ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------***---------

VŨ QUANG THẮNG

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT PROTODIOSCIN
TỪ CÂY BẠCH TẬT LÊ (Tribulus terrestris L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------***---------

VŨ QUANG THẮNG

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT PROTODIOSCIN
TỪ CÂY BẠCH TẬT LÊ (Tribulus terrestris L.)

Chuyên ngành

: Sinh học thực nghiệm

Mã số

: 8420101.14



Vũ Quang Thắng


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 2
1.1. Tổng quan về cây Bạch tật Lê (Tribulus terrestris L.) .................................. 2
1.1.1. Đặc điểm về hình thái, phân loại và phân bố .............................................. 2
1.1.2. Thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lí của cây Bạch Tật Lê ................... 4
1.2. Protodioscin .............................................................................................. 14
1.2.1. Cấu trúc của Protodioscin ........................................................................ 14
1.2.2. Tác dụng dƣợc lí của Protodiscin ............................................................. 15
1.3. Các phƣơng pháp tách chiết các hơp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật. 22
1.3.1. Các phƣơng pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật ............................... 22
1.3.2. Tách chiết Protodioscin ........................................................................... 25
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP................................................. 28
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 28
2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................. 28
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ................................................................... 28
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 29
2.2.1. Phƣơng pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch Tật Lê ............................ 29
2.2.2. Phƣơng pháp lựa chọn phƣơng pháp, nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch
Tật Lê .................................................................................................................... 29
2.2.3. Phƣơng pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch Tật Lê .............. 29
2.2.4. Phƣơng pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin ....................................... 30
2.2.5. Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn định lƣợng protodioscin ....................... 30
2.2.6. Phƣơng pháp thử nghiệm sự thay đổi hormon sinh dục trên chuột ........... 31



Bảng 3.6. Nồng độ các hormon sinh dục ở chuột bình thƣờng và chuột uống chiết
xuất chứa protodioscin từ Bạch Tật Lê .................................................................. 42


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình thái toàn cây và quả Bạch Tật Lê (Tribulus terrestris) ................... ..3
Hình 1.2. Đặc điểm hình thái của cây Bạch Tật Lê (Tribulus terrestris) ................ ..3
Hình 1.3. Các loại khung carbon của saponin spiroston trong Bạch Tật Lê ............ ..6
Hình 1.4. Các loại khung carbon của saponin furostane trong Bạch Tật Lê ............ ..7
Hình 1.5. Một số saponin chính có hoạt tính sinh học tách chiết từ Bạch Tật
Lê............................................................................................................................. ..8
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của flavonoid tách chiết từ Bạch Tật Lê ...................... ..8
Hình 1.7. Cấu trúc của alkaloid tách chiết từ Bạch Tật Lê ..................................... ..9
Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của protodioscin.......................................................... 15
Hình 1.9. Cơ chế hoạt động của protodioscin trong cải thiện chức năng tình dục ... 19
Hình 2.1. Mẫu cây Bạch Tật Lêđƣợc phơi khô và mẫu đã khô ............................... 28
Hình 2.2. Đƣờng chuẩn định lƣợng chất chuẩn protodioscin .................................. 31
Hình 3.1 Sắc ký bản mỏng mẫu cao chiết tổng và phân đoạn: (1) cao A, (2) cao
chiết ethyl acetate, (3) dịch chiết B. Bản mỏng silica gel pha thƣờng, dung môi triển
khai dichloromethane-methanol 1:1 ....................................................................... 38
Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng mẫu cao B (1), cao C (2). Bản mỏng silica gel pha
thƣờng, dung môi triển khai ethyl acetate:cồn 20:1 ................................................ 38
Hình 3.3. Sắc ký đồ UV 210nm của chất chuẩn protodioscin ................................. 39
Hình 3.4. Sắc ký đồ UV 210nm của mẫu Bạch Tật Lê thân lá................................ 39
Hình 3.5. Sắc ký đồ UV 210nm của mẫu Bạch Tật Lê quả .................................... 39
Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của cao D chứa protodioscin ....................................... 40


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
kDa


Hormon GnRH

Gonadotropin Releasing Hormone

DHEA

Dehydroepiandrosterone

DNA

Deoxyribonucleic acid

VietGAP

Vietnamese Good Agricultural Practices

cAMP

Cyclic adenosine monophosphate


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bạch tật lê (Tribulus terrestris) là một loại thảo dƣợc đƣợc trồng quanh năm
ở khu vực Địa Trung Hải và các vùng có khí hậu ấm ở Châu Âu, Châu Á, Mỹ, Châu
Phi và Australia. Từ lâu, loại cây này đã đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền của
Trung Quốc, Ấn Độ, Iraq, Bulgari, Nam Phi và Iran. Bạch tật lê có rất nhiều thành
phần có hoạt chất sinh học nhƣ steroid, saponin, flavonoid, alkaloid, các acid béo
không bão hòa, vitamin, tannin, acid aspartic và acid glutamic. Trong đó saponin
đƣợc coi là thành phần đặc trƣng nhất của cây đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng từ

Phân ngành: Angiospermae
Lớp: Dicotyledonae
Phân lớp: Polypetalae
Dòng: Disciflorae
Bộ: Giraniales
Họ: Zygophyllaceae
Chi: Tribulus
Loài: terrestris Linn [16]
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và phân bố.
Trên thế giới cây Bạch tật lê đƣợc mô tả với các đặc điểm nhƣ sau: Thân thấp
nhỏ, cao 10-60 cm, tối màu. Gốc hình trụ, dài 7-18 cm đƣờng kính 0,3-0,7 cm. Lá
kép mọc đối từ 5 đến 8 cặp hình elip hoặc hình trụ tuy nhiên bất đối xứng. Hoa có
màu vàng. Quả có nhiều hình dạng (tròn, dẹt, năm góc) và thƣờng đƣợc bao phủ
một màu vàng nhạt, có nhiều hạt. Rễ xơ, hình trụ, thƣờng phân nhánh, mang một số
rễ nhỏ và có màu nâu nhạt (Hình 1.1) [16].

2


Hình 1.1. Hình thái toàn cây và quả Bạch tật lê (Tribulus terrestris) [16]
Tại Việt Nam cây Bạch tật lê đƣợc Bùi Đình Thạch và cộng sự (2011) mô tả
với đặc điểm hình thái tƣơng tự: Cây thảo, mọc bò lan, phân nhánh nhiều, có lông
trắng nằm. Lá kép lông chim, mọc đối hoặc gần đối, một to một nhỏ, gồm 5-7 đôi lá
chét bằng nhau; phiến lá dài 5-16 mm, rộng đến 2,5 mm, phủ lông trắng ở mặt dƣới.
Hoa mọc riêng lẻ ở nách lá; lá đài 5; cánh hoa 5, nhỏ ngắn hơn 1 cm, mỏng, màu
vàng, vành xanh, sớm rụng; nhị 10, có 5 dài, 5 ngắn; bầu 5 ô. Quả thƣờng có 5
cạnh có gai, có lông dày, tách thành 5 mảnh vỏ rất cứng, mỗi mảnh mang nhiều hạt.
Mùa hoa tháng 5-7; mùa quả tháng 8-9 (Hình 1.2).

Hình 1.2. Đặc điểm hình thái của cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris) [1]


(121),

isorhamnetin-3-O-p-coumarylglu

(122),

isorhamnetin-3-O-gent-7-O-glu (123), isorham-netin-3-O-gentr-7-O-glu (124) là
favonoid với isorhamnetin là cấu trúc gốc cơ bản.

4


Kaempferol (125), kaempferol-3-O-glu (126), kaemp-ferol-3-O-gent (127),
kaempferol-3-O-rutinoside (128), kaemp-ferol-3-O-gent kaempferol-3-O-gent-7-Oglu (129), tribuloside (130) là favonoid với kaempferol nhƣ cấu trúc gốc cơ bản
(Hình 1.6)
Alkaloid bao gồm:
Tribulusamide C (131), tribulusterine (132), tribulusinA (133), harmine (134),
harman (135), harmmol (136), tribulusimide C (137), terrestriamide (138), N-transcoumaroyltyramine (139), N-trans-cafeoyltyramine (140), terrestribisamide (141) là
những alkaloid chính đƣợc tách từ thân, lá và quả của Bạch tật lê. Các alkaloid của
hạt chủ yếu thuộc nhóm β-carboline alkaloid và amide alkaloid (Hình 1.7).
Nghiên cứu của Kostova về tác dụng hóa học và hoạt tính sinh học của
saponin chỉ ra rằng furostanol và saponin spirostanol của tigogenin, neotigogenin,
gitogenin,

neogitogenin,

hecogenin,

neohecogenin,


7


Hình 1.4. Các loại khung carbon của saponin furostane trong Bạch tật lê [56]

Hình 1.5. Một số saponin chính có hoạt tính sinh học tách chiết từ Bạch tật lê [27].

8


Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của flavonoid tách chiết từ Bạch tật lê [56].

Hình 1.7. Cấu trúc của alkaloid tách chiết từ Bạch tật lê [56].

9


1.1.2.2. Tác dụng dược lí của cây Bạch tật lê.
Bạch tật lê đƣợc sử dụng trong các vị thuốc truyền thống nhƣ thuốc bổ, thuốc
tăng cƣờng sinh lí, thuốc giảm nhẹ co thắt dạ dày, hạ huyết áp và lợi tiểu. Quả Bạch
tật lê khô rất có hiệu quả trong chữa trị hầu hết các rối loạn sinh dục và là một thành
phần quan trọng của Ayurvedic - một loại thuốc đƣợc sử dụng để hỗ trợ chức năng
sinh lí và tiêu hóa cũng nhƣ để loại bỏ độc tố do nƣớc tiểu.
Bạch tật lê đã đƣợc sử dụng trong hàng thế kỷ ở Ayurveda để điều trị chứng
bất lực, bệnh hoa liễu và khiếm khuyết sinh dục. Tại Bulgaria, chúng đƣợc sử dụng
nhƣ một loại thuốc truyền thống để điều trị chứng bất lực. Ngoài tất cả các ứng
dụng này, rễ và quả Bạch tật lê còn đƣợc sử dụng trong điều trị rối loạn tim mạch,
các bệnh về mắt, phục hồi chức năng gan, nhuận tràng, giảm đau, lợi tiểu và làm
thuốc bổ tại Trung Quốc và Ấn Độ [30].


tác

dụng

làm

tăng

chuyển

đổi

testosterone

thành

dehydrotestosterone đồng thời kích thích sản xuất tế bào hồng cầu từ tủy xƣơng
cùng với sự phát triển cơ bắp góp phần cải thiện lƣu thông máu và vận chuyển oxy
dẫn đến sức khoẻ đƣợc cải thiện [5].
Tác động chống hình thành sỏi niệu
Dịch chiết ethanol từ quả cây Bạch tật lê đã đƣợc thử nghiệm trên chuột. Kết
quả cho thấy dịch chiết ethanol đã làm giảm hoạt động của việc hình thành sỏi niệu
thông qua các chỉ số sinh hóa trong nƣớc tiểu, huyết thanh và mô bệnh học. Bàng
quang và đƣờng tiết niệu đƣợc phục hồi phụ thuộc vào lƣợng dịch chiết đƣợc sử
dụng. Một protein mới, có khả năng ngăn chặn hình thành sỏi niệu, bảo vệ tế bào,
khối lƣợng phân tử khoảng 60 kDa đƣợc tách chiết từ Bạch tật lê. Aggarwal đã chỉ
ra tác động của protein này trong việc ức chế sự tích tụ của canxi oxalat (CaOx)
cũng nhƣ bảo vệ tế bào biểu mô thận [7].
Glycolate oxidase (GOX) là một trong những enzyme chính tham gia vào quá

chuột. Ở nồng độ 580 mg/kg của dịch chiết có tác dụng làm giảm cholesterol, lipid
máu, triglyceride và lipoprotein trong máu. Việc dẫn đến tăng lipid máu là do sự có
mặt của các hợp chất phenolic dẫn đến tăng lipoprotein lipase trong cơ và mô [29].
Tuncer đã nghiên cứu tác động của dịch chiết Bạch tật lê ở nồng độ 5.0
mg/kg/ngày trong 8 tuần đối với các mô lipid và mạch của thỏ đƣợc ăn chế độ ăn
giàu cholesterol. Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng làm giảm đáng kể lipid
máu, giảm tổn thƣơng bề mặt tế bào nội mô và sửa chữa một phần các rối loạn nội
mạch do tăng lipid máu [50]. Saponin từ Bạch tật lê cũng đã đƣợc nghiên cứu về
việc phòng ngừa và điều trị tăng lipid máu ở chuột. Việc phòng ngừa hiệu quả đƣợc

12


chứng minh bằng cách giảm mức cholesterol huyết thanh đồng thời cũng làm giảm
cholesterol gan, triglyceride và tăng hoạt tính của superoxide dismutase trong gan.
Tác động trong điều trị rối loạn tim
Bạch tật lê cho thấy hiệu quả đáng kể trong điều trị các bệnh tim khác nhau
nhƣ bệnh mạch vành, nhồi máu cơ tim, xơ cứng động mạch não và di chứng của
khối huyết tắc nghẽn động mạch. Zhang và cộng sự đã đánh giá tác dụng bảo vệ
ngăn ngừa thiếu máu cục bộ/tổn thƣơng tái phát trên chuột của tribulosin từ Bạch
tật lê. Kết quả cho thấy, tribulosin bảo vệ cơ tim chống lại chứng thiếu máu đồng
thời tái tạo máu thông qua hoạt động của protein kinase C. Ngoài ra, tribulosin còn
làm giảm malondialdehyde, transaminase aspartate, creatinekinase, dehydrogenase
lactate và hoạt động apoptosis của cơ tim [55].
Hợp chất saponin trong Bạch tật lê đã đƣợc chứng minh trong việc điều trị
hiệu quả các bệnh tim mạch nhƣ cao huyết áp, bệnh mạch vành, nhồi máu cơ tim,
xơ cứng động mạch não và đọng huyết khối. Dịch chiết methanol có tác động hạ
huyết áp thông qua việc trực tiếp giãn nở cơ trơn động mạch và giãn nở màng tế bào
và bảo vệ các tế bào tim. Đặc biệt, có thể cải thiện chức năng tim sau các cơn đau
tim [43].

Ngoài ra, dịch chiết Bạch tật lê còn ngăn chặn sự phát triển tế bào HepG2 và
gây ra apoptosis thông qua việc ức chế nhân tố tăng cƣờng chuỗi kappa kích hoạt tế
bào B (NF-ĸB). Vì vậy dịch chiết Bạch tật lê có tác dụng chống lại tế bào ung thƣ
gan và chống phóng xạ khi đƣợc sử dụng ở nồng độ 800 mg/kg trong 7 ngày liên
tiếp trƣớc khi chiếu xạ gamma bằng cách ức chế sự suy giảm glutathione do bức xạ
gây ra và giảm oxy hóa lipid trong gan của chuột [33].
Tác động kháng khuẩn
Tất cả các bộ phận (hoa quả, thân, lá và rễ) của Bạch tật lê cho thấy hoạt tính
kháng khuẩn chống lại Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, và Pseudomonas aeruginosa. Quả và lá của Bạch tật lê Ấn Độ đã có tác động
kháng E. coli và S. aureus. Các dịch chiết methanol quả Bạch tật lê đƣợc chứng
minh là có tác động kháng khuẩn tốt đối với cả vi khuẩn gram dƣơng và vi khuẩn

14


gram âm. Trong khi đó, dịch chiết ether, chloroform thể hiện hoạt tính kháng khuẩn
thấp hơn [9].
Nhƣ vậy, Bạch tật lê là một loài thảo dƣợc quý đƣợc sử dụng nhiều trong y
học truyền thống của nhiều quốc gia để chữa trị một số bệnh. Các tác dụng nổi bật
của Bạch tật lê bao gồm: Lợi tiểu, kích thích tình dục, chống trầm cảm, điều hòa
miễn dịch, hạ huyết áp, chống cao huyết áp, chống bệnh đái tháo đƣờng, chống
viêm gan, kháng khuẩn, giảm đau và chống viêm. Tuy nhiên nhiều hợp chất vẫn
còn chƣa đƣợc phát hiện hoặc nghiên cứu về cơ chế sinh học phân tử. Do đó mà các
hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học nên đƣợc tập trung nghiên cứu.
1.2. Protodioscin
1.2.1. Cấu trúc của protodioscin
Protodioscin là một hợp chất saponin steroid đƣợc tìm thấy trong một số loài
thực vật, chủ yếu ở các chi Tribulus họ bá vƣơng (Zygophyllaceae), Trigonella họ
đậu (Fabaceae) và Dioscorea họ củ nâu (Dioscereaceae) đặc biệt là cây Bạch tật lê

tình dục của chuột đực so với nhóm đối chứng. Kết quả cho thấy: Tăng trọng lƣợng
cơ thể (9, 23, và 18% đối với nhóm II, III và IV). Huyết áp (43% và 26% đối với
nhóm III và IV) có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng. Số lƣợng tham gia
hành vi tình dục tăng (27% và 24%). Thời gian quan hệ tăng (19% và 22%) đối với
nhóm III và IV có ý nghĩa thống kê. Giảm thời gian nghỉ giữa các lần quan hệ
(16%, 23%, và 22% đối với nhóm II, III, và IV) và khoảng thời gian giữa các lần
xuất tinh (20% đối với nhóm III) có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng. Từ đó
các tác giả kết luận: Protodioscin có tác dụng tăng trọng lƣợng cơ thể và cải thiện
các thông số hành vi tình dục quan sát đƣợc ở chuột đồng thời chỉ ra sự gia tăng
androgen và giải phóng của oxit nitric từ các dây thần kinh vào trong các thể hang
[22]. Hoạt động tình dục của chuột đƣợc tăng cƣờng bởi protodioscin đƣợc giải
thích thông qua các các cơ chế sau:

16


1) Chuyển đổi trực tiếp thành phần hoạt chất protodioscin trong dịch chiết
Bạch tật lê, cụ thể là, chuyển đổi protodioscin thành de-hydroepiandrosterone
(DHEA) mà trung tâm là sự tác động thần kinh thông qua steroid bởi vì
protodioscin là một hợp chất steroid có cấu trúc phù hợp với dẫn truyền các thông
tin sinh học trong cơ thể.
(2) Tăng lƣợng DHEA dẫn tới tác động kìm hãm axit gamma aminobutyric
(GABA) qua đó hỗ trợ tăng cƣờng chức năng tình dục bởi vì GABA là chất ức chế
tình dục đã đƣợc thử nghiệm trên các mô hình. Lƣợng GABA tăng lên sau khi xuất
tinh, đánh dấu giai đoạn không hoạt động tình dục trên chuột.
3) Tăng mức testosterone và giảm dihydrotestosterone, hai tác động này ảnh
hƣởng lên hệ thần kinh trung ƣơng và thần kinh ngoại biên để kích thích hành vi
tình dục, bởi vì các hormon nam tính đƣợc chỉ ra là để cải thiện ham muốn tình dục
và tăng vận chuyển nito oxide trong các thể hang của thỏ.
4) Điều hòa tổng hợp NO ở vùng trung gian vùng dƣới đồi làm tăng dopamine