BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGUYỄN CẨM HÀ
NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG
SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM
NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE,
MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM
LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC
Hà Nội - Năm 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGUYỄN CẨM HÀ
NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG
thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nguyễn Hoàng Ngân- Học
viện Quân Y, đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm,
phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý của squalene.
Luận án được thực hiện trong khuôn khổ các đề tài Quỹ Phát triển Khoa học và
Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu đánh giá và
khai thác chất squalene làm dược phẩm từ vi tảo biển của Việt Nam” (2013-2016) do
PGS. TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm, đề tài “Cơ chế điều hòa trao đổi lipid của
các hợp chất từ thực vật biển Việt Nam trong phòng và điều trị bệnh gan nhiễm mỡ
không do rượu” (2014-2016) và đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi trồng lượng lớn sinh khối tảo
Schizochytrium mangrovei PQ6 và tách chiết qualene đủ tiêu chuẩn nguyên liệu làm
thực phẩm chức năng” (2014-2016) do TS. Hoàng Thị Minh Hiền làm chủ nhiệm.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn
ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình.
Hà Nội, ngày tháng
năm 2020
Tác giả
Nguyễn Cẩm Hà
ii
Lời cam đoan
Tôi xin cam Ďoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần Ďã
Ďược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự Ďồng ý và cho phép
Danh mục các bảng…………………………………………………….............
xi
Danh mục các hình vẽ, Ďồ thị…………………………………………………..
xii
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….
1
Chƣơng 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………....
4
1.1.
Giới thiệu chung về squalene…………………………………..
4
1.1.1.
Tính chất hóa lý của squalene…………………………………...
4
1.2.1.
Công nghệ tách chiết squalene………………………………….
21
1.2.2.
Các phương pháp Ďịnh lượng và tinh sạch squalene………….....
27
1.3.
Giới thiệu công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng………
29
1.4.
Giới thiệu về chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium……….
33
1.4.1
Đặc Ďiểm chung của chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium….
33
Vật liệu………………………………………………………….
43
2.1.1.
Mẫu vật…………………………………………………………..
43
2.1.2.
Các bộ kít sinh phẩm…………………………………………….
44
2.1.3.
Động vật thí nghiệm……………………………………………..
45
2.1.4.
Các dòng tế bào………………………………………………….
46
2.1.5.
48
Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh
khối khô…………………………………………………………………
48
2.2.1.2.
Phương pháp chụp ảnh hình thái……………………………….......
49
2.2.1.3.
Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối
tảo………………………………………………………………………..
49
2.2.1.4.
Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red…………………………..
49
2.2.1.5.
Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA……………………
sinh
khối
S.
mangrovei
PQ6………………………………………………………………………
2.2.2.2.
50
53
Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch
squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. mangrovei
PQ6………………………………………………………………………
2.2.2.3.
55
Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của
squalene.. .....................................................................................
56
v
Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác
dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6
trên mô hình in vitro…………………………………………………..
59
2.2.5.
Thống kê phân tích số liệu………………………………………
63
2.2.6.
Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu……………
63
Chƣơng 3.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN….…………….
65
3.1.
Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm năng sản xuất
squalene…………………………………………………………
3.2.
lượng squalene ở cấp độ bình tam giác ……………………………
3.2.1.3
67
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene
ở cấp độ bình tam giác………………………………………………..
3.2.1.2.
67
Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 cho sản xuất
squalene ở cấp Ďộ bình tam giác…………………………………
3.2.1.1.
65
73
Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên
men 30 lít Ďể thu sinh khối tảo giàu squalene…………………...
75
vi
3.2.2.1.
squalene của chủng S. mangrovei PQ6………………………….
3.3.
77
86
Tối ưu Ďiều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ
S. mangrovei PQ6………………………………………………..
86
3.3.1.1.
Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6………....
86
3.3.1.2
Tách chiết lipid không xà phòng hóa từ lipid tổng số…………….
90
3.3.1.3.
Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc
ký lỏng cao áp………………………………………………………….
3.3.2.3.
Điều kiện tinh chế squalene bằng phương pháp sắc ký cột……...
98
3.3.2.4.
Xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene
từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6………………………………
101
3.3.3.
Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S.mangrovei PQ6...
103
3.3.4.
Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim
loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6……………….
3.4.
Tính an toàn và tác dụng dƣợc lý của squalene tách chiết từ
105
3.4.2.3.
108
Ảnh hưởng của squalene lên tình trạng chung và sự thay đổi thể
trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày…………………….
3.4.2.2.
107
Độc tính bán trường diễn của squalene trên mô hình Ďộng vật
thực nghiệm……………………………………………………...
3.4.2.1.
107
114
Bƣớc đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của
squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in
vitro……………………………………………………………...
117
3.5.1.
Đánh giá Ďộc tính của squalene trên các dòng tế bào……………
121
Tác dụng giảm triglyceride của squalene tách chiết từ S.
mangrovei PQ6…………………………………………………..
125
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………...
127
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ………………………………
129
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………
131
PHỤ LỤC
viii
Q111`DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ
Từ viết tắt
Tên tiếng Việt
ATP
Adenosine triphosphate
Adenosine triphosphate
CCT
Chuột cống trắng
Chuột cống trắng
CNT
Chuột nhắt trắng
Chuột nhắt trắng
CYP7A1
Cholesterol 7a- hydroxylase
Cholesterol 7a- hydroxylase
DHA
Docosahexaenoic acid
Axít docosahexaenoic
1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate
1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate
EN
Ectoplasmic net
Mang lưới ngoại chất
ER
Endoplasmic reticulum
Màng lưới nội chất
EPA
Eicosapentaenoic acid
Acid eicosapentaenoic
FAS
Fatty acid synthase
Fatty acid synthase
ix
GPP
Geranyl diphosphate
Geranyl diphosphate
HDL-C
high
density
lipoprotein- cholesterol gắn với lipooprotein tỷ
cholesterol
trọng cao
HMG-CoA 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA
HMGR
3 - hydroxyl - 3 - methylglutaryl 3 - hydroxyl - 3 - methylglutaryl
coenzyme A reductase
HPLC
3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA
High
thực nghiệm
LDL-C
Low density liporotein-cholesterol
Cholesterol gắn với lipoprotein tỷ
trọng thấp
LDL-R
Low density lipoprotein - receptor
Thụ thể lipoprotein có tỷ trọng
thấp
LXR
Liver X receptor
Thụ thể gan X
MĐTB
Mật Ďộ tế bào
Mật Ďộ tế bào
x
ORO
Oil Red O
Oil red O
PA
Palmitic acid
Palmitic acid
PBS
Phosphate buffered salina
Muối Ďệm phosphate
PCR
Polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
PUFA
Polyunsaturated fatty acid
Axít béo không bão hòa Ďa nối Ďôi
TG
Triglycerid
Triglycerit
TBNF
Terbinafine
Terbinafine
TBS
Tris-buffered saline
Tris-buffered saline
TLC
Thin layer chromatography
Sắc ký lớp mỏng
VLDL-C
Very low density-cholesterol
Cholesterol gắn với lipoprotein tỷ
trọng rất thấp
Các phương pháp tách chiết squalene từ nguồn tự nhiên……………..
24
Bảng 1.5.
Sự phân loại của lớp Labyrinthulea Ďược Ďiều chỉnh từ các nghiên của
Anderson và Cavalier-Smith (2012), Gomaa và cộng sự (2013),
Beakes và cộng sự, (2014)…………….................................................
35
Bảng 2.1.
Danh sách các chủng thuộc chi Schizochytrium và Thraustochytrium..
44
Bảng 2.2.
Trình tự các cặp mồi Ďược sử dụng trong phản ứng qPCR…………..
45
Bảng 2.3.
Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu…………………
63
91
Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene
tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6……………………………..
106
Bảng 3.6.
Độc tính cấp theo Ďường uống của squalene trên chuột nhắt trắng…...
107
Bảng 3.7.
Ảnh hưởng của squalene lên thể trọng chuột cống trắng……………...
109
Bảng 3.8.
Ảnh hưởng của squalene lên một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa
trong máu chuột………………………………………………………..
109
Bảng 3.9.
Ảnh hưởng của squalene lên nồng Ďộ HDL-C máu chuột…………….
bào tan và MEP ở lạp thể (B)………………………………………….
Hình 1.3
7
Sinh tổng hợp squalene thông qua con Ďường MEP ở vi khuẩn E. coli
(A). Sinh tổng hợp squalene ở nấm men Sacchacromyces cerevisae
(B)…………………………………………………………………
Hình 1.4.
Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và DHA ở
Thraustochytrids……………………………………………………….
Hình 1.5.
76
Hình thái của S. mangrovei PQ6 khi nuôi trồng ở các nồng Ďộ glucose
ban Ďầu khác nhau dưới kính hiển vi quang học (Ďộ phóng Ďại x400).
Hình 3.9.
74
Ảnh hưởng của các nồng Ďộ glucose khác nhau lên sinh trưởng (A-B)
và hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6.............................
Hình 3.8.
Ảnh hưởng của nồng Ďộ cao nấm men lên sinh trưởng (A) và hàm
lượng squalene (B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau ...............................
Hình 3.3.
64
Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ lên sinh trưởng (A) và hàm lượng squalene
(B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau……………………………………
Hình 3.2.
41
Sơ Ďồ thí nghiệm nghiên cứu squalene tách chiết từ S. mangrovei
PQ6…………………………………………………………………….
Hình 3.1.
9
Các hệ thống bình lên men 5 lít, 10 lít, 30 lít và 150 lít cho nuôi trồng
vi tảo biển dị dưỡng S. mangrovei PQ6…..……………………………….
Hình 2.1.
8
Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối
Hình 3.13.
82
Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai Ďoạn nuôi cấy của quá trình lên
men fed-batch. A- Trước thời Ďiểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ
sung glucose lên 22%.............................................................................
Hình 3.14.
85
Ảnh hưởng của các yếu tố dung môi (A), nhiệt Ďộ (B), thời gian (C),
số lần chiết (D) tỷ lệ sinh khối/dung môi (E), chế Ďộ khuấy trộn (G),
nhiệt Ďộ sấy sinh khối (H), Ďộ ẩm sinh khối (I) lên hiệu suất tách chiết
lipid .........................................................................................................
Hình 3.15.
Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc ký Ďồ
squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B) .....................................
Hình 3.16.
93
Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.
mangrovei PQ6......................................................................................
Hình 3.19.
xiv
Ďộ ẩm khác nhau. (B) Hàm lượng squalene thô thu Ďược sau quá trình
chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%. (C) Hàm lượng squalene có
mặt trong squalene thô thu Ďược sau quá trình chiết từ sinh khối có Ďộ
ẩm 20 và 100%.......................................................................................
Hình 3.21.
Ảnh hình thái tế bào S. mangrovei PQ6 sau 0 h (A), 2 h (B), 4 h (C)
và 6 h (D) có bổ sung KOH 45% và duy trì pH=10...............................
Hình 3.22.
96
97
Hàm lượng squalene thô (A) và squalene có mặt trong squalene thô
(B) tách chiết từ sinh khối khô và dịch lên men tế bào S. mangrovei
PQ6.........................................................................................................
Hình 3.23.
Sắc ký lớp mỏng xác Ďịnh squalene từ mẫu chuẩn và mẫu squalene
thô của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau......................
Hình 3.24.
98
Sắc ký Ďồ HPLC của squalene chuẩn (A) và squalene tinh sạch từ
sinh khối S. mangrovei PQ6 (B)………………………………………
Hình 3.29.
Phổ 1H (A) và
13
104
C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.
mangrovei PQ6……………………………………………………………….
Hình 3.30.
103
104
Hình ảnh Ďại thể và mô bệnh học vi thể - tương ứng (HE, x 400) của
gan, thận, lách chuột tương ứng sau 60 ngày uống thuốc lô Ďối chứng
(a, d, g, k), lô thí nghiệm 1 (b, e, h, l) và lô thí nghiệm 2 (c, f, i, m)….
Hình 3.31.
114
Tỷ lệ sống sót của tế bào HepG2 và RAW246.7 Ďược ủ với squalene
Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện mRNA của các gen
tham gia vào các quá trình trao Ďổi cholesterol trong tế bào HepG2 .....
Hình 3.36.
121
Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện gen của LXR α (A) và
LXR β (B) trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7……………………..
Hình 3.37.
120
122
Squalene Ďiều hòa quá trình vận chuyển ngược cholesterol và mức Ďộ
biểu hiện các gen Ďích của LXRs trong tế bào Ďại thực bào
RAW264.7…………………………………………………………….
Hình 3.38.
Ảnh hưởng của squalene trong quá trình sinh tổng hợp triglyceride
trong tế bào HepG2 ................................................................................
Hình 3.39.
124
125
vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả
năng tăng cường hoạt Ďộng của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm chức năng
có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) Ďã Ďược chứng minh là cần thiết
cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm Ďáng kể bệnh tim mạch và ung
thư vì vậy, chúng cũng Ďược dùng phổ biến trong dược phẩm.
Cho Ďến nay, các nguồn sản xuất squalene Ďược biết Ďến nhiều nhất là các
loại dầu Ďộng, thực vật. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng Ďến sự
bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ thuộc vào thổ nhưỡng,
mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn Ďến nguồn khai thác squalene Ďang dần
cạn kiệt. Trong khi Ďó, hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu
cầu về squalene làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm
Ďang ngày càng tăng.
Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế
nguồn truyền thống Ďể tách chiết squalene là rất cần thiết và Ďang Ďược các nhà
khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong Ďó, vi sinh vật nói chung
và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô
2
lớn. Gần Ďây một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids
Ďược xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao
trong Ďó có squalene. Tuy nhiên việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới Ďược bắt
Ďầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban
Ďầu về hàm lượng squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có Ďược các phương pháp
tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene; chưa có Ďược Ďiều kiện nuôi
trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene cao;
chưa có Ďược quy trình công nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo
Ďảm an toàn cho sử dụng theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ
sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện Ďề
mẻ có bổ sung cơ chất là 6,9 g/L); lựa chọn Ďược Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết,
làm sạch squalene từ chủng PQ6 có Ďộ tinh sạch Ďạt 90- 95%; squalene tách chiết
Ďược là an toàn, có tác dụng làm giảm cholesterol tổng số và làm tăng hàm lượng
lipoptrotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol ở mô hình Ďộng vật thực nghiệm,
Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.
- Lần Ďầu tiên ở Việt Nam Ďã chứng minh Ďược squalene tách chiết từ S.
mangrovei PQ6 có tác dụng giảm cholesterol do tăng Ďiều hòa biểu hiện của các gen
tham gia vào quá trình hấp thu, vận chuyển, lưu thông cholesterol từ các mô ngoại
biên Ďến tế bào gan; bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm triglyceride của
squalene.
5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
- Có Ďược những dẫn liệu khoa học về Ďiều kiện nuôi trồng thích hợp của
chủng S. mangrovei PQ6 phân lập Ďược từ huyện Ďảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang
vào năm 2006-2008 (lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất glucose 22% vào môi
trường nuôi tại 36 h; bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45g/L; vitamin B6
- 45 g/L; và vitamin B12- 0,25g/L)) cho sinh trưởng Ďạt sinh khối khô (75,41±1,35)
g/L, hàm lượng squalene Ďạt (91,53±2,45) mg/g sinh khối khô, sản lượng squalene
Ďạt 6,9 g/L.
- Có Ďược quy trình tách chiết lượng lớn squalene từ chủng S. mangrovei
PQ6 có Ďộ tinh sạch cao 90- 95%, an toàn và Ďạt tiêu chuẩn Ďảm bảo chất lượng
Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược
phẩm.
- Góp phần làm sáng tỏ squalene tách chiết từ chủng PQ6 có tác dụng giảm
cholesterol và tryglycerol nội bào, tăng hàm lượng cholesterol gắn với lipoprotein
có tỷ trọng cao, HDL-C và tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần trong máu; giảm
cholesterol gắn với LDL-C và VLDL-C trong máu mà không gây ảnh hưởng Ďến sự
phát triển cân nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride ở mô hình
tế bào và Ďộng vật thực nghiệm; bước Ďầu Ďã cung cấp cơ sở khoa học cho việc Ďịnh
Chỉ số Iod
Các Ďỉnh hồng ngoại
Sức căng bề mặt
Khả năng hòa tan của squalene trong nước
Giá trị
410,7 g/mol
-75oC
1,499
12 cP
0,858 g/mL
285oC
110oC
381 g/100g
2728, 1668, 1446, 1380, 1150, 1180,
964, 835 cm-1
~ 32 mN/m
0,124 mg/L
1.1.2. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene
Squalene Ďược phát hiện vào năm 1096 bởi nhà nghiên cứu người Nhật, TS.
Mitsumaru Tsujimoto, một chuyên gia về dầu và chất béo tại trạm kiểm Ďịnh Công
nghiệp Tokyo. Ông Ďã phân tách phần không xà phòng hóa từ dầu gan cá mập
“kuroko - zame” và khám phá ra sự tồn tại một lượng lớn hydrocacbon không bão
hòa. Tại thời Ďiểm Ďó, TS. Mitsumaru Tsujimoto không phân tách Ďược hợp chất
này. Tuy nhiên, ông Ďã thu Ďược thành phần bromine dưới dạng bột màu trắng,
phân hủy ở 155oC, trong Ďó chứa 26,93% C, 3,94% H và 69,28% Br. Ông Ďưa ra
5
chứng minh squalene ở nồng Ďộ 6 % Ďã làm thay Ďổi cấu trúc lục giác bằng cách
tăng kích thước của các ống lục giác ngược. Trong trường hợp này cấu trúc
squalene Ďược cuộn lại và tích lũy trong lớp màng lipid kép (là màng hay một vùng
của màng chứa các phân tử lipid) [10]. Các thí nghiệm này cho thấy squalene trong
màng lưới nội chất có thể thích ứng với một dạng cấu trúc gần giống với ergosterol
trong khi cấu trúc cuộn trong màng huyết tương có thể chiếm ưu thế.
1.1.3. Các con đường sinh tổng hợp của squalene ở động vật, thực vật và vi sinh vật
Squalene là một hợp chất trung gian trong tổng hợp các hopanoid,
phytosterol và hơn 200 triterpenes quan trọng cho màng tế bào [11]. Squalene Ďược
tổng hợp từ các Ďơn vị isopentenyl, iso pentenyl di-phosphate (IPP) thông qua con
Ďường mevalonate (MVA) và dimethyl-allyl-diphosphate (DMAPP) thông qua con
Ďường methylerytritol phosphate (MEP) [12, 8]. Sự tổng hợp squalene thông qua
con Ďường MVA bắt Ďầu với sự kết hợp của một acetyl-CoA với một acetyl-CoA
khác bởi acetoacetyl-CoA synthase. Enzyme này Ďược gọi là transferyl acetyl-CoA
hoạt Ďộng từ sự hình thành của acetoacetyl-CoA. Chuỗi phản ứng từ acetoacetyl
CoA Ďến mevalonate tiếp tục tạo thành 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA (HMGCoA) với sự có mặt của adenosine triphosphate (ATP) Ďể tạo thành mevalonate 5phosphate [13]. Sau Ďó, tiếp tục phosphoryl hóa bởi phosphomevalonate kinase với
sự hiện diện của ATP Ďể tạo thành mevalonate 5-diphosphate. Tiếp theo,
decacboxyl hóa bằng decarboxylase 5-diphosphate mevalonate Ďể tạo thành IPP, từ
Ďây nó là chất cơ bản Ďể xây dựng các hợp chất polyprenyl. DMAPP sau Ďó Ďược
tạo thành bằng cách Ďồng phân hóa IPP thông qua isopentanyl diphosphate
isomerase. Phản ứng ngưng tụ của IPP với DMAPP khi có mặt của farnesyl
diphosphate synthase Ďã tạo thành geranyl diphosphate (GPP) và sau Ďó có quá trình
ngưng tụ tiếp tục với một IPP khác Ďể tạo thành farnesyl diphosphate (FPP). Cuối
cùng, squalene synthase Ďược xác Ďịnh là enzyme xúc tác cho sự hình thành gián
tiếp NADPH của squalene với FPP là cơ chất [14, 15, 11]. Sinh tổng hợp squalene
thông qua con Ďường MEP do sự kết hợp của hai phân tử FPP. Quá trình sinh tổng
hợp ở các vi sinh vật này bắt Ďầu bằng sự hình thành 1- deoxy-D-xylulose-5-
isofucosterol. Trong thực vật, squalene bị oxy hóa thành 2,3-oxidosqualene và sau
Ďó Ďược chuyển Ďổi thành cycloartenol (9b, 19-cyclo-24-lanosten-3b-ol) thay vì
lanosterol Ďược biết ở Ďộng vật và nấm. Isoprenoid của thực vật có thể Ďược tổng
hợp thông qua con Ďường MVA trong phần bào tan (cytosol) dẫn Ďến sự hình thành
của sterol và brassinosteroids hoặc trong ty thể - nơi chuỗi ubiquinone Ďược hình
thành [16]. Ngoài ra, con Ďường MEP, trước Ďây Ďược gọi là con Ďường không
mevalonate hoặc DXP, Ďược xảy ra ở lạp thể (plastid) dẫn Ďến sự tổng hợp
carotenoids, chuỗi bên của chlorophyll, plastoquinone và phytohormone dạng
isoprenoid (Hình 1.2B).
Con đường sinh tổng hợp squalene ở vi sinh vật [8]
Sự tổng hợp squalene ở vi sinh vật khác nhau là khác nhau và tùy theo loài.
Các vi sinh vật nhân sơ (như E. coli) hay sinh vật nhân chuẩn (như Saccharomyces
cerevisea, Torulaspora delbrueckii và Chlamydomonas reinhardtii) sản xuất
squalene thông qua con Ďường MEP bởi sự kết hợp của hai phân tử FPP. Quá trình
sinh tổng hợp ở các vi sinh vật này bắt Ďầu bằng sự hình thành 1- deoxy-Dxylulose-5-phosphate (DXP) trong Ďó DXP-synthase và các enzyme khác tham gia
Ďể hình thành IPP và DMAPP. Các bước còn lại từ IPP Ďến FPP giống hệt với con
Ďường MVA. Không giống như con Ďường MVA, con Ďường MEP thường là không
tạo ra squalene, nhưng với những tiến bộ Ďạt Ďược về kỹ thuật trao Ďổi chất và sinh
tổng hợp Ďã cho phép tạo ra một gen mã hóa cho squalene synthase dị hợp có thể
mở rộng con Ďường MEP Ďể tạo ra squalene.
Như vậy, con Ďường MEP xảy ra chủ yếu ở vi khuẩn có nhân thật
(eubacteria) và vi khuẩn lam (cyanobacteria), trong khi MVA Ďược tìm thấy trong
vi khuẩn cổ (archaea) và một số ít eubacteria. Nhiều nghiên cứu Ďã xác Ďịnh vai trò
của sterol trong các tế bào nhân chuẩn Ďã Ďược thực hiện với nấm men như một hệ
thống mô hình nhân chuẩn. Ảnh hưởng của sterol Ďến Ďộ bền màng, tính thấm của
màng, sử dụng nguồn năng lượng và hoạt Ďộng của ATPase gắn màng Ďã Ďược
nghiên cứu bằng cách sử dụng các nấm men Ďột biến có khiếm khuyết ở con Ďường
Copyright: Tài liệu đại học ©