacoidal. Các hạt lipid, hạt β hoặc hạt osmophile từ cơ quan dự
trữ, được cấu tạo bởi poly-β hydroxybutyrate, chỉ tìm thấy ở trong các tế bào
prokaryote, chúng được coi như là những chất dự trữ năng lượng [14,5].
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng trong tảo xoắn Spirulina
Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao và chứa đầy đủ các vitamin.
Spirulina có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein cao và các chất
có hoạt tính sinh học khác. Giá trị protein trung bình của Spirulina là 65%, cao
hơn so với nhiều loại thực phẩm . Spirulina là nguồn giàu vitamin B12 nhất.
.

Ngoài ra, Spirulina còn chứa các vitamin khác như A, B1, B2, B6, E và H (Fox,
1986). Spirulina cung cấp 21% thiamin và riboflavin so với nhu cầu hàng
ngày.
Các chất màu trong Spirulina: Spirulina có màu xanh lam - lục là do
Spirulina chứa nhiều sắc tố với hàm lượng cao như chlorophyll,

có dạng hình cầu hoặc hình que, Gram dương, không bào tử, không di
động. Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số giống trong họ vi
khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử. Vi khuẩn lactic không khử nitrate,
phản ứng catalase âm tính, kỵ khí tuỳ ý, một vài loài kỵ khí sống trong hệ
tiêu hoá của con người [5].
Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng cao. Để
sinh trưởng bình thường, ngoài nguồn cacbon, chúng cần nitơ, một phần
dưới dạng cacaxit amin, một số vitamin, các chất sinh trưởng, và các chất
khoáng… Chúng không thể phát triển được trong môi trường có thành phần
đơn giản như glucose và NH4+ như một số loài khác. Vì thế người ta phải
cho vào môi trường một số chất giàu dinh dưỡng: cao nấm men, cao thịt,
các loại đường để chúng có thể lên men.
Vi khuẩn lactic có thể tồn tại trong môi trường khô, có thể chịu được
hàm lượng cồn từ 10 - 15% và có thể chịu được nồng độ CO2 cao. Chúng
được tìm thấy khắp nơi trong tự nhiên, dưới da, trong hệ tiêu hoá…
Lactobacillus có vai trò quan trọng nhất trong lên men lactic.
Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí Gram dương, có dạng hình que dài,
không sinh bào tử, tế bào thường xếp đôi hoặc thành chuỗi, không di động.
Chúng là nhóm chính của vi khuẩn axit lactic, hầu hết các chủng của chúng
biến đổi đường lactose và những đường khác thành axit lactic. Chúng là vi
khuẩn rất phổ biến và thường là lành tính. Ở người, chúng có mặt ở âm đạo
và ở ruột. Nhiều loài có ở thực vật đang phân rã. Sự sản xuất axit lactic làm
9


ngăn cản sự phát triển của một vài loài vi khuẩn có hại khác [2], [5].
1.2.2. Vi khuẩn giấm
Vi khuẩn giấm là tác nhân chính của quá trình lên men acetic. Giống
vi khuẩn acetic, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể dễ dàng tìm thấy
các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, giấm,

Nấm men thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩn đơn bào, tế bào nấm men
có thành phần và cấu tạo khá phức tạp gồm thành tế bào, màng nguyên sinh
chất, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ...
Có rất nhiều cách phân loại, nấm men chủ yếu gồm hai lớp là nấm
men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungiimporfecti).
+ Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công
nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; giống
Schizosaccharomyces giống Endomyces.
+ Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) gồm: Crrytococus (toscula,
tornlopsis); Mycoderma; Candida; Rhodotorula.
Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men
tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều cho
đến khi cơ chất của môi trường giảm đến mức thấp nhất thì quá trình sinh
trưởng phát triển của chúng chậm và ngừng hẳn. Các nấm men sinh sản
bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một
thời gian ngắn. Tế bào sẽ già đi khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế
bào không còn khả năng sinh sản nữa. Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản
bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ [13].

11


1.2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nhóm vi sinh vật lên men tạo nước
giải khát từ tảo xoắn Spirulina
1.2.4.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác
nhau. Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên
tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về
một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…
Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử
dụng acid axetic dưới dạng các muối axetat để làm chất đệm cho môi
trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic.
Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát
triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ.
Nhu cầu dinh dưỡng oxi
Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy
và vừa sống được trong môi trường không có oxy. Trong điều kiện hiếu khí
sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong
điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và
H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP.
Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men
Tế bào nấm men có thể sống độc lập. Quá trình sống của chúng gồm
các quá trình dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng và đặc điểm di truyền.
Dinh dưỡng
Dinh dưỡng carbon: các hợp chất hữu cơ khác nhau như các loại đường
và dẫn xuất, rượu, acid hữu cơ, acid amin… có thể là nguồn dinh dưỡng
carbon của nấm men, trong đó nguồn đường là chủ yếu. Nấm men có thể sử
dụng nhiều nguồn đường khác nhau như sucrose, maltose, lactose, glucose…
Dinh dưỡng nitơ: đa số nấm men không đồng hóa được nitrat mà chỉ
có khả năng sử dụng các muối amon ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ
hoặc vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid,
urê, nucleotit… Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat, acetat…

13


Dinh dưỡng các chất sinh trưởng: các vitamin, các purin và prymidin
là nhân tố sinh trưởng cơ bản của nấm men.
1.2.4.2. Quá trình trao đổi chất



Cũng có một số tác giả cho rằng lên men lactic đồng hình tiến hành
theo hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: thời kỳ sinh trưởng cấp số mũ của vi khuẩn, từ hexoza nhờ
sự oxi hoá photphoglyceraldehyde kèm theo việc khử pividinnucleotide
(PN) để tạo acid photphoglyceriaic.
PCH2 - CHOH + H2O + PN

P. CH2CHOG - COOH + PNH2

Giai đoạn 2: do chất nhận hydro là PN - H2 tăng mà thế oxy hoá khử
của môi trường giảm xuống dẫn đến sự nhường hydro từ PN-H2 cho acid
photphoglycerinic để khử nó thành acid lactic.
CH2OP - CHO - COOH + H2O (PN-H2)

CH3CHOHCOOH + H3PO4+PN+

H2O Tuỳ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzym lactate dehydrogenase
và sự có mặt của lactataxemase mà loại acid lactic dạng nào được tạo ra D
(-), L (+) hoặc DL.
Lên men lactic dị hình[1], [2]
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm
acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic,
etanol, acid succinic, CO2,…
Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:
C6H12O6CH3CHOHCOOH+HOOC(CH2)COOH+CH3COOH+C2H5OH+CO2
…
Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%,
rượu etylic và acid acetic 10% các lọai khí 20%.... đôi khi không có các khí