BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA TẢO
Haematococcus pluvialis LÊN SỨC ĐỀ KHÁNG CÁ TRA
NUÔI (Pangasianodon hypophthalmus) ĐỐI VỚI BỆNH
GAN THẬN MỦ DO VI KHUẨN (Edwardsiella ictaluri)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. VÕ MINH SƠN
Sinh viên thực hiện
MSSV: 0851110182

: NGÔ THANH PHONG
Lớp: 08DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2012


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là một trong những loài thủy sản

Khảo sát ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis đến khả năng kháng bệnh

-

bệnh gan thận mủ của cá tra nuôi.
-

Khảo sát ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên

cá tra nuôi thông qua các thông số miễn dịch
 Hoạt động thực bào (Phagocyte activity)
 Sản sinh O2- (Superoxide anion production)
 Hoạt tính lysozyme (Lysozyme activity assay)

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Tổng quan Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

2.1.1 Giới thiệu chung Cá tra
2.1.1.1 Phân bố
Cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt có giá trị
kinh tế cao, được nuôi phổ biến ở một số quốc gia như: Việt Nam, Lào, Thái Lan,
Campuchia…Ở Việt Nam đối tượng này được nuôi với quy mô công nghiệp ở một số
tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền

trong ao, cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn: mùn bã hữu cơ, cám, rau,
động vật đáy, thức ăn hỗn hợp.
Trong tự nhiên, cá tra có thể sống trên 20 năm. Tuổi thành thục của cá tra từ 3 4 năm. Vào mùa thành thục từ tháng 4 trở đi cá có tập tính bơi ngược dòng di cư tìm
đến các bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh dục
và đẻ trứng. Vì vậy, cá không đẻ tự nhiên ở phần sông MêKông của Việt Nam. Bãi đẻ
của cá nằm ở khu vực từ địa phận Cratie của Campuchia trở lên. Tại các bãi đẻ, cá bố
mẹ đẻ trứng thụ tinh tự nhiên, trứng dính vào cây cỏ thủy tinh ven bờ. Sau khi nở, cá
bột trôi theo dòng nước về hạ lưu đến các vùng ngập nước ở Campuchia và xuôi dòng
theo sông MêKông về phía Việt Nam (Phạm Văn Khánh và ctv, 2011).
2.1.3 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có hệ thống sông rạch chằng chịt, là điều
kiện thuận lợi cho việc phát triển nông nghiệp và đánh bắt thủy sản. Từ năm 1940 nghề
nuôi cá nước ngọt bắt đầu phổ biến và phát triển. Trong đó, cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) và cá basa (Pangasius bocourti) là loài nuôi trồng thủy sản được nuôi
thông dụng nhất đang đươc phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh ĐBSCL (chủ yếu ở
2 tỉnh An Giang và Đồng Tháp). Đến nay, cá tra đã được nuôi ở hầu hết các tỉnh thành
như Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang
(Tạp chí thủy sản, 2012).

4


Đồ án tốt nghiệp

2.1.4 Một số bệnh thường gặp trên cá tra
 Bệnh đốm đỏ
Tác nhân gây bệnh
Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễn trùng máu, bệnh sởi... Là bệnh
do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra. Ngoài ra, một số trường hợp phân lập được
vi khuẩn A. sobria, A. caviae hoặc Pseudomonas sp trên cá bị bệnh đốm đỏ.

2005).
 Bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra
Tác nhân gây bệnh
Tác nhân chính gây bệnh được xác định là Edwardsiella ictaluri (Crumlish và
ctv, 2002).
Dấu hiệu bệnh
Dấu hiệu bên ngoài: Cá bệnh nổi trên mặt nước , bơi lờ đờ cặp mé, màu sắc nhợt
nhạt nhưng chỉ có dấu hiệu giảm ăn trong một thời gian ngắn sau đó ăn trở lại bình
thường. Trên cơ thể có những đốm xuất huyết ở mõm, các gốc vi, nắp mang, hậu môn,
mang màu sắc nhạt, bụng chướng to, đôi khi có những hiện tượng mắt lồi (Nguyễn Thị
Thúy Liễu và ctv, 2008).
Dấu hiệu bên trong: Cá bệnh dạ dày trướng hơi, mạch máu trương to, gan màu
sắc nhạt, thận sưng, có dịch lỏng hơi đỏ bên trong xoang nội quan. Trên gan, thận, tỳ
tạng có những đốm nhỏ màu trắng đục kích cỡ không đều (đường kính khoảng 1-3
mm). Đôi khi có hiện tượng nhũng thận ở cá bệnh nặng. Cá mới chớm bệnh chỉ thấy
xuất hiện những đốm trắng trên thận (Nguyễn Thị Thúy Liễu và ctv, 2008).
Theo Bùi Quang Tề và ctv (2006) cá bệnh còn có dấu hiệu bụng trương to, xuất
huyết gốc vây, mắt lồi, xung quanh miệng xuất hiện các đốm xuất huyết.
Tình hình bệnh gan thận mủ trên cá tra
Bệnh xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở một số vùng nuôi cá tra thâm
canh trọng điểm như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó lan rộng ra hầu hết các
tỉnh ĐBSCL trong thời gian gần đây (Từ Thanh Dung và ctv, 2009).
Bệnh xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá tra, tập trung ở giai
đoạn cá giống và cá thịt có khối lượng nhỏ hơn 300 gram. Bệnh có thể gây chết tích

6


Đồ án tốt nghiệp


tốt trên môi trường thạch máu, BHI, nhiệt độ thích hợp ở 28 - 300C, pH 6 - 7 (Holt và
ctv, 1994)

7


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.1: Bảng thử nghiệm sinh hóa của Edwardsiella ictaluri (Holt và ctv, 1994)
Thử nghiệm sinh hóa

Kết quả

Indol

-

Methyl red

-

Simmons Citrate

-

H2S

-

Lysine decarboxylase

-

Melblose

-

L-Rhamnose

-

D-Sorbitol

-

Trehalose

-

D-Xylose

-

ONPG

-

Chú thích: D (Depend): phụ thuộc tùy từng nơi mà có kết quả dương hoặc âm.

8




Đồ án tốt nghiệp

2.2.4 Mùa vụ xuất hiện bệnh và mức độ gây thiệt hại
Bệnh thường xuất hiện trên cá tra ở các mô hình nuôi thâm canh trong điều kiện
môi trường bất lợi. Theo Plumb (1999) khả năng gây bệnh của E. ictaluri trên cá nheo
Mỹ tùy theo điều kiện nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là từ 1828oC.
Ở nước ta nhiệt độ nước dao động là từ 26-28 oC vì thế đây là điều kiện thuận
lợi cho vi khuẩn E. ictaluri phát triển. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) bệnh mủ
gan thường xuất hiện vào mùa lũ và cao điểm từ tháng 7, 8. Cũng theo Lê Thị Bé Năm
(2002) bệnh xuất hiện vào mùa lũ trong năm khi nước mang nhiều phù sa, chất lượng
nước biến động, cá dễ bị sốc, sức khỏe giảm, giảm khả năng đề kháng với bệnh, chính
vì thế bệnh dễ dàng bộc phát. Tuy nhiên trong 2 năm gần đây, bệnh này hầu như xuất
hiện trên cá tra quanh năm. Trong 1 vụ nuôi, bệnh mủ gan có thể xuất hiện 3 – 4 lần.
Tỉ lệ hao hụt từ 10 – 50%, tùy thuộc vào chế độ chăm sóc và quản lý.
2.3

Tổng quan tảo Haematococcus pluvialis

2.3.1 Phân loại
Ngành: Chlorophyta
Lớp: Chlorophyceae
Bộ: Volvocales
Họ: Haematococcaceae
Giống: Haemotococcus
Loài: Pluvialis
(Lorenz và Cysewski, 2000)
Hình 2.4: Haematococcus pluvialis [49]


độ sinh trưởng rất chậm, chu trình sống phức tạp, chuyển qua nhiều giai đoạn khác
nhau, xen kẽ giữa các tế bào chuyển động và không chuyển động…Mặc khác, để sản
xuất astaxanthin một cách có hiệu quả từ tảo H.pluvialis đòi hỏi qui trình công nghệ
nuôi cấy 2 pha: pha đầu tảo được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu, các tế bào chủ yếu là
pha sinh dưỡng, có màu xanh. Sau khi đạt mật độ nhất định, tảo được chuyển sang nuôi
cấy ở pha thứ 2 bất lợi về điều kiện môi trường như đói dinh dưỡng (nito hoặc
photpho), nhiệt độ hay cường độ chiếu sáng cao… Lúc này tế bào tảo từ màu xanh
chuyển sang dạng nang bào, màu đỏ chứa chủ yếu astaxanthin (Đặng Diễm Hồng và
ctv, 2010).
2.3.3 Ứng dụng tảo Haematococcus pluvialis
Từ những năm 1930, tảo H.pluvialis đã được biết đến rộng rãi là nguồn cung
cấp astaxanthin tự nhiên. Trong những năm gần đây, loài tảo này lại thu hút sự quan
tâm nghiên cứu do nhu cầu sử dụng astaxanthin ngày càng cao. Nhiều vi sinh vật như
nấm, địa y, vi khuẩn, vi tảo, khác cũng có khả năng tổng hợp astaxanthin nhưng hàm
lượng astaxanthin ở tảo H.pluvialis là cao nhất. Astaxanthin được sử dụng bổ sung vào
thức ăn cho một số đối tượng nuôi trồng thủy sản như cá hồi, tôm hùm… nhằm tăng
chất lượng thịt hoặc tạo màu sắc rực rỡ cho cá cảnh. Astaxanthin được tách chiết từ tảo
còn được bổ sung vào các loại sản phẩm mỹ phẩm, dược phẩm cho con người (Đặng
Diễm Hồng và ctv, 2010).
Tảo H.pluvialis được ứng dụng như một sắc tố ứng dụng trong nuôi trồng thủy
sản. Ngoài ra nó còn có khả năng như một chất chống oxi hóa, tiền vitamin A, tăng
cường miễn dịch, tiền thân hormone, sinh sản và phát triển (Lorenz và ctv, 2000).

12


Đồ án tốt nghiệp

2.3.4 Astaxanthin
2.3.4.1 Đặc điểm


Nấm Phaffia

8.000

Haematococcus pluvialis

40.000

Trong tự nhiên, thực vật, nấm, vi khuẩn, tảo đặc biệt sản xuất astaxanthin. Sắc
tố này thông qua chuỗi thức ăn như vi tảo được tiêu thụ bởi động vật phù du và động
vật giáp xác khác sau đó được tiêu thụ bởi cá. Một số loài động vật giáp xác (Penaeus
japonicus và Penaeus monodon) có khả năng tiết ra enzyme để phân giải carotenoid
thành astaxanthin (Lorenz và ctv, 2000).
13


Đồ án tốt nghiệp

Astaxanthin có mối liên hệ chặt chẽ với các carotenoid khác như: β - carotene,
zeaxanthin và lutein. Sự hiện diện của hydroxyl và keto kết thúc trên mỗi vòng ionone
giải thích khả năng este hóa, chống oxi hóa cao hơn, khả năng phân cực cao hơn các
carotenoid khác. Astaxanthin tự do đặc biệt nhạy cảm với quá trình oxy hóa (Guerin
và ctv, 2003).
Astaxanthin rất được quan tâm nghiên cứu bởi nó được phát hiện có hoạt tính
chống oxi hóa mạnh hơn β-caroten, lycopen, lutein hay vitamin E. Một số nghiên cứu
khác chứng minh astaxanthin còn có khả năng chống oxi hóa mạnh hơn cả tocopherol
(Higuera–ciapara và ctv, 2006). Astaxanthin còn được xem như là chất có khả năng
chống oxy hóa cao gấp 10 lần so với các chất chống oxy hóa khác như zeaxanthin,
lutein, canthaxanthin, β–carotenoid, và gấp 500 lần so với α-tocopherol. Một ứng dụng


2.3.4.3 Vai trò Astaxanthin
 Chất chống oxy hóa
Carotenoid là chất chống oxy hóa mạnh có thể hấp thụ năng lượng kích thích
oxi nguyên tử vào trong chuỗi carotenoid ngăn chặn các phân tử hoặc các mô bị hư
hỏng. Astaxanthin bảo vệ màng photpholipid và các acid béo chống lại quá trình
peroxy hóa. Đặc tính chống oxi hóa của astaxanthin có một vai trò quan trọng bảo vệ
chống tia cực tím, ung thư, nhiễm trùng Helicobacter pylorri gây viêm loét (Guerin và
ctv, 2003).
Carotenoid là chất chống oxi hóa cực kì hiệu quả, nó có khả năng loại bỏ các
gốc tự do bằng các phản ứng lại với chúng để tạo ra các sản phẩm vô hại hoặc bằng các
phá vỡ các gốc tự do của phản ứng dây chuyền (Dutta và ctv, 2005).
Các chất chống oxi hóa có thể làm giảm nguy cơ gây đột biến còn đối với các tế
bào ung thư thì ngăn chặn các tế bào phân chia liên tục. Trong tế bào người có một
mảng nội sinh chất chống oxi hóa như catalase, superoxide dismutase. Tuy nhiên, các
chất ngoại sinh cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chống oxi hóa được bổ sung
vào cơ thể thông qua chế độ ăn như ascorbic acid (vitamin C), α-tocopherol (vitamin
E), carotenoid (Dore và ctv, 2008).
Astaxanthin bảo vệ tế bào chống lại quá trình oxi hóa thông qua cơ chế
 Ngăn chặn các oxi nguyên tử và tiêu hao năng lượng dưới dạng nhiệt.
 Phá vỡ các phản ứng dây chuyền của peroxide (Lorenz và ctv, 2000).
 Tăng cường hệ miễn dịch
Astaxanthin được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản như là chất bổ sung
vào thức ăn. Astaxanthin không chỉ dùng để cung cấp sắc tố cho cá mà còn giúp tăng
sức đề kháng và khả năng sinh sản (Cysewski and Lorenz, 2004).
Một yếu tố quan trọng khác trong hệ thống miễn dịch chính là T-helper (tế bào
Th) mà chủ yếu là kích hoạt tế bào kháng nguyên. Astaxanthin kích thích việc sản sinh
tế bào T-heper kháng thể. Trong các thí nghiệm nuôi cấy tế bào, astaxanthin kích thích

16

(Kamath, 2007)
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về sự an toàn của astaxanthin vào chế độ ăn nhưng
nó ít được biết về khả năng chuyển hóa carotenoid trong cơ thể con người. Sự chuyển
hóa các carotenoid ở động vật có vú có liên quan đến một vài các yếu tố sau: sự vận
chuyển của các mixen lipid trong ruột non, sự hấp thu bởi các tế bào niên mạc ruột vận
chuyển đến hệ thống bạch huyết và cuối cùng là sự lắng đọng của các carotenoid
chuyển hóa cụ thể đến các mô. Quá trình hấp thụ và chuyển hóa astaxanthin khá tốt
được nghiên cứu nhiều ở chim, cá, động vật giáp xác. Nhưng chỉ có một vài nghiên
cứu đề cập đến sự hấp thụ trên người và 1 vài động vật có vú khác. Trong tế bào gan

18


Đồ án tốt nghiệp

chuột, astaxanthin được chuyển hóa ở 2 dạng hợp chất: 3-hydroxy-4-oxo-β-ionone và
3-hydroxy-4-oxo-7,8-dihydro- β-ionone. (Dore và ctv, 2008).
2.3.6 Ứng dụng astaxanthin trong nuôi trồng thủy sản
Astaxanthin hay beta-carotene (100 - 200 mg/kg thức ăn) từ tảo Dunaliella
salina và red yeast Phaffia rhodozyma có khả năng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên
của cá hồi rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) (Amar và ctv, 2004). Cùng
tác giả (Amar và ctv 2000, Amar và ctv, 2001) nghiên cứu sử dụng β - carotene và
astaxanthin tổng hợp có khả năng làm tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên trên cá hồi
(Rainbout trout).

19


Đồ án tốt nghiệp



Hình 3.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluria trên môi trường thạch máu

21


Đồ án tốt nghiệp

3.1.2 Môi trường và hóa chất
Môi trường
Blood agar (BA)
Brain Heart Infusion Broth (BHI broth)
Hóa chất
Cồn; NaCl; H2SO4, NaOH, KOH
L-fifteen (Sigma)
Dung dich PBS
Dịch lòng trắng trứng gà
Đệm natriphosphat
Dịch huyền phù vi khuẩn Micrococcus luteus
Dung dịch poly-L-lysine
Zymosan (Sigma)
Nitroblue tretrazolium (NBT)
McHBSS
Dimethylsulfoxide (DMSO)
Thuốc nhuộm fluorescent latex
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ
Tủ cấy vô trùng (Microflow).
Máy lắc (Orbital incubator SI 50).
Máy li tâm lạnh (Hermle)
Tủ sấy (Memmert).

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
3.2.1.1 Chuẩn bị thức ăn
Chuẩn bị thức ăn cho cá: cân thức ăn Green fish cho vào 4 hủ mỗi hủ 172,8 gam.
Sinh khối tảo đem đi pha loãng ở 2 nồng độ: 100 mg và 200 mg
Bảng 3.1 Mật độ tảo và khối lượng tảo cân trộn vào thức ăn
Nghiệm thức

NT 100 mg/kg
NT 200 mg/kg

Nồng độ tảo

Khối lượng thức ăn

Khối lượng tảo

(mg/kg)

(gram)

(gram)

100

170

0.864

200