BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Khánh Hoàng Việt

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VÀ
VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ MODULE TRONG
CẤU TRÚC ENZYME THỦY PHÂN
CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT
TRONG DẠ CỎ CỦA DÊ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9.42.02.01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2020


Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: GS. TS. Trƣơng Nam Hải
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Đỗ Thị Huyền

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ

phần lớn đang chủ yếu bị đốt bỏ gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến
môi trường. Trong khi đó, nhân loại đang phải đối mặt với tình trạng
suy kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch cũng như các hệ quả nghiêm
trọng của việc tích tụ khí thải nhà kính. Việc nghiên cứu sử dụng
nguồn năng lượng carbonhydrate từ nguyên liệu có khả năng tái tạo
với trữ lượng khổng lồ như lignocellulose là hết sức cấp thiết


2
để tạo ra các sản phẩm thay thế các nhiên liệu được sản xuất từ
nguyên liệu hóa thạch.
Lignocellulose nói chung hay cellulose nói riêng là sinh khối
có cấu trúc vững chắc, được chuyển hóa theo nhiều bước để tạo
thành sản phẩm cuối cùng mà trong đó giai đoạn đường hóa đóng vai
trò then chốt. Trong quá trình này, cellulase được xác định là nhân tố
chính quyết định tới hiệu suất chuyển hóa và giá thành của sản phẩm.
Do vậy, trong những năm gần đây trên thế giới có rất nhiều công
trình nghiên cứu tìm kiếm nguồn cellulase mới có hoạt tính cao, có ái
lực mạnh với cơ chất để chuyển hóa hiệu quả cellulose. Khác với
enzyme khác, phần lớn các cellulase có cấu trúc module, có nghĩa là
ngoài vùng có chức năng xúc tác, enzyme còn chứa thêm một số
module khác có cấu trúc độc lập và ít được nghiên cứu, điển hình
như module FN3, Ig, CBM. Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu về vai
trò của các module chưa biết chức năng đến hoạt tính xúc tác của
cellulase chưa được công bố nhiều. Nhiều giả thiết cho rằng, chúng
không chỉ tồn tại như một vùng nối liên kết các vùng hoạt tính mà
chúng còn thể hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng khác như ổn
định cấu trúc, làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất. Vì vậy, nghiên
cứu làm rõ vai trò sinh học của các module này trong cấu trúc của
cellulase là hết sức có ý nghĩa cho việc lựa chọn hoặc thiết kế các

cho nghiên cứu biểu hiện và xác định vai trò của vùng chưa biết chức
năng.
3. Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế enzyme từ trình tự được
lựa chọn (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module (Fn3, XFn3, Egc,
Fn3Egc) dưới dạng dung hợp với SUMO.


4
4. Nghiên cứu vai trò của module chưa biết chức năng đến
khả năng phân giải cellulose của enzyme.
5. Nghiên cứu, đánh giá một số tính chất của enzyme tái tổ
hợp được biểu hiện từ trình tự được lựa chọn có cấu trúc module.
4. Những đóng góp mới của luận án
1. Từ 816 ORF mã hóa cellulase của vi khuẩn dạ cỏ dê Việt
Nam, 243 ORF mã hóa cellulase được xác định có cấu trúc chứa
module chưa rõ chức năng là FN3 hoặc Ig. Trong số các cellulase
hoàn thiện chứa module FN3, 99,2% FN3 đi kèm với module xúc tác
betaglucosidase GH3 và chỉ có một FN3 đi kèm với module xúc tác
endoglucanase GH5. Toàn bộ module Ig đều đi kèm với module xúc
tác endoglucanase GH9. Cấu trúc mã hóa endoglucanase GH5 chứa
module FN3 là cấu trúc mới ít được phát hiện và nghiên cứu.
2. Đã tổng hợp và biểu hiện trình tự mã hóa endoglucanase
GH5 (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module khác nhau (Fn3, XFn3,
Fn3Egc, Egc) trong E. coli để nghiên cứu vai trò của FN3 trong cấu trúc
của enzyme. Module FN3 được xác định có khả năng làm tăng tính tan
và ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng các cấu trúc tinh thể trên bề
mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn
làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất tan là CMC.

3. SXFn3Egc hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 4. Enzyme ổn

nhiều ứng dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ khai thác các
cellulase mới, đặc biệt là cellulase có cấu trúc module (FN3, Ig) từ
bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase. Bộ dữ liệu này được phân
tích từ 164.644 ORF đã được lắp ráp từ 8,46 Gb dữ liệu giải trình tự
DNA đa hệ gen của vi khuẩn trong dạ cỏ dê Việt Nam.


6
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 2.1. Đối tƣợng, vật liệu hóa chất và thiết bị máy móc

Đối tượng nghiên cứu: Bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa
cellulase từ dữ liệu DNA đa hệ gen của vi khuẩn trong dạ cỏ dê.

Các chủng vi sinh vật, plasmid của hãng Invitrogen (Mỹ),
mồi PCR được đặt tổng hợp tại GenScript (Mỹ); hóa chất của BioLab (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử, vi sinh vật
Biến nạp DNA plasmid vào E. coli (Froger et al., 2007); tách
chiết DNA plasmid từ E. coli và điện di trên gel agarose (Sambrook
et al., 2001); tinh chế DNA từ gel agarose sử dụng bộ kit DNA
Qiagene – QIAquick Gel Extraction Kit; tối ưu mã bộ ba dựa trên
phần mềm trực tuyến của Genscript (Rare Codon Analysis Tool).
2.2.2. Các phương pháp hóa sinh protein
Tinh chế protein bằng cột sắc kí ái lực Ni-NTA (Invitrogen)
và xác định độ sạch bằng Quantity One (Bio-Rad); định lượng
protein bằng Bradford (Bradford, 1976); xác định hoạt tính
endoglucanase trên cơ chất CMC (Miller, 1959) và trên giấy lọc theo
phương pháp của Camassola và cộng sự (2012) với một số cải biển
nhỏ; xác định hoạt tính cellulase trên đĩa thạch agar-CMC (Teather et

Họ
GH
GH1
GH3
GH5

GH8
GH9

Bảng 3.1. Tổng hợp các trình tự được chú giải mã hóa
cho các enzyme thủy phân cellulose dựa trên cơ sở dữ
liệu COG và KEGG
Số
Họ
Số
Module
Module
ORF
GH
ORF
GH1
16
GH16
GH16
33
GH3
198
GH16-CBM4
2
Fn3-GH3

10
GH9-Ig
30
14
GH9-CBM3
2
GH9-CBM37
1
GH9-dockerin
1


8
3.1.2. Đánh giá đa dạng cấu trúc của cellulase hoàn thiện có cấu
trúc module
Trong số 243 ORF mã hóa cellulase chứa cấu trúc module có
148 ORF có cấu trúc hoàn thiện (131 ORF chứa FN3, 17 ORF chứa
Ig). Trong đó, toàn bộ 17 ORF mã hóa endoglucanase GH9 có chứa
module Ig (Ig-GH9); 131 ORF hoàn thiện có chứa module FN3 thì
có 130 ORF (99,2%) mã hóa beta-glucosidase GH3 (GH3-Fn3) và
chỉ duy nhất 1 ORF mã hóa endoglucanase GH5 (Fn3-GH5). Module
FN3 đứng trước vùng xúc tác endoglucanase GH5 ở đầu N là cấu
trúc hiếm gặp cần được nghiên cứu để xác định vai trò của module
này đến hiệu quả thủy phân của enzyme.
3.1.3. Đánh giá đa dạng nguồn gốc các ORF mã hóa cellulase
Để hiểu rõ hơn về cộng đồng vi khuẩn và vai trò của chúng
trong quá trình tiêu hóa cellulose ở dạ cỏ dê Việt Nam, chúng tôi đã
xác định nguồn gốc của 816 ORF mã hóa cellulase. Trong đó, 221
ORF mã hóa cellulase đã được phân loại chủ yếu thuộc ngành
Bacteroidetes (153 ORF) và Firmicutes (53 ORF) với tỷ lệ tương

hình cho nghiên cứu vai trò của module
3.2.1. Khảo sát cấu trúc bậc 3 của trình tự chứa module FN3
Module FN3 trong cấu trúc của endoglucanase GH5 được phát
hiện là cấu trúc hiếm gặp so với cấu trúc phổ biến là module FN3 trong
beta-glucosidase GH3 được lựa chọn để nghiên cứu. Trình tự gen mã
hóa cho endoglucanase trưởng thành có kích thước 1545 nucleotit. Kết
quả so sánh tương đồng bằng BLASTN và phân loại bằng phần mềm
MEGAN cho thấy gen có nguồn gốc từ Ruminococcus bicirculans. Khi
so sánh trình tự amino acid của endoglucanase GH5 bằng BLASTP,
trình tự này có độ tương đồng 60% so với endoglucanase mã
CDC67342.1 của loài vi khuẩn phổ biến trong dạ cỏ dê là
Ruminococcus sp. CAG:57. Khảo sát vùng bảo thủ bằng SwissProt cho
thấy trình tự có độ tương đồng cao nhất (49%) so với khuôn của
endoglucanase 3pzt.1.A, với độ bao phủ là 53%, có cấu trúc monomer
và phối tử là Mn (Hình 3.7). Sử dụng công cụ Phyre2 cho thấy trình tự
có độ tương đồng cao nhất với khuôn


10
c3pzvB endoglucanase (độ tin cậy 100%), có vùng chức năng tách
biệt rõ ràng, vùng đầu N có cấu trúc FN3 tách biệt (Hình 3.8).

Mn

Hình 3.8. Khảo sát vùng bảo thủ
Hình 3.7. Khảo sát vùng
bảo thủ bằng SwissProt
bằng Phyre2
3.2.2. Khảo sát giá trị pI, pH của trình tự chứa module FN3
Trình tự mã hóa cho endoglucanase GH5 chứa module FN3

Các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc được khuếch
đại bằng PCR từ khuôn là pET22-XFn3Egc, sau đó được cắt bằng
cặp enzyme hạn chế NcoI + XhoI và nối vào vector pET22b(+) tạo
vector tái tổ hợp tương ứng. Các gen sau khi được đưa vào vector
biểu hiện đã được giải trình tự để kiểm tra và đưa vào biểu hiện trong
E. coli. Tuy nhiên, lượng protein được biểu hiện quá thấp và chủ yếu
nằm ở pha tủa. Do đó, chúng tôi đã chuyển các gen từ vector
pET22b(+) sang vector pETSUMO bằng enzyme hạn chế NcoI và
XhoI. Sau khi được nối ghép, các vector pET22SUMO-Fn3,
pET22SUMO-Egc, pET22SUMO-Fn3Egc, pET22SUMO-XFn3Egc
và pET22SUMO-XFn3 được biến nạp vào tế bào E. coli DH10B để
tách dòng gen. Các khuẩn lạc biến nạp được nuôi cấy trên môi
trường LBA để chọn các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp. Kết
quả cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn đơn lẻ, các plasmid đã
được cắt mở vòng và khi cắt bằng cặp enzyme giới hạn thì các gen
tương ứng được cắt ra có kích thước như tính toán. Như vậy, các
vector biểu hiện mang gen đã được thiết kế thành công.
3.4. Biểu hiện các gen trong tế bào E. coli
Sau khi khảo sát các điều kiện thích hợp cho biểu hiện,
chúng tôi tiến hành biểu hiện các chủng E. coli BL21 (DE3) mang
các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc trong môi trường LB có
bổ sung Amp, nhiệt độ biểu hiện 25oC, nồng độ chất cảm ứng 0,5
mM IPTD, thu mẫu sau 5 giờ cảm ứng. Kết quả kiểm tra bằng điện
di trên gel polyacrylamide cho thấy, ở pha tổng số cả 5 loại protein
đều được biểu hiện tốt, đúng kích thước theo tính toán. Các gen có


13
protein được biểu hiện chủ yếu ở pha tan trừ gen Egc không chứa
FN3 chỉ biểu hiện protein nằm ở pha tủa (Hình 3.18).

3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp tái tổ hợp và xác định hoạt tính
3.5.1. Tinh chế protein tái tổ hợp
Các protein tái tổ hợp được rửa ra hoàn toàn ở đệm thu mẫu
có nồng độ 400 mM imidazole. Kiểm tra bằng điện di đồ các phân
đoạn tinh chế protein cho thấy, trên bản gel chỉ xuất hiện duy nhất
băng có kích thước tương đương với protein đích cần tinh chế. Kết
quả đánh giá độ sạch bằng phần mềm Quantity One cho thấy các
protein tái tổ hợp sau tinh chế đều có độ sạch trên 99%.

Hình 3.20. Điện di đồ kiểm tra
sản phẩm trong các phân đoạn
tinh chế SFn3 (F1-F9)

Hình 3.22. Điện di đồ kiểm tra
sản phẩm trong các phân đoạn
tinh chế SFn3Egc (F1-F7)


15

Hình 3.24. Điện di đồ kiểm tra
sản phẩm trong các phân đoạn
tinh chế SXFn3Egc (F1-F10)

Hình 3.26. Điện di đồ kiểm tra
sản phẩm trong các phân đoạn
tinh chế SXFn3 (F1-F8)

3.5.2. Đánh giá hoạt tính của các protein sau tinh chế
3.5.2.1. Đánh giá hoạt tính riêng rẽ trên cơ chất CMC

nghĩa thống kê. Kết quả này chứng tỏ, SFn3 và SXFn3 khi được phối
trộn đã có tác dụng làm tăng hoạt tính thủy phân cellulose của
enzyme trên cơ chất giấy lọc. Vì SFn3 và SXFn3 không thể hiện
được hoạt tính cellulase nên các protein này chỉ có tác dụng hỗ trợ
giúp enzyme SXFn3Egc, SFn3Egc tăng khả năng thủy phân cơ chất.
Khả năng làm tăng hoạt tính enzyme trên cơ chất giấy lọc
của protein chứa module FN3 có thể do hai giả thiết sau: (1) module
FN3 có khả năng làm nới lỏng cấu trúc cellulose tinh thể của giấy
lọc, giúp enzyme tiếp cận dễ dàng hơn với sợi cellulose để thực hiện


17
phản ứng thủy phân; (2) module FN3 làm tăng ái lực với cellulose,
giúp enzyme bám dính tốt với cơ chất.

Hình 3.30. Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ và phối trộn của các protein
sau tinh chế trên cơ chất giấy lọc; ĐC +: Cellulase (Sigma)
3.5.3. Đánh giá khả năng FN3 tăng ái lực của enzyme với cơ chất
3.5.3.1. Cơ chất CMC
Hoạt tính cellulase của SXFn3Egc, SFn3Egc đều tăng trên
cơ chất CMC được xử lý hấp phụ trước với SFn3 và SXFn3 (Hình
3.31).Trên cơ chất được hấp phụ với SFn3 hoặc SXFn3, hoạt tính
của SXFn3Egc đều tăng mạnh hơn so với SFn3Egc. Hoạt tính của
SXFn3Egc và SFn3Egc trên cơ chất CMC được phản ứng hấp phụ
trước SFn3 tăng lần lượt là 31,5% và 23,8%. Tuy nhiên, hoạt tính
của 2 enzyme này trên cơ chất CMC được hấp phụ với SXFn3 chỉ
tăng lần lượt là 7,3% và 5,9%. Như vậy, SFn3 và SXFn3 có khả năng
thúc đẩy phản ứng của enzyme với cơ chất lên rõ rệt thông qua việc
làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất CMC.
Quan sát hình dạng của các băng protein trên bản gel không

không được xử lý hấp phụ. Từ kết quả này cho thấy, SFn3 và SXFn3
đã có quá trình hấp phụ trên bề mặt giấy lọc (đặc biệt là SFn3) làm
tăng hoạt tính của SXFn3Egc.

Hình 3.33. Đánh giá vai trò của SFn3 và SXFn3 khi hấp phụ trên cơ
chất giấy lọc đến hoạt tính của các protein SFn3Egc, SXFn3Egc; FP:
Giấy lọc (Whatman No. 1)
3.5.3.3. Đánh giá khả năng nới lỏng cấu trúc tinh thể trên bề mặt
giấy lọc
Trên ảnh chụp bề mặt giấy lọc ở độ phóng đại 500 lần và
1000 lần có thể quan sát thấy các sợi cellulose được nới lỏng và
không còn liên kết chặt chẽ với các sợi lân cận so với đối chứng âm
là mẫu không được xử lý với SFn3 hoặc SXFn3 (Hình 3.34). Ở độ


20
phóng đại 5000 lần, trên mẫu giấy lọc được xử lý với FN3, bề mặt
các sợi cellulose được phát hiện không còn nhẵn, trơn như mẫu
không xử lý. Như vậy, SFn3 và SXFn3 đã có tác động làm nới lỏng
bề mặt giấy lọc giúp cho phản ứng thủy phân cơ chất của enzyme
được thực hiện dễ dàng hơn.

Hình 3.34. Ảnh SEM cấu trúc và bề mặt các sợi cellulose của giấy
lọc (Whatman No. 1) không xử lý bởi SFn3 hoặc SXFn3 (hàng 1),
xử lý với SFn3 (hàng 2), xử lý với SXFn3 (hàng 3) ở các độ phóng
đại 500 lần (dãy A), 1000 lần (dãy B) và 5000 lần (dãy C)
3.5.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lên sự hấp phụ của SFn3 và
SXFn3 với cơ chất
Để nghiên cứu tăng khả năng hấp phụ của FN3 lên cơ chất
giấy lọc, qua đó làm tăng hoạt tính thủy phân cellulose của enzyme,

+

2+

2+

2+

2+

2+

,

3+

Mg , Ni , K , Co , Cu , Mn , Zn , Fe ) và 6 loại hóa chất
thường sử dụng là SDS (1%), urea (1 µM), 2-mercaptoethanol (1
µM), EDTA (1 µM), tween 80 (1mM), triton X-100 (1 µM) cho thấy
chỉ có Mn2+ ở nồng độ 10 mM làm tăng hoạt tính của enzyme nhưng
không đáng kể (108%). Khi tăng nồng độ Mn 2+ lên 20 mM, 30 mM,
40 mM thì hoạt tính tương đối của enzyme tăng tương ứng so với đối
chứng là 202%, 215%, 222%.
3.6.5. Đặc điểm động học của XFn3Egc
Kết quả động học của enzyme SXFn3Egc được xác định có
giá trị Km đạt 1,26 mg/ml và Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml.


22
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5. Hoạt tính endoglucanase của SXFn3Egc tăng lên 2 lần
khi sử dụng 40 mM Mn 2+ và giảm khi bổ sung các ion Ca 2+, Mg2+,
Ni2+, K+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+ với nồng độ cuối cùng là 10 mM và
6 loại hóa chất thường sử dụng là SDS (1%), urea (1 µM), 2mercaptoethanol (1 µM), EDTA (1 µM), tween 80 (1mM), triton X100 (1 µM).
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu đánh giá vai trò của các module FN3 và
các module chưa rõ chức năng khác như Ig, X trong cấu trúc của
cellulase có cấu trúc module để tiến tới sản xuất hỗn hợp các enzyme
phù hợp với loại từng loại cơ chất và mục đích sử dụng nhằm ứng
dụng trong xử lý môi trường và sản xuất nhiên liệu sinh học.