QT6.2/KHCN1-BM21

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH
HỘI ĐỒNG KHOA HỌC
ISO 9001 : 2008

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH
CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG
ỨC CHẾ VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus,
GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH
(AHPND) TRÊN TÔM BIỂN

Chủ nhiệm đề tài:

ThS. NGUYỄN THỊ TRÚC LINH

Chức danh:

Giảng viên

Đơn vị:

Khoa Nông nghiệp - Thủy sản

Trà Vinh, ngày tháng năm 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH

dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản vì thế đề tài "nghiên cứu phân lập và
định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm biển"
được tiến hành. Vi khuẩn lactic (LAB) được phân lập từ các nguồn khác nhau như:
(1) ruột tôm biển; (2) ruột cá rô phi (Oreochromis niloticus); (3) bùn và nước của
các ao nuôi tôm ở tỉnh Trà Vinh, và Sóc Trăng. Các dòng vi khuẩn LAB được sàng
lọc bằng các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, và sinh hóa sau đó xác định tính đối kháng
với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng
thạch. Thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn bằng bacteriocin và khả năng
chịu đựng nồng độ muối của 5 chủng vi khuẩn kháng với Vibrio parahaemolyticus
cũng được tiến hành. Kết quả phân lập từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi, bùn và nước
ao tôm biển ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng là như sau: 30 chủng vi khuẩn lactic ở
Trà Vinh, và 25 chủng vi khuẩn lactic ở Sóc Trăng đã được phân lập. Kết quả xác
định khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus như sau: trong tất cả các
chủng LAB phân lập được có 02 chủng có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus rất yếu với đường kính vô trùng nhỏ hơn 11 mm. Các chủng vi
khuẩn này không thể ứng dụng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp. 40 chủng vi
khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhưng vòng vô
trùng chỉ ở mức trung bình (++) từ 11-16mm. 13 chủng vi khuẩn còn lại có vòng vô
khuẩn lớn (+++) từ lớn hơn 16 mm. Trong 13 chủng vừa nêu có 2 chủng rp5.4.1 và
rp5.5.1 có vòng vô khuẩn lớn nhất tương ứng là 18,2 và 18 mm. Nghiên cứu này
cho thấy dòng rp5.4.1 và rp5.5.1 có thể được sử dụng trong việc phòng bệnh hoại tử
gan tụy cấp tính trên tôm biển. Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của
bacteriocin với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của 5 chủng vi khuẩn lactic là do
vi khuẩn tiết acid lactic không phải tiết bacteriocin. Các chủng vi khuẩn thí nghiệm
đều phát triển ở độ mặn từ 0-25‰ nhưng phát triển tốt nhất ở độ mặn 5-15‰, và
phát triển chậm hơn ở độ mặn 25‰. Tuy nhiên ở chủng vi khuẩn lactic TV20 thì
phát triển mạnh nhất ở độ mặn 25‰.

3

Chương 1. Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn lactic từ các nguồn khác nhau và các
chỉ tiêu sinh lý sinh hóa ................................................................................. 38

4


1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn khác nhau ............. 38
1.2 Sàng lọc các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic .. 39
Chương 2: Tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Vibrio
parahemolyticus trong điều kiện in vitro ...................................................... 40
2.1 Kết quả xác định tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi
khuẩn Vibrio parahemolyticus trong điều kiện in vitro ............................... 40
2.2 Kết quả xác định khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahemolyticus của vi
khuẩn lactic bằng bacteriocin ........................................................................ 42
2.3 Thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng lên mật số của vi
khuẩn lactic ................................................................................................... 43
Chương 3 Kết quả định danh dòng vi khuẩn phân lập được có khả năng
kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ..................................... 45
3.1 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.5.1 bằng phương pháp giải trình tự gen
16s ................................................................................................................. 46
3.2 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.4.1 bằng phương pháp giải trình tự gen
16s ................................................................................................................. 46
3.3 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.2.1 bằng phương pháp giải trình tự gen
16s ................................................................................................................. 47
3.4 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.2.1 và T5.1 bằng phương pháp giải trình
tự gen 16s ...................................................................................................... 48
PHẦN KẾT LUẬN ....................................................................................... 50
1 Kết luận ................................................................................................... 50
2 Kiến nghị ................................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 51

Hình 2.2.2b. Hình dạng vi khuẩn V. Parahaemolyticus và thể thực
khuẩn

18

Hình 2.2.2c. Hình mô bệnh học của tôm khoẻ

19

Hình 2.2.2 d. Hình mô bệnh học của tôm bệnh hoại tử gan tụy

19

Hình 2 .2.2 e. Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

20

Hình 1: Quy trình phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, cá rô phi,
bùn đáy và nước ao nuôi tôm biển

32

Hình 2: Quy trình xác định khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn
lactic với V. parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng
thạch

34

Hình 3 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V.
parahaemolyticus


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU, ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG,
TỪ NGẮN HOẶC THUẬT NGỮ
AHPNS Acute Hepatapancreatic Necrosis Syndrome
CFU Colony Forming Unit
ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
EMS Early Mortality Syndrome
FAO Food and Agriculture Organization
GAV Gill Associated Virus
HPV Hepatopancreatic Parvovirus
IHHNV Hypothermal And Hematopoietic Necrosis Virus
MBV Monodon Baculovirus
MRS Man Rogosa Sharpe
NA Nutrient Agar
OIE Office International des Epizooties
PCR Polymerase Chain Reaction
PL Post Larval
TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar
TSA Tryptone Casein Soy Agar
TSB Tripticase Soya Broth
TSV Taura Syndrome Virus
V. P : Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
WSSV White Spot Syndrome Virus
YHV Yellow Head Virus

8


LỜI CẢM ƠN

mortality syndrome – EMS) (Lightner et al., 2012). Hội chứng hoại tử gan tụy cấp
tính xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 2009, ở Việt Nam vào năm 2010 rồi đến Thái
Lan và Mã Lai vào năm 2011 (Lightner et al., 2012; Flegel, 2012). Bệnh này xuất
hiện và gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở các Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh,
Bến Tre và Kiên Giang. Bệnh xuất hiện ở tôm sú và tôm thẻ khoảng 10 - 45 ngày
sau khi thả giống, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% ở những ao nhiễm nặng. Tác nhân
gây ra hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
(Lightner et al., 2012) mang thể thực khuẩn (Bateriophage) (Loc Tran, et al, 2012).
Hiện nay có nhiều biện pháp được đề xuất để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp như: dùng hóa chất diệt
khuẩn, sử dụng kháng sinh, áp dụng biện pháp sinh học,.... Tuy nhiên, biện pháp sử
dụng hóa chất, kháng sinh thì hiệu quả không cao, dễ gây ra nguy cơ phát sinh
nhiều loài vi khuẩn gây bệnh kháng với kháng sinh. Thêm vào đó, sự tồn dư thuốc
trong thực phẩm cũng là chỉ tiêu quan trọng trong kiểm định nhập khẩu sản phẩm
nông nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới. Vì thế, cách tốt nhất là sử dụng biện
pháp pháp sinh học, dùng vi khuẩn có lợi có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây
bệnh. Biện pháp này không những có thể kiểm soát được mật độ vi khuẩn gây bệnh
mà còn đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và có lợi cho môi trường do chỉ sử dụng
các loài vi khuẩn hữu ích.
Vi khuẩn lactic đã được ứng dụng rộng rãi và ngày càng phổ biến trong việc sản
xuất chế phẩm sinh học, bổ sung trong thức ăn động vật thủy sản, thức ăn chăn nuôi
cũng như việc bón vào ao nuôi để ức chế các loài vi khuẩn gây bệnh cho động vật
thủy sản. Trong nghiên cứu về các loài vi khuẩn hữu ích thì có một số dòng vi
khuẩn tiết ra chất ức chế đề kháng lại với vi khuẩn khác như Lactobacillus sp.
kháng lại vi khuẩn Vibrio sp. (Trịnh Hùng Cường, 2011); Lactobacillus suntoryeus
LII1 có khả năng kháng mạnh đối với Escherichia coli và Bacillus cereus (Hồ Lê
Huỳnh Châu và ctv, 2010). Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh ra acid hữu
cơ, chúng ức chế vi khuẩn gây bệnh do sự tác động lên tế bào chất của vi khuẩn,
ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ của màng tế bào (Fooks et al., 1999; Jay, 2000;


với 157 triệu tấn của năm 2012 trong khi xuất khẩu thủy sản sẽ đạt 136 tỉ USD, nuôi
trồng chiếm 59,9 triệu tấn, ước tính tăng khoảng 25 triệu tấn so với năm 2001.
Trong đó, sản lượng cá nước ngọt chiếm 56,4% (33,7 triệu tấn), nhuyễn thể chiếm
23,6% (14,2 triệu tấn), giáp xác chiếm 9,6% (5,7 triệu tấn), cá nước lợ chiếm 6,0%
(3,6 triệu tấn), cá nước mặn chiếm 3,1% (1,8 triệu tấn) và những động vật thủy sản
khác chiếm 1.4 % (814. 300 tấn).
2.1.2 Ở Việt Nam
Đồng bằng Sông Cửu long là vùng nuôi tôm trọng điểm tại Việt Nam, bao
gồm các tỉnh: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre, Trà Vinh,…. với hai đối
tượng nuôi chính là tôm sú và tôm thẻ. Tổng diện tích nuôi trồng thủy sản ở

11


ĐBSCL với diện tích khoảng 1.366.430 ha, trong đó nuôi nước lợ mặn là 886.249
ha (chiếm 89% cả nước). Diện tích nuôi của vùng tăng từ 527.398 ha năm 2011 lên
746.373 ha năm 2008, đạt tốc độ tăng trưởng bình quân 5,09%/năm (Viện kinh tế và
quy hoạch thuỷ sản, 2009).
Theo Tổng cục Thuỷ sản (2013) trong năm 2012, toàn quốc có 30 tỉnh thành
nuôi tôm nước lợ diện tích trên 657.523 ha tăng 0,2% so với năm 2011 nhưng do
ảnh hưởng của dịch bệnh đã khiến sản lượng trong năm giảm từ 495.657 tấn chỉ còn
476.424 tấn. Trong đó, tôm sú chiếm 94,1% tổng diện tích và 62,7% sản lượng tôm
nuôi trong cả nước; thẻ chân trắng nuôi chiếm 5,9% diện tích với sản lượng chiếm
27,3%. Khu vực ĐBSCL vẫn là vùng nuôi tôm nước lợ chủ lực của cả nước với
diện tích 595.723 ha với sản lượng 358.477 tấn chiếm 90,61% diện tích, 75,2% sản
lượng nuôi tôm cả nước). Trong đó diện tích nuôi tôm sú là 579.997 ha, sản lượng
280.647 tấn (chiếm 93,6 % diện tích, 94% sản lượng tôm sú cả nước) và diện tích
nuôi tôm chân trắng là 15.727 ha, sản lượng 77.830 tấn (chiếm 41,2% diện tích,
42% sản lượng tôm chân trắng nuôi cả nước) tập trung ở một số tỉnh trọng điểm như
Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng và Bến Tre (Tổng cục Thủy sản, 2013).

2001, và vẫn chưa có thống kê chính xác về hậu quả của loại virus này gây ra tại
khu vực châu Á đến thời điểm này (Walker and Mohan, 2008). Bên cạnh TSV thì
bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV) cũng gây ảnh hưởng không nhỏ đến sản
lượng tôm thẻ chân trắng trên thế giới, bệnh gây ra ”Hội chứng dị hình còi cọc” và
ước tính thiệt hại khoảng 10-15% của mỗi vụ nuôi. Tuy nhiên IHHNV (Infectious
hyperdermal and hematopoetic virus) lại ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng cũng như
khả năng sinh sản của tôm sú (Walker and Mohan, 2008).
2.2.2 Bệnh do vi khuẩn trên tôm
Tác nhân gây bệnh nguy hiểm đe dọa đến nghề nuôi tôm ở một số quốc gia
trên thế giới là vi khuẩn, chủ yếu là các loài thuộc nhóm Vibrio (Lightner, 1996;
Flegel, 2012). Vibriosis trên tôm thường do các tác nhân chính: Vibrio anguillarum,
V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. penaeicida (Lightner, 1996)
trong đó V. harveyi được xem là loài gây bệnh chủ yếu. Các chủng V. harveyi phát
sáng được báo cáo gây thiệt hại trầm trọng trên tôm nuôi ở Philiphine, Australia,
Mexico (Rao, 2007). Vibriosis được ghi nhận gây thiệt hại mỗi năm khoảng 30.800
tấn tôm he (Marsupenaeus japonicus) với giá trị thiệt hại xấp xỉ 85 triệu USD
(Prayitno and Latchford, 1995). Theo Saulnier et al. (2000) bệnh do vi khuẩn Vibrio
thường xảy ra trong tháng nuôi đầu tiên khi tôm bị ảnh hưởng bởi một số thay đổi
từ môi trường nuôi (pH, nhiệt độ, độ mặn,..) liên quan đến một số bệnh như nhiễm
khuẩn cục bộ, nhiễm khuẩn trên gan tụy (Lighner, 1996), hoại tử đuôi (Tail
necrosis), đỏ thân (Red disease), hội chứng mềm vỏ (Losse shell syndrome),…
(Jayaree et al., 2006).
- Sơ lược về vi khuẩn Vibrio sp. gây bệnh trên động vật thủy sản.
Đặc điểm chung của các vi khuẩn Vibrio: Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi
cong, kích thước 0,3-0,5 µm x 1,4-2,6 µm, không hình thành bào tử và chuyển động
nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao mảnh, tất cả chúng đều yếm khí tùy tiện và
hầu hết là oxy hóa và lên men trong môi trường O/F Glucose. Thiosulphate citrate
bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của Vibrio. Hầu hết các loài đều phát
triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả
các loài Vibrio, chúng không phát triển trong môi trường không muối NaCl, chúng

hai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrit từ nitrat, mọc trên môi trường chọn lọc
cho nhóm Vibrio (Thiosulfate-Citrate-Bile salts-Sucrose TCBS) và nhất là nhạy với
hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129,150 μg) là hợp chất giúp
phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas. Các chủng vi khuẩn phát sáng đều phát
triển tốt ở môi trường có 3% NaCl, sinh indole và có khả năng tạo axít từ mannitol
và trehalose (West et al.1986).
Bảng 2.2.2a Một số bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm
S

Tên bệnh

Giai đoạn tôm

Vi khuẩn gây bệnh

Tác hại

1

Bệnh phát sáng

ấu trùng, giống

V.parahaemolyticus
V.harveyi

Gây chết hàng
loạt

2


Cá nuôi ao, lồng

Vibrio spp.,
Pseudomonas spp.,
Proteus sp.

( Bùi Quang Tề, 2006)

14

Vibrio spp.

chết rải rác,
hàng loạt

chết rải rác


Chen (1989) phân lập được trong gan tụy tôm sú có 18 loài Vibrio trong
đó: Vibrio harveyi chiếm 26,9% và V. splendidus chiếm khoảng 0,5%. Hai loại này
thường làm tôm bị chết nhiều, có lúc tới 100%, chúng có thể kháng lại 24 loại thuốc
kháng sinh (Baticados et al., 1991). Chỉ có một loại kháng sinh kiềm chế sự phát
triển của hai loại Vibrio này.
+ Các bệnh Vibriosis trên tôm he (Marsupenaeus japonicus)
Trong quá trình nuôi, việc quản lý môi trường ao nuôi là rất quan trọng. Khi
điều kiện môi trường ao nuôi bất lợi thì một số loài vi khuẩn cơ hội, đặc biệt là vi
khuẩn Vibrio sẽ tồn tại trong môi trường nước ao nuôi, xâm nhập vào cơ thể tôm và
có khả năng gây ra bệnh. Nếu môi trường ao nuôi tiếp tục xấu đi thì mật độ vi
khuẩn ngày càng gia tăng, chúng có thể gây ra chết tôm trong thời gian ngắn hoặc

105 CFU/ml đối với phương pháp ngâm và 104 CFU/ml đối với phương pháp tiêm.
Hầu như không ghi nhận được bất kì dấu hiệu lâm sàng nào trên tôm cảm nhiễm
trong các thí nghiệm nói trên nhưng khi tiến hành phân tích mô bệnh học trên các
mẫu thì phát hiện được một số biến đổi mô học đặc trưng trên một số cơ quan gan
tụy, mang và cơ quan lymphoid. Tôm nuôi nhiễm Vibriosis nói chung thường biểu
hiện một số đặc điểm mô học đặc trưng như hiện tượng nhiễm khuẩn cục bộ trên
các cơ quan, sau đó là sự tập trung của tế bào máu vây quanh các cụm vi khuẩn,
kèm theo hiện tượng melamin hóa thường thấy trên cơ quan lymphoid, gan tụy,
mang, mô liên kết mang, hệ thống tiêu hóa,.. (Lightner, 1996; Robertson et al.,
1998; Pitogo et al., 1990). Các đặc điểm bệnh học tương tự cũng được ghi nhận khi
gây cảm nhiễm V. harveyi lên tôm thẻ (Penaeus semisulcatus) với các mật độ vi
khuẩn khác nhau (Mohajeri et al, 2011) và trong thí nghiệm cảm nhiễm của
Jayasree et al., (2012) trên tôm sú với các chủng vi khuẩn phân lập được trên tôm bị
hội chứng mềm vỏ. Bên cạnh đó, cũng ghi nhận được hiện tượng các tế bào máu
bao vây các cụm vi khuẩn trên cơ quan lymphoid (Nash et al., 1992) và hiện tượng
mất các không bào trên vùng gan tụy, làm ảnh hưởng đến khả năng dự trữ lipid và
glycogen của gan (Anderson et al., 1988; Mohajeri et al., 2011).
+ Sơ lược về bệnh hoại tử gan tụy trên tôm biển
Đặng Thị Hoàng Oanh et al. (2012) vào đầu năm 2011, sự xuất hiện của hội
chứng hoại tử gan tụy cấp tính chưa rõ nguyên nhân đã gây thiệt hại nghiêm trọng
đến sản lượng tôm nuôi cả nước nói chung và khu vực ĐBSCL nói riêng. Tôm mắc
phải hội chứng gan tụy cấp tính thường biểu hiện một số dấu hiệu lâm sàng như gan
tụy teo, dai; vỏ mềm, ruột rỗng; đôi khi xuất hiện những đốm đen có thể nhìn thấy
bằng mắt thường; tôm thường chết đáy và chết cấp tính trong khoảng 2 – 4 ngày sau
khi xuất hiện các dấu hiệu trên.
Theo Lightner., et al (2013) bệnh hoại tử gan tuỵ trên tôm biển lần đầu tiên
được phát hiện vào năm 2009 được gọi là “Hội chứng tôm chết sớm-EMS (Early
Mortality Syndrome)”. Năm 2011, một tên mới được đặt dựa trên mô tả bệnh tích
cấp tính, gọi là “hội chứng hoại tử cấp” (AHPNS -Acute Hepatopancreatic Necrosis
Syndrome). Năm 2013, tên gọi “bệnh Hoại tử Gan tuỵ Cấp” (AHPND - Acute

triển Nông thôn tỉnh Trà Vinh, tính đến tháng 3, trên địa bàn tỉnh đã có gần 400 hộ
nuôi tôm tại các huyện Duyên Hải, Cầu Ngang và Trà Cú thả nuôi tôm thẻ chân
trắng với gần 140.000 con, thì trong đó có gần một nửa trong số này đã bị thiệt hại
và chưa có dấu hiệu dừng lại. Tình trạng tương tự cũng được ghi nhận ở một số ao
nuôi tôm sú thâm canh thuộc các huyện Đầm Dơi, Phú Tân, Cái Nước với thiệt hại
trên 116 ha trong số 2.740 ha diện tích tôm đang nuôi. Trong 3 tháng đầu năm 2013,
sản lượng nuôi trồng thuỷ sản của tỉnh Cà Mau chỉ đạt 45.000 tấn, thấp hơn nhiều
so với cùng kỳ, báo hiệu một năm kinh tế thuỷ sản đang đứng trước nhiều khó khăn.
Nguyên nhân tôm chết ở 2 tỉnh đã được xác định đa phần do nhiễm bệnh đốm trắng
và hoại tử gan tụy cấp làm cho tôm chết ở giai đoạn 25- 40 ngày tuổi, gây thiệt hại
nặng, đặt ra nhiều thách thức cho nghề nuôi tôm trong năm.
Lê Hữu Tài và ctv., 2011; Nguyễn Thị Hiền và ctv., 2011 còn cho biết nhiệt độ
và độ mặn cũng có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh và lây lan của AHPNS. Ở
những vùng nuôi có nhiệt độ và độ mặn càng cao thì khả năng nhiễm bệnh và tỷ lệ
tử vong càng lớn.
Một số triệu chứng lâm sàng đối với bệnh hoại tử gan tụy cấp như gan tụy teo,
dai, có màu nhợt nhạt như trắng hoặc vàng nhạt, có những đốm đen hoặc sọc đen.
Vỏ tôm mềm, ruột rỗng (không có thức ăn, tổ chức gan tụy thoái hóa cấp tính, tế
bào ống thận (R, B, F và E) mất chức năng, tế bào có nhân lớn bất thường, biểu bì

17


của ống thận bị bong tróc. Có sự tụ tập của tế bào máu và nhiễm khuẩn thứ cấp.
Bệnh AHPNS do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang thể thực khuẩn gây ra và
chỉ lây nhiễm qua đường tiêu hóa (Loc Tran et al., 2013), thể hiện ở hình 2.2.2 a;

A:Tôm có màu sẫm

B: Gan tuỵ teo

ghi nhận có dấu hiệu hoại tử gan tụy đều phải thu hoạch sau khi phát hiện hoại tử 23 ngày và tôm bệnh không có khả năng hồi phục.
Theo Chien, 2012 nghiên cứu các giải pháp môi trường nhằm ngăn ngừa và
quản lý dịch bệnh đối với Hội chứng hoại tử gan tụy do vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus khi bị cảm nhiễm bởi một thể thực khuẩn sẽ tạo ra độc tố cực
mạnh. Bên cạnh đó sự gia tăng và sinh sôi nhanh chóng của các mầm bệnh virus
trong môi trường ương nuôi, sự tương tác của 2 điều kiện bất lợi: sức đề kháng của
tôm yếu và môi trường nuôi xấu đi thường tạo điều kiện thuận lợi cho dịch bệnh
bùng phát. Quản lý môi trường tốt có thể làm giảm bớt áp lực bên ngoài, ngăn chặn
sự phát triển của mầm bệnh, tăng sức đề kháng giúp tôm chống lại sự xâm hại của
mầm bệnh. Để hạn chế dịch bệnh EMS nên sử dụng vi khuẩn có lợi, như sử dụng
dòng đặc biệt Subtilis sp., Pseudomonas sp., và Lactobacillus sp., để ngăn chặn sự
phát triển của Vibrio sp., và cũng giảm hàm lượng nitơ trong nước, ngăn dịch EMS.
Nuôi kết hợp với rong biển (aquaponic) giúp cải thiện và ổn định chất lượng nước,
và thậm chí hợp chất sulfated polysarcharides trong rong biển giúp tăng sức đề
kháng trong tôm.
+ Đặc điểm mô bệnh học của bệnh hoại tử gan tụy
Lightner et al. (2012) khi phân tích mô bệnh học đối với tôm sú, thẻ chân trắng
bị nhiểm AHPNS, đã mô tả chi tiết như sau: tổ chức gan tụy thoái hóa cấp tính, tế
bào ống thận (R, B, F và E) mất chức năng, tế bào có nhân lớn bất thường, biểu bì
của ống thận bị bong tróc, có sự tụ tập của tế bào máu và nhiễm khuẩn thứ cấp.

Hình 2.2.2c Hình mô bệnh học của tôm khoẻ

Giai đoạn cấp tính
Giai đoạn cuối
Hình 2.2.2d Hình mô bệnh học của tôm bệnh hoại tử gan tụy

19




20


V. parahaemolyticus là trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí và kị khí không bắt
buộc, di động bằng tiêm mao và có khả năng trượt trên bề mặt môi trường có độ
nhớt cao (McCarter, 1999). Nghiên cứu bộ gen của V. parahaemolyticus đã xác
định được gen mã hoá hemolysin không bền nhiệt (TLH - thermolabile haemolysin)
là gen đặc hiệu của loài, gen mã hoá hemolysin bền nhiệt (TDH – thermostable
direct haemolysin) mã hoá protein TDH có tác dụng làm vở tế bào máu và gây tan
huyết (Iida et al., 1998; McCarthy et al., 1999). Vi khuẩn này còn có thể tiết ra
protease và phospholipase làm bất hoạt enzyme gây đông máu ở tôm (Lee et al.,
1999).
V. parahaemolyticus tồn tại phổ biến ở hệ sinh thái nước mặn và vùng cửa sông
trong đó có các ao nuôi, đặc biệt ở các khu vực Đông Nam Á (Wong et al., 2000).
Nó có thể tồn tại tự do trong môi trường nước và nền đáy, bám trên bề mặt ngoài và
xâm nhập vào bên trong cơ thể của các động vật phù du, cá và giáp xác (Kaneko
and Colwell, 1973; Kaneko and Colwell ,1975) và phát triển tốt hơn so với các loài
vi khuẩn khác trong điều kiện nhiệt độ và độ mặn tương đối cao (Williams and
Larock, 1985). Theo Twedt et al. (1969) V. parahaemolyticus có thể phát triển trong
khoảng nhiệt độ dao động từ 22 – 420C với nhiệt đố tối ưu là 37oC, ngưỡng pH 5 –
11 và nồng độ muối 1 – 7%. Khi nghiên cứu về sự tồn tại của loài vi khuẩn này
trong các sản phẩm thủy hải sản đông lạnh khác nhau Vanderzant and Nickelson
(1972) cho biết V. parahaemolyticus có thể tồn tại trong khoảng pH từ 5 – 10 và chỉ
vô hoạt ở nhiệt độ 80 – 1000C trong 15 phút.
V. parahaemolyticus có khả năng gây dịch bệnh trên người và động vật thủy
sản như tôm, cua, nhuyễn thể đặc biệt tôm là loài tương đối nhạy cảm với vi khuẩn
này trong tất cả các giai đoạn phát triển (Xie et al., 2005; Zulkifiet al., 2009;
Lightner, 1996). Trên tôm, V. parahaemolyticus thường được phân lập trong máu
và gan tụy (Lighner, 1996; , Bruno et al., 1998; Sung et al., 2001). Các chủng V.

chứng đỏ thân ở vùng ven biển Andhra Pradesh, Ấn Độ của Jayasree et al., (2006),
xác định được liều gây chết 50% (LD50) trong 48 giờ của chủng vi khuẩn dùng
trong cảm nhiễm là 4.0 x 104 CFU/ml. Thông qua hai thí nghiệm trên đã chứng
minh được V. parahaemolyticus là tác nhân gây nên hội chứng đỏ thân trên tôm sú.
Phương pháp ngâm cũng được Roque et al. (1998) áp dụng trong thí nghiệm
gây cảm nhiễm của vi khuẩn này trên tôm thẻ chân trắng với các nghiệm thức khác
nhau (1) tôm bị tổn thương, tiếp xúc với vi khuẩn, (2) tôm tiếp xúc với vi khuẩn, (3)
tôm chỉ bị tổn thương, (4) tôm khoẻ. Thí nghiệm được theo dõi trong 4 ngày cho
thấy tỉ lệ tôm chết cao nhất ở nghiệm thức tôm bị thương cho tiếp xúc với vi khuẩn
dao động từ 37 – 50%, điều này cho thấy vi khuẩn có khả năng gây bệnh trên tôm
thẻ chân trắng, đặc biệt khi tôm bị tổn thương hoặc bị sốc do các yếu tố môi trường
nuôi. Tuy nhiên không ghi nhận được dấu hiệu bệnh lý nào của tôm cảm nhiễm đối
với vi khuẩn này.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Hồng Sơn (2013) về xác định khả năng lây
nhiễm của hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm he bằng phương pháp cho
tôm khoẻ ăn mẫu tôm bệnh. Thí nghiệm này được tiến hành trên tôm sú (Penaeus
monodon) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong 35 ngày. Kết quả
cho thấy AHPNS không có lây nhiễm cho tôm khoẻ khi sử dụng mẫu tôm bệnh bảo
quản trong điều kiện đông lạnh (-800C). Kết quả phân tích mô bệnh học cho thấy có
11/405 mẫu có dấu hiệu tổn thương vùng gan tuỵ trên tôm sú và 16/324 mẫu tôm
thẻ. Tuy nhiên, các dấu hiệu bệnh tích này không phải là dấu hiệu mô bệnh học đặc
trưng của AHPNS. Kết quả nhuộm Gram mẫu kính phếch trên gan tụy tôm cảm
nhiễm có 49 mẫu gan tụy tôm sú và 43 mẫu tôm thẻ ở nghiệm thức cho ăn mẫu tôm
bệnh phát hiện vi khuẩn Gram âm tập trung xung quanh tế bào gan tụy nhưng số

22


lượng không nhiều. Số mẫu còn lại không có hiện tượng nhiễm khuẩn. Bên cạnh đó,
tỉ lệ tôm chết ở các nghiệm thức cho ăn mẫu bệnh phẩm cao hơn tỉ lệ tôm chết tại

Lactococcus,
Leuconostoc,
Streptococcus,
Pediococcus,
Bifidobacterium và Carnobacterium (Abee et al., 1999).
Tùy thuộc vào sản phẩm của quá trình lên men mà người ta chia quá trình lên
men acid lactic thành hai loại: lên men acid lactic đồng hình và lên men acid lactid
dị hình. Theo Abee et al. (1999) thì hai quá trình này có những đặc điểm sau:

23


+ Lên men acid lactic đồng hình: nhờ hoạt động lên men của nhóm vi khuẩn
lactic đồng hình. Chúng biến đổi đường thông qua quá trình đường phân và tạo ra
sản phẩm cuối cùng là acid lactic. Quá trình lên men acid lactic đồng hình được cho
là có lợi về mặt năng lượng (ATP) cho vi khuẩn acid lactic vì chúng tạo ra được 2
phân tử ATP và 2 phân tử acid lactic từ 1 phân tử đường được lên men. Có rất nhiều
loài vi khuẩn acid lactic lên men đồng hình: Lactobacillus lactis ssp. lactis,
Lactobacillus lactis ssp. cremoris, Enterococcus faecalis, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus salivarius, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus casei,…
Quá trình lên men lactic đồng hình: 1 Glucose → 2 acid lactic + 2 ATP
+ Lên men acid lactic dị hình: nhờ hoạt động lên men của vi khuẩn lactic dị
hình. Trong trường hợp này chỉ tạo thành 1 phân tử acid lactic từ 1 phân tử glucose
được lên men, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như: acid acetic, ethanol,
CO2. Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm. Một số
loài LAB lên men acid lactic dị hình: Leuconostoc lactis, Leuconostoc
mesenteroides ssp. cremoris, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum,…
Quá trình lên men acid lactic dị hình:
1 Glucose → 1 Acid lactic + 1 CO2 + 1 Ethanol + 1 ATP + Một số sản phẩm phụ

ra từ một số dạng bacteriocin có tên là Plataricin B hoạt động ức chế đáng kể các
loài vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Charlotte West và Philip Warner, 1998).
Lactobacillus sakei 2a sản sinh ra một loại bacteriocin có tên là P. sakacin ức chế
đáng kể sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây hỏng thịt, cá, do đó chúng còn ứng
dụng rộng rãi trong việc bảo quản các sản phẩm thịt lên men và một số sản phẩm cá
(Milton, 2005).
Nghiên cứu của Reid (1999) và Vázquez et al. (2005) cho thấy Lactobacilli
mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng: bám vào tế bào; ngăn
chặn hoặc giảm sự bám vào tế bào của các tác nhân gây bệnh; cạnh tranh dinh
dưỡng với vi khuẩn gây bệnh; kích thích miễn nhiễm cho vật chủ, tồn tại và tăng
mật số trong vật chủ, tạo ra acid, H2O2 và bacteriocin để kháng lại sự tăng trưởng
của các tác nhân gây bệnh, và cân bằng vi sinh đường ruột.
Schillinger và Lucke (1989) đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của
Lactobacillus sake được phân lập từ thịt. Nghiên cứu chỉ ra rằng bacteriocin thô thu
được từ dịch nuôi L. sake có khả năng ức chế nhiều loài Lactobacilli và Listeria
monocytogenes.
Nguyễn Thị Hoài Hà và ctv (2005) đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin của loài Lactobacillus plantarum L24 được phân lập từ nước dưa chua.
Kết quả cho thấy bacteriocin do loài này sinh ra thuộc nhóm II và lượng bacteriocin
sinh ra bị ảnh hưởng bởi các nguồn nitơ vô cơ khác nhau khi được thêm vào môi
trường nuôi.
Todorov và Dicks (2007) nghiên cứu bacteriocin ST712BZ – một bacteriocin
được tạo ra bởi Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ Boza (một thức
uống truyền thống của Bulgaria được tạo ra từ sự lên men của nhiều loại ngũ cốc).
Kết quả nghiên cứu cho thấy bacteriocin ST712BZ ức chế được nhiều loài vi khuẩn
như: Lactobacillus casei, Escherichia coli,...bên cạnh đó thì việc thay đổi khối
lượng của một số thành phần môi trường nuôi có ảnh hưởng tới hoạt tính của
bacteriocin này.

25