ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
**********

HOÀNG THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP
ĐỂ CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ
Clonorchis sinensis TRÊN NGƢỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
**********

HOÀNG THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT LAMP
ĐỂ CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ
Clonorchis sinensis TRÊN NGƢỜI

Chuyên ngành

: Sinh học thực nghiệm

Mã số


Tôi vô cùng biết ơn gia đình và những người bạn thân thiết đãđộng viên, chia
sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn
này.
Xin chân thành cảm ơn.

Hoàng Thị Hạnh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3
1.1. Bệnh sán lá gan nhỏ ...........................................................................................3
1.1.1. Các triệu chứng lâm sàng ...............................................................................3
1.1.2. Các phƣơng pháp chẩn đoán[1] .....................................................................3
1.2. Đặc điểm phân loại, hình thái của sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis .........4
1.2.1. Phân loại ...........................................................................................................4
1.2.2. Hình thái sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis ...............................................4
1.3. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ...............................................................5
1.4. Một số đặc điểm di truyền phân tử của sán lá gan nhỏ sử dụng trong giám
định loài ......................................................................................................................6
1.4.1.DNA ribosome(rDNA)trong hệ gen nhân ......................................................6
1.4.2. Hệ gen ty thể mtDNA ......................................................................................7
1.5. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới và Việt Nam .........................8
1.5.1 Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới .............................................8
1.5.2. Thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở Việt Nam ...........................................10
1.6. Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sán lá gan nhỏ......................................10
1.6.1. Xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trong phân hoặc dịch tá tràng ......10
1.6.2. Các xét nghiệm miễn dịch.............................................................................11

3.2.2. Kết quả thiết lập bộ mẫu sử dụng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của
kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis ........................................49
3.2.3. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật LAMP phát hiện
C. sinensis trên ngƣời ..............................................................................................51
KẾT LUẬN ..............................................................................................................54
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................56


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình thể, cấu tạo sán lá gan nhỏ C. sinensistrưởng thành ..........................5
Hình 1.2. Sán lá gan nhỏ và trứng sán lá gan nhỏ ......................................................5
Hình 1.3. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ .........................................................6
Hình 1.4. Minh họa rTU eukaryote ............................................................................6
Hình 1.5. Bộ gen ty thể của sán lá gan nhỏ ................................................................8
Hình 1.6. Sơ đồ mô tả quá trình phản ứng LAMP ....................................................14
Hình 1.7. Đánh giá kết quả LAMP ...........................................................................15
Hình 1.8. Sơ đồ quy trình thực hiện kỹ thuật LAMP ...............................................16
Hình 3.1.Kết quả tìm kiếm trình tự gen nad1 của C. sinensis trên NCBI ................32
Hình 3.2. Ảnh phân tích gióng hàng 24 trình tự gen nad1 của C. sinensis bằng phần
mềm Bioedit v.2.6.7 ..................................................................................................33
Hình 3.3. Ảnh điện di kết quả thử nghiệm các mồi LAMP thiết kế dựa trên khả năng
tổng hợp ADN ...........................................................................................................35
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F3/B3 của C. sinensis ...............36
Hình 3.5. Ảnh giản đồ trình tự ADN của đoạn gen nad1 được nhân bản với cặp mồi
CS-Nad1-F3/B3 với mẫu C. sinnensis tại Ninh Bình ...............................................36
Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CS-Nad1-F3/B3 trên các mẫu thử
nghiệm là ADN của một số loài giun, sán. ...............................................................37
Hình 3.7. Ảnh điện di kết quả khảo sát nhiệt độ ủ của phản ứng LAMP .................38
L: Ladder 100 bp .......................................................................................................38


Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Basic Local Alignment

Công cụ tìm kiếm, đối chiếu nội

Search Tool

bộ cơ bản trên NICB

bp

Base pairs

Cặp bazơ

Ct

Threshold Cycle

Chu kỳ ngưỡng

DNA

Deoxyribonucleic Acid


NADH dehydrogenase

NADH dehydrogenase subunit 1

subunit 1
NCBI

National Center for

Trung tâm thông tin công nghệ

Biotechnology Information

sinh học quốc gia Mỹ

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

rTU

Ribosomal transcriptome

Đơn vị phiên mã Ribosome

unit
RNA

Theo ước tính trên thế giới số người mắc sán lá gan nhỏ khoảng 45 triệu
người, số người có nguy cơ mắc khoảng hơn 600 triệu [13]. Tại Việt Nam đã phát
hiện được hai loài sán lá gan nhỏ là Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini
với hai vùng dịch tễ rõ rệt. Loài C.sinensis lưu hành cao ở vùng đồng bằng Bắc bộ
như Nam Định, Hoà Bình, Ninh Bình 20-30%. Trong khi đó loài sán lá gan nhỏ O.
viverrini lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam như Phú Yên có tỷ lệ nhiễm 36,9%,
ình Định 11,9%, Đăk Lăk 7,6%, Đà Nẵng 0,3%, Quảng Nam 4,6%, Khánh Hoà
1,4% [9].
Sán lá gan nhỏ ký sinh gây tổn thương gan, lách, tụy. Nhiễm sán lá gan nhỏ
gây tăng sinh tổ chức xơ trong gan, ống mật có thể dày lên và có khi gấp 2-3 lần
bình thường; ống tụy có thể dày; lách có khi sưng to và xơ hóa; đặc biệt nhiễm sán
lá gan nhỏ kéo dài sẽ ảnh hưởng đến chức năng gan, dẫn đến xơ gan, có thể gây ung
thư đường mật và gây tử vong [2], [13].
Tuy nhiên, từ khi nhiễm sán lá gan nhỏ đến khi xuất hiện các triệu chứng
bệnh lý là một khoảng thời gian dài không có triệu chứng lâm sàng hoặc các triệu
chứng không đặc hiệu. Do không biểu hiện rầm rộ như những bệnh khác nên dễ bị
lãng quên, ít được quan tâm. Thậm trí cho đến khi triệu chứng tổn thương gan đã rõ,
nhiều bác sĩ lâm sàng vẫn không nghĩ đến nguyên nhân là do sán lá gan nhỏ. Vì
vậy, việc chẩn đoán xác định bệnh sán lá gan nhỏ cần dựa vào các xét nghiệm cận
lâm sàng [19], [46].
Xét nghiệm tìm thấy trứng sán trong phân hoặc dịch tá tràng bằng phương
pháp Kato- atz được WHO (1994) đưa ra như là tiêu chuẩn vàng chẩn đoán xác

1


định. Mặc dù vậy, tùy vào giai đoạn nhiễm và mức độ đào thải trứng qua phân mà
xét nghiệm trứng trong phân có thể bỏ sót, không phát hiện được, độ nhạy không
cao (chỉ khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của kỹ thuật
viên, dễ nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan nhỏ và với trứng của sán lá ruột

Kato- atz để phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ, hiện chưa có nghiên cứu nào về ứng
dụng kỹ thuật LAMP phát hiện sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người. Do
vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP để
chẩn đoán xác định nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên người” với mục
tiêu:
1. Thiết lập quy trình kỹ thuật LAMP để phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ
Clonorchis sinensis trên người.
2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của quy trình kỹ thuật LAMP trong xác định
sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên mẫu phân thu thập từ người bệnh.

2


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh sán lá gan nhỏ
Bệnh sán lá gan nhỏ là bệnh mắc phải do nhiễm sán lá gan nhỏ thuộc chi
Clonorchis và Opisthorchis. Trên thế giới, có 3 loài sán lá gan nhỏ gây bệnh ở
người là Clonorchis sinensis; Opisthorchis viverrini; Opisthorchis felineus.Ở Việt
Nam, bệnh do hai loài sán Clonorchis sinensis hoặc Opisthorchis viverrini ký sinh
trong đường mật gây nên [2].
1.1.1. Các triệu chứng lâm sàng
Giai đoạn mới nhiễm
Người bệnh thường không có triệu chứng rõ rệt, một số trường hợp có rối
loạn tiêu hoá, ăn chậm tiêu, mệt mỏi.
Giai đoạn phát bệnh
Người bệnh có thể có một trong số các triệu chứng như rối loạn tiêu hoá, đau
tức hạ sườn phải và vùng gan, đôi khi có cơn đau gan điển hình và kèm theo vàng
da, nước tiểu vàng. Một số trường hợp người bệnh bị xạm da, gan có thể sưng to
dưới bờ sườn với mật độ mềm, mặt nhẵn và tiến triển chậm, lúc này có thể đau
điểm túi mật, viêm đường mật hoặc viêm tụy.

Ngành:

Platyhelminthes (Claus, 1887)

Lớp:

Trematoda (Rudolphi, 1808)

Bộ:

Opisthorchiida (La Rue, 1957)

Họ:

Opisthorchiidae (Looss, 1899)

Chi:

Clonorchis (Looss,1907)

Loài:

sinensis (Looss,1907)

1.2.2. Hình thái sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis
1.2.2.1. Sán trưởng thành
Con sán hình chiếc lá nhỏ (bằng hạt thóc lép) dài 10 - 20 mm, rộng 2 - 4 mm,
có 2 mồm hút (hấp khẩu). Sán lưỡng tính có nghĩa là trên một con sán có 2 bộ phận
sinh dục đực và cái, dựa vào hình dạng tinh hoàn người ta xác định loài của sán.
Clonorchis sinensis có tinh hoàn phân nhánh, khác với loài Opisthorchis viverrini

đoán phân tử và nghiên cứu hệ thống, phát sinh gen. Một rTU của ba vùng mã hóa
bao gồm các gen: 18S, 5.8S và 28S được phân tách bằng hai vùng giao gen (ITS1
và ITS2) [27], [29] (Hình 1.4). Vùng ITS1 và ITS2 thường được sử dụng trong
giám định sán lá gan nhỏ [27].

Hình 1.4. Minh họa rTU eukaryote [44]

6


Đoạn gen của rDNA chứa các vùng 18S, 5.8S và 28S tạo thành một cụm lặp
đi lặp lại song song. NTS: không được phiên mã spacer, ETS: spacer sao chép bên
ngoài, ITS: spacers phiên mã nội bộ 1 và 2, được đánh số từ 5’ kết thúc [44].
- Các đoạn gen ITS (internal transcribed spacer) nằm trên RNA ribosome, là
một đoạn gen không chức năng (không mã hóa) nằm giữa các tiểu đơn vị lớn (28S)
và tiểu đơn vị nhỏ (18S) [12].
+ ITS gồm ITS1 và ITS2 ngăn cách bởi vùng gen rRNA 5,8S. Đây là khu
vực điển hình được bảo tồn tương đối trong một loài hoặc một chi, do vậy rất hữu
ích để xác định ranh giới loài [36].
+ Vùng ITS1 có khả năng bảo tồn cao hơn vùng ITS2.

ên cạnh đó, vùng

đầu 5’ của ITS1 có độ biến thiên cao hơn vùng đầu 3’, điều này cho phép phân biệt
giữa các loài. Tuy nhiên, hạn chế của việc sử dụng ITS1 trong những nghiên cứu
sinh học phân tử là sự hiện diện của các đoạn trình tự lặp lại. Hầu hết vùng ITS1 có
cấu trúc gồm 3 yếu tố lặp lại: một là tại đầu ngắn 5’; hai là tại đầu 3’; ba là bên
trong vùng ITS1 chứa ít nhất 2 đoạn lặp. Do vậy, số lượng các bản sao của vùng lặp
lại xuất hiện rất khác nhau khi nghiên cứu giữa các loài và trong cùng 1 họ.
+ Vùng ITS2 chứa nhiều vị trí biến đổi hơn ITS1 và không chứa các yếu tố

Bệnh phân bố ở phía Đông từ Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc (trừ Tây
Nam), Đài Loan và miền Bắc của Việt Nam. Năm 1947, Stoll thông báo có 19 triệu
người bị nhiễm sán lá gan nhỏ Clonorchis.

8


Tại Nhật:Từ năm1886-1898, tỷ lệ nhiễm sán lá gannhỏ là 30-67% dọc sông
Ton, hồ asumigaura, đồng bằng Nobi, Aichi và Gifu, vùng hồ Biwa, sông Onga và
sông Chigugo. Năm 1963 có nơi tỷ lệ nhiễm là 40-50%.
Tại Triều Tiên và Hàn Quốc: Trường hợp C. sinensis đầu tiên được công bố
năm 1915 (Matsumoto). Seo và cộng sự (1958) công bố tỷ lệ nhiễm 11,7%, năm
1969 tỉ lệ nhiễm 4,7% bằng xét nghiệm phân Kato. Tỷ lệ nhiễm 11,1-21,1% bằng
test trong da[40]. Bằng test trong da với kháng nguyên C. sinensis xét nghiệm ở học
sinh tiểu học sống dọc sông lớn như sông Han, sông Nakdong, sông

uno, sông

Yeongsan và sông Mangyong và trên 4.676 giáo viên có tỷ lệ dương tính 11,1%.
Tại sông Nakdong gần Pusan miền Đông Hàn Quốc tỷ lệ nhiễm tới 82,9%, ở làng
imhae Gun có cường độ nhiễm 10.698 trứng/gram phân trong số 284 trường hợp
[21]. Gần đây Seo và cộng sự (1981) xét nghiệm phân 13.373 người, tỷ lệ nhiễm
trung bình là 21,5% trong đó cao nhất ở sông Nakdong (40,2%) và thấp nhất ở sông
Mangyong (8%) ước tính có 830.000 - 890.000 người trong số 4 triệu người trong
vùng lưu hành bệnh [21]
Tại Trung Quốc: C. sinensis phân bố ở hầu hết các vùng ở Trung Quốc, trừ
vùng Tây - Nam. Miền Nam Trung Quốc, đặc biệt ở tỉnh Quảng Đông tỷ lệ nhiễm
trên 40%, có làng nhiễm 100% [30]. Bệnh phân bố ở ít nhất 21 tỉnh của Trung Quốc
với tỷ lệ nhiễm từ 0,08-57%, nhiều vùng nhiễm trên 5% (Xu Long Qi, 2004) [30]
Tại Đài Loan: Trường hợp đầu tiên C. sinensis được phát hiện năm 1915

loài sán lá gan nhỏ và với trứng của sán lá ruột nhỏ [25]. Với các kỹ thuật PCR, real
time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini hay C. sinensis cho độ nhạy và
độ đặc hiệu cao [19], [20] nhưng chưa được áp dụng rộng rãi do giá thành cao, kỹ
thuật phức tạp [11]. Đặc biệt khó triển khai ở vùng sâu vùng xa. Đây là những thông
tin quan trọng và là cơ sở khoa học cho tính khả thi của đề tài này.
1.6. Các kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán sán lá gan nhỏ
Xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trong phân hoặc dịch tá tràng, các xét
nghiệm miễn dịch, sinh học phân tử.
1.6.1. Xét nghiệm tìm trứng sán lá gan nhỏ trong phân hoặc dịch tá tràng
Có nhiều phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng sán lá gan nhỏ khác nhau
như xét nghiệm phân theo phương pháp

ato (định tính) và Kato- atz (định

lượng); Phương pháp ly tâm lắng cặn formalin-ether (FECT, formalin-ether
concentration technique).
Phương pháp ato (1954), ato- atz (1972) được WHO (1994) khuyến cáo
sử dụng để xét nghiệm phân phát hiện trứng giun sánbằng kính hiển vi tại những

10


vùng dịch tễ có tỷ lệ nhiễm giun ≥ 20%, các loài sán ≥ 10%. Đây là kỹ thuật có thể
phát hiện được trứng giun, sán lá gan nhỏ, sán lá ruột, sán dây, sán lá gan lớn trong
phân, áp dụng được tại thực địa. Tuy nhiên, do lượng trứng trong phân thấp nên các
phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng giun sán có độ nhạy không cao (chỉ
khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên, dễ
nhầm lẫn giữa trứng của các loài sán lá gan nhỏ và với trứng của sán lá ruột nhỏ
[46].
Phương pháp tập trung trứng bằng ly tâm lắng cặn theo Esteban và cộng sự

đích

ITS1

(Internal

Transcribed Spacer 1), ITS2 và DNA ty thể phát triển các kỹ thuật PCR, real time
PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini hay C. sinensis cho độ nhạy và độ
đặc hiệu cao. Wongratanacheewin và cộng sự (2002) sử dụng kỹ thuật PCR để xác
định O. viverrini trên các mẫu phân người cho độ nhạy là 100% và độ đặc hiệu là
98% với các mẫu phân có mật độ nhiễm trứng sán> 1000 trứng/1gram phân, tuy vậy

11


độ nhạy giảm còn 68% với các mẫu có mật độ nhiễm trứng sán < 200 trứng/1 gram
phân. Kỹ thuật PCR đã phát hiện được thêm 29% các mẫu dương tính với sán lá gan
nhỏ từ số các mẫu âm tính bằng kỹ thuật soi kính hiển vi [47]
Cai X.Q và cộng sự 2012, đã phát triển kỹ thuật real time PCR sử dụng
TaqMan để phát hiện nhiễm C. sinensis từ mẫu phân người và mẫu ấu trùng trên cá
nước ngọt. Các cặp mồi được thiết kế trên vùng gen đích ITS1 được chứng minh
đặc hiệu cho C. sinensis và không lai chéo với các loài giun sán khác. Kết quả đánh
giá độ nhạy cho thấy kỹ thuật real time PCR cho giới hạn phát hiện là 1 fg DNA
tinh khiết hoặc 5 trứng/1g phân hoặc 1 ấu trùng/1 gram mô cá. Kết quả xét nghiệm
bằng real time PCR được thử nghiệm trên 22 mẫu phân và 37 mẫu ấu trùng đã được
xét nghiệm bằng kính hiển vi cho thấy real time PCR cho kết quả tương đồng [17].
1.7. Kỹ thuật LAMP
LAMP là viết tắt của từ “Loop-Mediated Isothermal Amplification” có nghĩa
là sự khuếch đại DNA ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng hay móc
(Loop). LAMP được phát triển đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm tác giả Notomi T.

+ ước 1: Mồi xuôi FIP chứa trình tự F2 sẽ bổ sung vào mạch DNA ở vị trí F2c
+ ước 2: DNA polymerase thực hiện kéo dài sợi DNA mới từ mồi FIP
+

ước 3: Mồi ngoài F3 bổ sung vào F3c và được kéo dài. Sự tổng hợp sợi

DNA mới bởi mồi này và DNA polymerase dẫn đến giải phóng sợi DNA tổng hợp
từ mồi FIP
+ ước 4: Sợi đôi DNA được hình thành từ sợi khuôn và mồi F3
+ ước 5: Sợi đơn DNA được tổng hợp từ mồi FIP và khuôn được giải phóng.
Vì đầu 5’ của sợi này có chứa 2 trình tự bổ sung nhau là F1c và F1 nên hình thành
cấu trúc vòng.
+ ước 6: Sợi DNA được tạo ra từ bước 5 sẽ làm khuôn cho mồi BIP tổng hợp
sợi mới và mồi B3 sẽ có chức năng như F3 là tổng hợp sợi mới và giải phóng sợi
DNA mồi BIP
+

ước 7: Sợi đôi DNA được hình thành từ mồi B3 và sợi được tổng hợp từ

bước 5.
+

ước 8: Sợi DNA được tổng hợp từ mồi BIP và sợi chứa mồi FIP sẽ hình

thành cấu trúc vòng ở 2 đầu do sự bổ sung của 2 cặp trình tự với nhau.

13


Để khởi đầu cho chu kì phản ứng LAMP, FIP bắt cặp bổ sung với DNA đầu

dương tính).
Một phương pháp khác là mẫu DNA sau khi chạy LAMP sẽ được bổ sung
một số chất huỳnh quang như SYBR Green I hoặc ethidium bromide, rồi quan sát
dưới đèn UV. ết quả dương tính có hiện mầu đặc trưng hay phát sáng.

Hình 1.7. Đánh giá kết quả LAMP[6]
(a)Sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green I dưới đèn UV; (b)Sử dụng thuốc nhuộm
SYBR Green I dưới ánh sáng thường; (c) kết quả LAMP bằng điện di.
1.7.2.3. Quy trình thực hiện LAMP
Quy trình thực hiện kỹ thuật LAMP được mô tả ở hình 1.8
15


Hình 1.8. Sơ đồ quy trình thực hiện kỹ thuật LAMP [6]
1.7.2.4. Tính ưu việt của kỹ thuật LAMP
LAMP là một phương pháp khuếch đại DNA mới, có độ đặc hiệu cao, bằng
cách tận dụng ưu điểm của st DNA Polymerase có tác dụng đẩy mạch để khuếch
đại đẳng nhiệt đoạn DNA mục tiêu (nhiệt độ dao động từ 60 đến 65 C) và một bộ 4
mồi được thiết kế đặc biệt để nhận ra từ 2 - 6 trình tự cách xa nhau trên gen đích, do
vậy làm tăng độ nhạy cũng như tốc độ của phản ứng.
Ưu điểm của phương pháp là nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, không cần các
thiết bị chuyên dụng có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương và cao hơn các
phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR [17].
Thời gian thực hiện LAMP nhanh hơn so với PCR. Theo đó, thời gian thực
hiện PCR trung bình khoảng 2,5 – 3 giờ [32], trong khi thời gian thực hiện LAMP
trung bình khoảng 1 - 1,5 giờ. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc
chuẩn đoán và xác định bệnh nhanh ở động vật, đặc biệt là trên người.
ết quả của phản ứng LAMP có thể được quan sát ngay dưới ánh sáng
thường hoặc soi dưới tia UV.
16

PCR thông thường, kỹ thuật LAMP đơn giản và là công cụ có giá trị trong phát hiện
nhanh, với độ nhạy, đặc hiệu cao trong phát hiện nhiễm C. sinensis trên cá nước
ngọt [14].
Sử dụng DNA ty thể được xem như có nhiều lợi thế so với gen đích nằm
trong hệ gen nhân vì gen ty thể có số bản sao lớn hơn ở tế bào (đặc biệt là khi sử
dụng nguồn DNA tách từ trứng) cho phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung
gian vòng. Lê Thanh Hòa và cộng sự (2012) đã thiết lập kỹ thuật LAMP với 4 mồi
(F3, FIP (F1c + F2), BIP (B1c + B2) và B3) thiết kế dựa trên gen ty thể nad1 của
17