ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đồ án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của:
Thạc Sĩ Hoàng Mỹ Dung - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp
HCM - đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các vấn đề liên quan và cung cấp một số tài
liệu có ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án.
Tất cả các thầy cô giáo - Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp
HCM - đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đồ án.
Các bạn sinh viên lớp HC06BSH - Đại học Bách Khoa Tp HCM - đã cùng học tập,
trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc.
Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành!
Mục Lục
SVTH: Nguyễn Thị Hương i
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Mục Lục .............................................................................................................................................................. i
Danh Mục Hình ................................................................................................................................................. iii
......................................................................................................................................................................... iii
Lời Mở Đầu .................................................................................................................................................... iv
I.Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei .................................................................................................... 1
1.Lịch sử phát hiện ....................................................................................................................................... 1
2.Đặc điểm sinh học của nấm mốc T.reesei ................................................................................................. 2
2.1.Vị trí phân loại ..................................................................................................................................... 2
2.2.Đặc điểm hình thái ............................................................................................................................. 3
3.Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ......................................................................................................................... 5
3.1.Đặc điểm sinh thái .................................................................................................................................. 5
3.2.Môi trường sống ..................................................................................................................................... 5
3.3.Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh ................................................................................................. 6
3.4.Môi trường nhân sinh khối ..................................................................................................................... 6
4.Khái niệm kiểm soát sinh học của Trichoderma ....................................................................................... 6
5.Một số nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma ................................................................................... 7
5.1.Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng ........................................................... 7
Danh Mục Hình
SVTH: Nguyễn Thị Hương iii
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Lời Mở Đầu
Cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện nay, có
khoảng từ 60 đến 90 tỷ tấn hàng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại
polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,....). Ở cấp độ
sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu
không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái.
Những năm gần đây, nguồn năng lượng hóa thạch ngày càng cạn kiệt. Dưới
áp lực trên, nguồn năng lượng tái tạo đang được các quốc gia quan tâm Việc sử
dụng cellulase của Trichoderma reesei để chuyển hóa nguyên liệu giàu cellulose
thành ethanol đang được nghiên cứu và áp dụng. Việt Nam có nguồn sinh khối tự
nhiên dồi dào. Thêm vào đó, nước ta là một nước nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm
nông nghiệp phong phú và đa dạng.
Enzym Cellulase là một phức hệ enzym có tác dụng thuỷ phân cellulose
thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucosid trong cellulose tạo ra sản phẩm
glucose cung cấp cho công nghiệp lên men. Nguồn thu enzym cellulase lớn nhất
hiện nay là vi sinh vật. Trong đó, vi nấm Trichoderma là nguồn thu enzyme
cellulase quan trọng vì enzyme có hoạt tính khá cao.
Mục đích của đề tài này là tìm hiểu gen qui định enzyme cellulase và một số
phương pháp nâng cao khả năng phân hủy cellulose. Để từ đó, giải quyết được
những vấn đề “nóng” ở Việt Nam và trên thế giới
SVTH: Nguyễn Thị Hương iv
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
PHẦN 1: TỔNG QUAN
I. Giới thiệu về nấm mốc Trichoderma reesei
1. Lịch sử phát hiện
Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết
ngành Dikarya, Chytridiomycota được xếp vào một dưới ngành riêng biệt, ngoài ra một số
Chytridiomycota và Zygomycota được xếp ngoài bảng phân loại .
Bảng 1 1: Bảng hệ thống phân loại giới nấm
Theo hệ thống phân loại theo Giáo trình nấm học CBS. ( CBS Course of
Mycology) , lần xuất bản thứ 4, Baarn, Delft, 1998, phân loại Trichoderma như sau:
SVTH: Nguyễn Thị Hương 2
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Lớp: Ascomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Hypocreaceae
Giống: Trichoderma
Loài: Trichoderma reesei
2.2. Đặc điểm hình thái
Trichoderma là những sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong
chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn
nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là
5-10 µm).
Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhóm
phát triển thành 1 khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết
với nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử cùa Trichoderma, có màu xanh
đặc trưng, nhưng cũng có thể là màu trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài, bào tử luôn
đơn bào, bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn.
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc
sợi nấm sinh trưởng mạnh, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào
dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào
thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoắn lại,
người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome).
Nhân tế bào chứa hạch nhân (nucleolus) được bao bọc bởi màng nhân có nhiều lỗ
T.reesei là một loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử khuẩn ty.
T.reesei có tốc độ phát triển nhanh chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4
ngày nuôi cấy ở 20
0
C. Chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 25
0
C-30
0
C, chậm ở 35
0
C-37
0
C. Ở
35
0
C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép
bất thường. Trong khi ở 37
0
C, bào tử không xuất hiện sau 7 ngày nuôi cấy.
3.2. Môi trường sống
Trichoderma là nhóm vi nấm phổ biến ưa ẩm. Hầu hết chúng là vi sinh vật hoại
sinh, nhưng cũng có khả năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy
thực vật sống và không sống nội kí sinh với thực vật. chúng có mặt khắp mọi nơi trừ
những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm
SVTH: Nguyễn Thị Hương 5
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
hoặc cận nhiệt đới là khu rừng ôn đới hay rừng phương Bắc. Nhu cầu nhiệt độ tối đa của
môi trường sống đặc trưng cho từng loài.
Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid và Trichoderma sử dụng nhiều
nguồn thức ăn khác nhau từ cacbohydrat, amoni acid đến ammonia.
quan tâm nhiều nhất là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số
nấm gây bệnh ở thực vật. Các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều loại Trichoderma khác để
kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác. Kết quả các loại Trichoderma kiểm soát hiệu quả
các nấm gây bệnh. Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang được ứng dụng rất
rộng rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học hiện nay ở Việt Nam. Phân hữu cơ
sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là lọai phân có tác dụng rất tốt
trong việc phòng trừ các bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi là bệnh thối rễ do nấm
Phytophthora palmirova gây ra. Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm do
một số nấm bệnh gây ra: Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium rolfosii ….
SVTH: Nguyễn Thị Hương 7
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hình 1 3: Chế phẩm enzyme trichoderma được bổ sung vào phân lân vi sinh sản xuất ở
công ty Điền Trang.
Cải thiện năng suất cây trồng : (kích thích sự tăng trưởng của cây trồng)
Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua
bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự
hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường. Những cơ chế
giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây.
Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số
lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) giúp khả năng hút chất ding dưỡng .Ngoài ra,
những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán.
Hình 1 4 Tăng cường rễ phát triển trong lĩnh vực trồng ngô và đậu tương của dòng T.
harzianum T-22 [G. E. Harman, Cornell University, Geneva].
5.2. Trong lĩnh vực xử lý môi trường
Xử lý các phế phẩm nông nghiệp:
SVTH: Nguyễn Thị Hương 8
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Chế phẩm sinh học nấm đối kháng Trichoderma ngòai tác dụng sản xuất phân bón
hữu cơ sinh học, hay sử dụng như một lọai thuốc bảo vệ thực vật thì còn có tác dụng để xử
lý ủ phân chuồng, phân gia súc, vỏ cà phê, chất thải hữu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu cơ rất
và ngành dệt cho các mục đích tương tự .
6. Khả năng ứng dụng ở Việt Nam
Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho
thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng
Sông Cửu long và Đông nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả
năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá
chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii,
Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là
khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta
đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình
phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng
dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của
SVTH: Nguyễn Thị Hương 10
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Công ty Anh Việt (TP. Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai)
đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan
nghênh và ứng dụng hiệu quả .
II. Khả năng phân hủy cellulose ở Trichoderma reesei:
1. Cellulose:
1.1. Cấu trúc:
Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích β-D-
Glucose, có công thức cấu tạo là (C
6
H
10
O
5
)
n
gỗ, thưc vật dưới nước (tảo, rong,…),sản phẩm phụ phẩm nông nghiệp ( rơm, rạ, lõi
ngô,…).
SVTH: Nguyễn Thị Hương 12
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Hình 1 8: Hình ảnh mô tả cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật
[bởi Michael W. Davidson ]
SVTH: Nguyễn Thị Hương 13
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Bảng 1 2: Thành phần cellulose có trong một số loài thực vật
SVTH: Nguyễn Thị Hương 14
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
2. Cellulase:
II.1. Cấu trúc:
Cellulase có 2 vùng chức năng: trung tâm xúc tác và trung tâm tạo liên kết với cellulose.
Hai vùng chức năng này nối kết với nhau thông qua vùng không xúc tác [5].
Hinh 1 9: Cấu trúc không gian 3 chiều của enzyme cellulase (Ngân hàng dữ liệu
protein, cấu trúc 1JS4)
Trung tâm xúc tác là vị trí diễn ra hoạt động phản ứng xúc tác tạo phản ứng. Thông
thường cellulose chứa duy nhất 1 trung tâm xúc tác, ngoại trừ một số trường hợp đặc biệt.
Trung tâm tạo liên kết với cellulose tạo liên kết bền vững với cellulose. Đơn vị chức
năng này giữ vai trò chủ đạo trong quá trình định hướng cơ chất là cellulose đến trung tâm
xúc tác của cellulase. Bên cạnh đó, một số cellulose cũng tham gia vào quá trình xúc tác
bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạng tinh thể. Một số khác lại có xu hướng
liên kết với cellulose vô định hình thay vì cellulose dạng tinh thể [6].
Trung tâm tạo liên kết với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặc trưng cho
enzyme thủy phân cellulose mà nó còn cấu thành tiểu đơn vị xúc tác cấu trúc cellulosome.
SVTH: Nguyễn Thị Hương 15
ĐỒ ÁN MÔN HỌC GVHD: ThS.HOÀNG MỸ DUNG
Trung tâm tạo liên kết với cellulose liên kết thuận nghịch với cellulose nên nó được ứng
dụng trong công nghệ sản xuất protein [7].
Cellulase Cơ chất Cơ chế Sản phẩm
Endo-cellulase
Cellulose kết tinh
Cellulose vô định
hình
Cắt liên kết giữa
các chuỗi
cellulose
Chuỗi đơn cellulose
Exo-cellulase
(cellobiohydrolase)
Chuỗi đơn
cellulose
Cellulose kết tinh
Cắt liên kết nội
chuỗi (1 vị trí cắt
sau 2-4 glucose)
Tetrasaccharides,
disaccharides
Cellobiase
Tetrasaccharides,
disaccharides
Cắt liên kết
glycoside giữa 2
glucose
Monosaccharide
Bảng 1 3: Bảng phân loại cellulase [8, 9]
Endo-cellulase (E.C.3.2.1.4) hay 1,4-β-D-glucan 4 glucanohydrolase tham gia phân
giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose. Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose
vô định hình tác động yếu đến cellulose kết tinh.
II.4. Hệ thống cellulase ở Trichoderma reesei :
Nhiều loại vi nấm có khả năng sản sinh enzyme phân hủy cellulose. Đó là các loại
nấm mùn mềm, nấm mùn nâu, nấm mùn trắng, nấm kỵ khí trong dạ dày loài ăn cỏ...
Các loại nấm tạo ra mùn mềm chủ yếu phân hủy polysaccharide. Trong nhóm nấm
này, khả năng sinh sản các enzyme phân hủy cellulose cũng khác nhau. Loài nấm có khả
năng sinh sản hàng loạt enzyme phân hủy cellulose và được nghiên cứu kỹ là T. viride
(reesei).
SVTH: Nguyễn Thị Hương 21
Copyright: Tài liệu đại học ©