BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Mai Thị Vân Khánh

Tên đề tài:

TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ VI SINH VẬT NHẰM SẢN XUẤT PHÂN VI SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Mai Thị Vân Khánh
Tên đề tài:



Tác giả

Mai Thị Vân Khánh


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Học viện Khoa học và Công
nghệ, Viện Di truyền Nông nghiệp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành khóa học này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thành Đức Viện Di truyền Nông nghiệp và TS. Lê Thị Nhi Công - Viện Công nghệ
sinh học, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin được cảm ơn GS. TS Đỗ Năng Vịnh và tập thể cán bộ
Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào - Viện Di truyền Nông
nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất
- trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Luận văn được sử dụng một phần số liệu và kết quả thuộc chương
trình Nghị định thư với Cộng hòa Liên bang Đức: “Nghiên cứu sản xuất và
ứng dụng một số vật liệu mới (Chất hấp thụ, hạt cải tạo và vải địa kỹ thuật)
từ phế phụ phẩm mía đường và lúa để nâng cao giá trị gia tăng và phục vị
nông nghiệp bền vững”, mã số: NĐT.22.GER/16 do GS.TS. Đỗ Năng Vịnh
làm chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cám ơn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình,
bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho
tôi trong suốt quá trình học tập.
Hà Nội,

tháng

3

(N)

Phân đạm

4

(P)

Phân lân

5

VSVPGL

Vi sinh vật phân giải lân

6

XK

Xạ khuẩn

7

KHC

Ký hiệu chủng


13

Gauze I

Môi trường Gauze bổ sung thêm bột CMC

14

AT

Môi trường nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi
khuẩn chi Azotobacter


iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật phân giải
xenlulo phân lập từ các mẫu đất thu thập ............................................................. 24
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV có khả năng cố định
nitơ........................................................................................................................ 26
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật có khả năng
phân giải lân từ các mẫu đất thu thập ................................................................... 27
Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV ( phân lập trên môi
trường King B) ..................................................................................................... 28
Bảng 3.5. Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng vi sinh vật .............. 30
Bảng 3.6. Khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn phân lập .......................... 32
Bảng 3.7. Đánh giá hoạt tính phân giải lân của các chủng VSV phân lập ....................... 33
Bảng 3.8. Đánh giá hoạt tính sinh IAA sau 48 h của các chủng vi khuẩn phân lập ... 35
Bảng 3.9. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi sinh vật phân giải xenlulo tuyển chọn 37

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH ...... 3
1.1.1. Tình hình nghiên cứu phân bón trong sản xuất nông nghiệp .................. 3
1.1.2. Tình hình sản xuất phân bón trong sản xuất nông nghiệp ........................ 5
1.1.3. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phân bón hữu cơ vi sinh trên thế giới
....................................................................................................................... 7
1.2. NHÓM VI SINH VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI
SINH ................................................................................................................ 10
1.2.1. Vi sinh vật cố định đạm ..................................................................... 10
1.2.2. Vi sinh vật phân giải lân .................................................................... 10
1.2.3. Vi sinh vật phân giải xenlulo ............................................................. 11
1.2.4. Vi sinh vật sinh hocmon sinh trưởng thực vật .................................. 13
1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT ........... 14
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................................... 17
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................... 17
2.2.1. Phân lập và lưu giữ các chủng vi sinh vật từ mẫu đất ....................... 17
2.2.2. Tuyển chọn và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật có
ích................................................................................................................. 17
2.2.3. Định danh chủng vi sinh vật phân giải xenlulo ................................. 17
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 17
2.3.1. Phương pháp phân lập và lưu trữ các chủng vi sinh vật ................... 17


vii

2.3.2. Phương pháp xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams,
1983). ........................................................................................................... 19
2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính cố định nitơ của vi sinh vật ........... 19
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt pho .................. 20

lạc, đậu tương...), riêng mía lượng bã bùn mía sau chế biến đường là rất
lớn, mỗi năm diện tích trồng mía khoảng 257.546 ha, sản lượng ép là 15,76
triệu tấn mía cây, trong sản xuất đường sẽ sinh ra một lượng phế thải khổng
lồ: 2,5 triệu tấn bã mía, 500.000 tấn bã bùn (sau khi đã lấy nước đường) và
250.000 tấn mật rỉ. Trước đây 80% lượng bã mía này được dùng để đốt lò
hơi trong các nhà máy sản xuất đường, sinh ra 50.000 tấn tro và 20% còn
lại (khoảng 500.000 tấn) được dùng làm ván ép, còn mật rỉ dùng sản xuất
cồn, mỳ chính hoặc các công nghệ vi sinh khác như chế biến thành thức ăn
chăn nuôi. Riêng tro, đặc biệt là bã bùn không sử dụng phải đổ bỏ gây ô
nhiễm môi trường nghiêm trọng, vì trong bã bùn mía có chứa một lượng
dinh dưỡng cao như đạm, lân, lưu huỳnh và canxi, nếu được sử dụng làm
nguồn phân hữu cơ thì rất tốt cho cây trồng, đặc biệt là cây mía. Đứng
trước tình hình đó, đã có nhiều giải pháp được đặt ra như sử dụng nguồn
chất thải này làm thức ăn chăn nuôi, nhưng chỉ sử dụng những loại bã mía
sạch, chất lượng tốt nên vẫn chưa giải quyết được bã bùn (nguyên nhân
chính gây hôi thối khi đổ ra ngoài môi trường).
Một giải pháp được coi là khả quan nhất xét cả về mặt kinh tế và môi
trường đó là sử dụng bã bùn mía làm phân hữu cơ vi sinh. Vì giải pháp này
sẽ trả lại một lượng hữu cơ quan trọng cho đất trồng mía. Theo tính toán để
trồng được 250.000 ha mía, ngoài phân bón vô cơ (đạm - lân - kali) tối
thiểu phải bón 4 - 5 tấn phân chuồng cho 1 ha, tức là phải có 1 triệu tấn
phân chuồng bón cho 250.000 ha. Tuy nhiên, để sử dụng hiệu quả bã bùn
mía thì việc xử lý nguyên liệu này bằng các chủng vi sinh vật là rất quan
trọng. Trong chất thải nhà máy mía đường thì thành phần của bã thải là bã
bùn, váng bọt (chiếm 1 - 4% so với cây mía), chất xơ, đường, protein,
lipit,… đây là thành phần rất tốt cho phân hữu cơ vi sinh, việc nghiên cứu,
tuyển chọn vi sinh vật phân giải bã bùn mía là rất cần thiết.
Do vậy, đề tài “Tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính sinh học của
một số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh" được đề xuất thực hiện
nhằm giải quyết được một phần vấn đề có tính cấp thiết, mang tính khoa


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI
SINH
1.1.1. Tình hình nghiên cứu phân bón trong sản xuất nông nghiệp
Hiện nay, các nước đang phát triển có xu hướng sử dụng ngày càng
tăng lượng phân bón hóa học và Việt Nam cũng nằm trong xu thế này. Tuy
nhiên, việc dùng quá nhiều phân đạm (N) tới mức lạm dụng đã làm tăng
dần sự mất cân đối các dưỡng chất trong đất ảnh hưởng đến năng suất và
chất lượng nông sản. Đồng thời dùng lượng N quá cao sẽ gây khó khăn
trong việc bảo quản nông sản cũng như tích lũy NO3- trong rau và các loại
cây thực phẩm sẽ là nguy cơ đe dọa sức khỏe con người và vật nuôi. Ngoài
ra, theo các nhà khoa học thì khí N2O gây hiệu ứng nhà kính lớn hơn khí
CO2 gấp 300 lần. Trong sản xuất nông nghiệp, một lượng đáng kể N bị thất
thoát vào không khí khi bón đạm Ure hoặc Sulphate Amon (SA), gây lãng
phí và gia tăng hiệu ứng nhà kính.
Muốn khai thác có hiệu quả tiềm năng dinh dưỡng của đất trồng nông
nghiệp nhằm hạn chế dần việc bón bổ sung những loại phân hóa học hay
các loại khoáng vô cơ khác, hạn chế tối đa những ảnh hưởng không tốt đến
biến đổi khí hậu mà do chính quá trình sản xuất nông nghiệp gây ra; các
nhà khoa học trong lĩnh vực trồng trọt đã nghiên cứu và cho ra đời một số
công nghệ vi sinh và công nghệ enzyme.
Mặt khác, một số chủng vi sinh còn có vai trò đối kháng với các loài
vi sinh có hại (gây bệnh cho cây), ức chế hoặc tiêu diệt những loại vi sinh
vật này giúp cây phát triển tốt hơn. Có thể ví dụ một số loại vi sinh có lợi
đã được đưa vào công nghệ sản xuất phân bón như: Vi sinh vật cố định
đạm (Rhizobium, Bradyrhizobium), vi sinh vật cố định nitơ tự do (A.
chroococcum, P. tinctorius), vi sinh vật phân giải lân (Pseudomonas sp,
Achromobacter sp, A. polymixa), vi sinh vật kích thích sinh trưởng (E.

phân bón nói chung và phân bón hữu cơ nói riêng chưa được quan tâm đầu
tư đúng mức. Nhìn lại danh mục các nghiên cứu về phân bón thì phần lớn
là quá cũ hoặc chỉ thông qua các dự án hợp tác quốc tế. Trong mười năm
2006-2016 chỉ có 03 đề tài nghiên cứu cấp Bộ có liên quan đến phân bón,
trong đó có 2 đề tài về xử lý phế phụ phẩm và 01 đề tài vi sinh vật. Đối với
đề tài cấp nhà nước, trong thời gian 10 năm kể trên chỉ có 02 đề tài nghiên
cứu cấp nhà nước về lĩnh vực này.
Bên cạnh đó, việc nghiên cứu chưa đi liền với thực tế phát triển ngành
phân bón, chưa phục vụ hiệu quả cho công tác quản lý nhà nước. Hiện tại
vẫn còn thiếu rất nhiều nghiên cứu mang tính bài bản, hệ thống về mối liên
hệ giữa tính chất đất và nhu cầu phân bón đặc thù cho từng loại đất, vùng
đất; về nhu cầu phân bón phù hợp, đặc thù với các loại đất khác nhau, trên


5

các loại cây trồng khác nhau và ở các giai đoạn sinh trưởng phát triển phân
bón mới thì việc đánh giá tác động môi trường và tác động đến sức khỏe
của con người thông qua chất lượng nông sản còn chưa được quan tâm
đúng mức. Chưa có nghiên cứu bài bản, hệ thống nào về hiệu suất sử dụng
phân bón, thất thoát dinh dưỡng và các biện pháp khắc phục. Việc chuyển
giao các tiến bộ kỹ thuật mới thông qua hệ thống khuyến nông để khuyến
khích, hướng dẫn người dân sử dụng phân bón hữu cơ còn hạn chế. Tính
đến thời điểm hiện tại, rất ít dự án khuyến nông về phân bón hữu cơ được
triển khai.
1.1.2. Tình hình sản xuất phân bón trong sản xuất nông nghiệp
Ở Việt Nam phân bón hữu cơ hiện nay được sản xuất trong nước theo
hai phương thức là ủ truyền thống và sản xuất công nghiệp. Phương thức ủ
truyền thống được sử dụng chủ yếu ở quy mô nông hộ dựa trên nguồn
nguyên liệu là chất thải hay các phế phụ phẩm cây trồng thu gom từ chăn

2017 đã có tổng cộng 75 sản phẩm phân bón hữu cơ được xuất khẩu ra
nước ngoài. Trong số đó, chủ yếu là phân bón hữu cơ (42 sản phẩm với
khối lượng xấp xỉ 60.000 tấn), phân bón hữu cơ khoáng (20 sản phẩm với
khối lượng trên 9.500 tấn), phân bón hữu cơ vi sinh (11 sản phẩm với khối
lượng xấp xỉ 6.500 tấn) và một lượng ít phân bón khoáng hữu cơ.
Khối lượng phân bón hữu cơ nhập khẩu trong 3 năm gần đây đều đã
tăng đáng kể. Cụ thể, khối lượng nhập khẩu năm 2017 là khoảng 220.000
tấn, tăng gấp đôi so với năm 2016 (xấp xỉ 102.000 tấn). Trong số đó, phải
kể đến phân bón vi sinh vật, khối lượng nhập hẩu năm 2017 (617 tấn) tăng
gần 5 lần so với năm 2015 (126 tấn) và tăng gần 2 lần so với 2016 (319
tấn). Khối lượng nhập khẩu phân bón hữu cơ sinh học năm 2017 (xấp xỉ
117.000 tấn) tăng gần 8 lần so với năm 2016 (xấp xỉ 15.000 tấn). Đặc biệt,
năm 2017 Việt Nam đã bắt đầu nhập khẩu phân bón hữu cơ cải tạo đất với
khối lượng 105 tấn (Báo cáo: Thực trạng và giáp pháp phát triển phân bón
hữu cơ, 2018).
Thời gian qua, các nhà khoa học trong cả nước đã nghiên cứu và sản
xuất thành công rất nhiều loại phân hữu cơ vi sinh nhằm cải tạo đất và
chăm sóc cây trồng. Kết quả thử nghiệm tại các vùng sản xuất cho thấy, các
sản phẩm phân bón hữu cơ vi sinh này có tác dụng tích cực đến việc nâng
cao năng suất, chất lượng nông sản, đồng thời có tác dụng tăng độ phì
nhiêu đất và bảo vệ môi trường sinh thái. Một số loại phân hữu cơ vi sinh
điển hình như: HUĐAVIL; HN 2000; Omix; Vi sinh tổng hợp Biomic –C;
Phân hữu cơ vi sinh vật chức năng, VTN1; VTN2 và VTN3...v...v....
Phân bón hữu cơ vi sinh đã được nghiên cứu từ lâu, song do yếu tố chủ
quan và khách quan khác nhau nên mức độ ứng dụng cho đến nay vẫn còn
nhiều hạn chế. Đặc biệt, các loại phân chuyên dụng cho từng loại cây còn
rất ít, hơn nữa các loại phân vi sinh này mới chỉ được sản xuất từ một số
loại vi sinh vật và nguyên liệu nhất định (cố định nitơ cộng sinh- Nitragin,



xác, bã cây. Nếu các xác bã thực vật này được hoàn lại cho đất đã canh tác
thì chúng sẽ cung cấp một lượng kali đáng kể cho các cây trồng vụ sau. Các
vùng trồng mía lớn trên thế giới (Ấn Độ, Trung Quốc, Cuba,...) cũng có
cách thức trả lại ngọn lá mía cho đất để làm dinh dưỡng cho vụ sau thông
qua kỹ thuật ủ tạo phân hữu cơ. Van Dillewijn (1952) phân tích thấy bộ
phận ngọn và lá mía chiếm 62% N, 50% P2O5 và 55% K2O trong tổng số


8

của bộ phận thu hoạch. Như vậy có nghĩa 4 nếu trả lại ngọn lá mía bón lại
cho vụ sau thì cung cấp một lượng dinh dưỡng tương đối lớn cho cây (Van
Dillewijn, 1952)[1]. Các nghiên cứu, áp dụng công nghệ EM đạt được kết
quả một cách rộng rãi trong lĩnh vực xử lý môi trường, chế biến thức ăn
chăn nuôi, chế biến phân bón vi sinh cho cây trồng.... Qua các báo cáo
khoa học tại các Hội nghị Quốc tế về công nghệ EM cho thấy công nghệ
EM có thể gia tăng cân bằng sinh quyển, tính đa dạng của đất nông nghiệp,
tăng chất lượng đất, khả năng sinh trưởng, chất lượng sản phẩm nông
nghiệp. Vì thế, các nước trên thế giới đón nhận EM là một giải pháp để
đảm bảo cho một nền nông nghiệp phát triển bền vững và bảo vệ môi
trường. Nhiều nhà máy, xưởng sản xuất EM đã được xây dựng ở nhiều
nước trên thế giới và đã sản xuất được hàng ngàn tấn EM mỗi năm như:
Trung Quốc, Thái Lan (hơn 1000 tấn/năm), Myanmar, Nhật Bản, Brazil
(khoảng 1.200 tấn/năm), Srilanca, Nepal, Indonesia (khoảng 50 - 60
tấn/năm) (Erangelista và Urriza, 1999)[3]. Trong nền nông nghiệp cổ truyền
của các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam và các nước Asian, phân
hữu cơ không chỉ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng với hàm lượng vốn
có của nó mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện các đặc tính
lý hoá học của đất thông qua vai trò của vật chất hữu cơ. Do đó hiện nay
phân hoá học được coi là yếu tố quan trọng để đẩy năng suất cây trồng nên

(chưa qua xử lý cũng như đã xử lý thành phân bón hữu cơ) đến năng suất
cây trồng ở vùng bán khô hạn của Ấn Độ chỉ ra rằng sinh khối tăng 25,3 %
và năng suất hạt tăng 9,2 % so với công thức đối chứng. Ngoài ra sử dụng
phế phụ phẩm còn có thể tiết kiệm được 50% lượng phân hoá học, giảm chi
phí cho người dân trong sản suất (Heman và Singh, 1992)[6]. Nhật Bản
cũng khuyên nông dân trồng chè của mình nên tận dụng nguồn phế phụ
phẩm nông nghiệp làm phân bón hữu cơ cho cây chè để tăng hàm lượng
mùn trong đất (Taton, 2005)[7]. Nguồn Carbon hữu cơ trong đất có thể được
cải thiện trong suốt quá trình bón phân hữu cơ. Từ năm 1992 - 1997, Quỹ
Kellogg, W. K tài trợ thử nghiệm bón phân hữu cơ được bổ sung thêm một
số loài vi sinh vật có ích thuộc 2 chi: Bacillus, Pseudomonas có khả năng
phân giải lân, kali tại 2 vùng trồng chè trọng điểm của Srilanca và nhận
thấy năng suất chè tăng 9 – 14% so với đối chứng có bón phân hữu cơ và
tăng 17% so với đối chứng không sử dụng 2 loại phân bón này (Kellogg,
1997)[8]. Kết quả thí nghiệm của Christian Bruns và Christian Schüler năm
2000 cũng cho thấy nếu phân hữu cơ (làm từ phân người, gia súc và cây
xanh) có bổ sung thêm Bacillus subtilus, Lactobaccillus rhammossus,
Bacillus polymyxa bón cho chè thì chất hòa tan trong chè tăng từ 47,31%
(chỉ bón phân hữu cơ) lên 51,01% (bón phân hữu cơ vi sinh) (Christian
Bruns và Christian Schüler, 2000)[9]. Đã có nhiều biện pháp xử lý rác thải
nông nghiệp như đốt, chôn lấp, ủ phân phân hữu cơ vi sinh. Ở Australia,
Pháp, Indonesia, Malaysia, Miến Điện, Philippine, Tây Ban Nha và Thái
Lan, phụ phẩm nông nghiệp thường được đem đốt. Các nước Mỹ, Đức,
Italia... xử lý bằng cách chôn vùi chiếm 60-80%. Bên cạnh việc sử dụng
nguồn rác thải nông nghiệp để làm nhiên liệu, trong nuôi trồng thủy sản,


10

công nghiệp sản xuất đồ gốm, công nghiệp sản xuất silic...Đa số lượng rác


11

Photpho là nguyên tố quan trọng thứ 2 trong 3 nguyên tố dinh dưỡng đa
lượng chính của cây trồng (N, P,K), là thành phần của axit nucleic, phytin,
photpholipit. Photpho có tác động trực tiếp đến quá trình tích lũy đường,
protein, lipid, vitamin… của cây trồng. Đặt biệt photpho là thành phần
không thể thiếu của ATP, ADP, AMP (phân tử trao đổi năng lượng), kiểm
soát, điều khiển quá trình trao đổi năng lượng của cây (hô hấp, quan hợp..).
Photpho có tác dụng thúc đẩy phát triển và tăng khả năng chống chịu của
cây trồng. Thiếu photpho, sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc
ít phân cành, đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng. Thiếu
photpho, năng suất cây trồng bị giảm sut nghiêm trọng, ngay cả khi được
cung cấp đủ nitơ. Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của photpho trong tự
nhiên diễn ra theo một quy trình khép kín gọi là vòng tuần hoàn của
photpho thông qua 4 quá trình (khoáng hóa, cố định sinh học, cố định hóa
học và phân giải). Theo như các nghiên cứu cây trồng chỉ có thể hấp thu 5 25% lượng lân được bón, số còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc
cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn
cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi. VSV phân giải
lân, VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSM)
là các VSV có khả năng chuyển hóa hợp chất photpho khó tan thành dạng
dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Các VSV phân giải hợp chất photpho khó
tan được biết đến nay là các loài: Pseudomonas, Micrococus, Bacillus,
Flavobacterium, Penicillium, Sclerotium, Aspergillus. Các VSV này không
chỉ phân giải photphat canxi mà cả photphat nhôm, sắt, mangan và các
dạng khác kể cả quặng.
1.2.3. Vi sinh vật phân giải xenlulo
Thủy phân xenlulo bởi enzyme từ vi sinh vật là bước quan trọng trong
chu trình carbon. Mặc dù có một lượng rất lớn xenlulo nhưng chỉ một phần
trăm rất nhỏ vi sinh vật có khả năng phân giải vì sự cứng cáp của thành tế

55 oC, còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 75oC (Rastogi và
cs, 2009)[20].
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm.
Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên. Xạ khuẩn rất
giàu G+C chiếm 57-75 % (Lo và cs, 2002)[21] chúng chiếm ưu thế trong đất
phèn khô (Jeffrey, 2008)[22]. Xạ khuẩn còn được biết đến nhiều bởi các sản
phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh như streptomycin,
gentamicin, rifamycin và erythomycin. Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò
quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng như trong nông nghiệp.
Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản
sinh cellulase được quan tâm nghiên cứu. Một số loài đáng chú ý thuộc
giống này như Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii,


13

Streptomyces lividans (Kluepfel và cs, 1986; Schrempf và Walter, 1995)[.
Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương,
Streptosporangium trong quặng apatit cũng là những loài có khà năng phân
hủy xenlulo (Chang và cs, 2009; Veiga và cs,1983)[23,24].
Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo
những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất
trong lĩnh vực phân hủy xenlulo. Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực
cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi
khuẩn. Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei,
Trichoderma
viride,
penicillium
pinophilum,
Phanerochaete

nếu bổ sung L-tryptophan (L-TRP). Khi không bổ sung L-TRP thì nồng độ
IAA tạo ra chỉ từ 1.1-2,4 mg/1. Các kết quả này đã gây đuợc sụ chú ý lớn.
1.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT
Định danh vi sinh vật cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và các
đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi sinh vật. Đồng thời, phương pháp sinh học
phân tử giải trình tự đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật cũng được tiến hành
để cho kết quả nhanh chóng và chính xác.
Phương pháp truyền thống: Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu
tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình
dạng tế bào. Mặc dù phưomg pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho
thấy không có hiệu quả trong phân loại, nhưng hình thái và đặc điểm cấu
trúc hiển vi vẫn có vai trò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt
là trong việc định danh các chủng mới. Phương pháp truyền thống để định
danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như: đặc điểm hình
thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng. Trong đó các thử nghiệm để
xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất.
Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương thức
truyền thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa
phân loại Prokaryote đầy đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khóa phân loại
Bergey (Bergey ’s Manual of Systematic Bacteriology)[27]. Riêng đối với
nấm men việc định danh theo phương thức truyền thống rất phức tạp. Từ
trước đến nay có rất nhiều khóa phân loại nấm men của nhiều tác giả khác
nhau. Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên. Trong
khóa phân loại này, Hansen chia nấm men thành 8 giống. Sau Hansen,
Klocker (1907), Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh sữa khóa
phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện. Đến năm 1952, J.
Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá hoàn thiện vấn đề


15

một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đơn của acid nucleic
(DNA) được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát
huỳnh quang, dùng đế nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận
diện) của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Phân tích dữ liệu các trình tự


16

ssu rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ cho phép xác định các trình tự
nhận diện chuyên biệt cho từng giới. Một số trình tự nhận diện cho một
nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm chí một giống, một loài
cũng đã được xác định. Trong tương lai, nhiều trình tự tương tự được xác
định và sẽ rất hữu dụng trong việc nhận diện, định danh một vi sinh vật
mới. Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho vi khuẩn có thể được tổng hợp,
đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang và dùng để phát hiện chuyên biệt các
giới này. Các mẫu dò này được gọi là “mẫu dò phát sinh chủng loại”
(phylogenic prode). Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh vật bằng một tác
nhân thích hợp làm tăng tính thấm của màng, cho phép mẫu dò vào bên
trong tế bào, thực hiện phương pháp lai phân tử (lai in-situ, tức là lai trực
tiếp trên tế bào mẫu), và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, người ta
có thể xác định trực tiếp chủng thuần thuộc giới nào hay quần xã vi sinh vật
hiện diện trong một mẫu tự nhiên gồm những giới nào. Kỹ thuật lai và phát
hiện này được gọi là phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH).