1
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cuộc sống ngày càng hiện đại, số lượng người bị các chứng béo phì và các
bệnh về tiêu hóa cũng ngày một nhiều hơn. Đó là hậu quả của việc sử dụng “fast food”
- thức ăn nhanh và những loại thực phẩm quá nhiều chất béo. Do đó, vấn đề đặt ra là
cần phải có một loại thực phẩm năng lượng thấp, không lipid, lại giúp kích thích sự
tiết thực để hạn chế phần nào các nguy cơ bệnh trên, mà vẫn phải thơm ngon, hấp dẫn
đối với người tiêu dùng. Thạch dừa – Nata de Coco là một ví dụ.
Thạch dừa thực chất là sinh khối của vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi trên
môi trường nước dừa già, có thành phần chủ yếu là cellulose nên được gọi là cellulose
vi khuẩn (bacterial cellulose - BC).
Thuận lợi của việc sản xuất thạch dừa theo phương pháp lên men truyền thống
chính là ưu điểm của công nghệ sản xuất vi sinh: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị
đơn giản, ít tốn mặt bằng và nhân công, tương ứng giá thành rẻ… Tuy nhiên, điểm hạn
chế của nó lại là phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu, dẫn đến khó ứng dụng sản xuất ở
quy mô công nghiệp. Môi trường nước dừa già là nguyên liệu thường dùng để sản xuất
thạch dừa nhưng chỉ có sẵn ở một số vùng (mang tính địa phương), còn những vùng
khác lại rất khan hiếm do các yếu tố địa lí. Công tác vận chuyển nước dừa đến các
vùng này cũng gặp rất nhiều khó khăn.
Do đó, vấn đề đặt ra cần phải giải quyết là môi trường lên men phải xuất phát
từ những nguồn nguyên liệu sẵn có, đa dạng, rẻ, có số lượng lớn, dễ vận chuyển và
mang quy mô công nghiệp, không mang tính cục bộ, điạ phương, có thể tận dụng được
phế phụ liệu từ các quá trình sản xuất thực phẩm khác.
Xuất phát từ những yêu cầu trên, tôi thực hiện đề tài “Đa dạng hóa các môi
trƣờng sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum”.


3
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về thạch dừa

Thạch dừa (Nata de Coco) là một loại thức ăn tráng miệng phổ biến, có nguồn
gốc từ Philippin, được tạo ra từ sự lên men nước dừa bởi vi khuẩn Acetobacter
xylinum, và là một trong số các loại thực phẩm thương mại đầu tiên ứng dụng từ
bacterial cellulose (BC).
“Nata” là một từ Tây Ban Nha, xuất phát từ một từ Latin “Nata” có nghĩa là
“nổi trôi” [Africa,1944].
Theo từ điển Bách khoa toàn thư mô tả thì Nata là “một khối cơ chất dày nổi
trên bề mặt các loại môi trường”.
Nata đã được nghiên cứu và mô tả bởi rất nhiều nhà khoa học từ năm 1949 –
1987. Trong số đó, định nghĩa của Sanger là rõ ràng và chính xác nhất: “Cellulosic có
màu trắng đến vàng kem là cơ chất được hình thành bởi Aceti sp. xylinum trên bề mặt
các loại môi trường có chứa đường như nước dừa, nước cốt dừa, dịch chiết thực vật,
nước ép trái cây và các vật liệu phế phẩm khác” [Sanger, 1987].


2.2.1.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn acetic là những trực khuẩn hình que đến elip, kích thước trung bình
0,6 – 0,8 m x 1 – 3 m. Các tế bào đứng tách riêng rẽ, một số xếp thành dạng chuỗi 5
dài. Một số loài đặc biệt có tế bào hình cầu, xoắn, chùy, hình chỉ hay hình bán nguyệt
tùy thuộc điều kiện pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy.
Vi khuẩn acetic không có khả năng tạo bào tử. Một số loài có thể di động nhờ
tiên mao ở một đầu – đơn mao, hay chu mao, một số không có khả năng này. Đây là vi
khuẩn hiếu khí bắt buộc, bắt màu Gram âm khi còn non, khi già có thể đổi Gram.
Trên môi trường đặc, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lạc tròn,
nhỏ, đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm. Một số loài như A.aceti, A. xylinum có
khuẩn lạc rất nhỏ (d = 1 mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn
và sẫm màu hơn các phần chung quanh. Một số loài có khuẩn lạc lớn (d = 4 – 5 mm),
bề mặt trơn bóng, không có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, dễ dùng que cấy gạt
ra khỏi môi trường. Một số loài tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường nên khó lấy
ra bằng que cấy.
Trên môi trường lỏng, vi khuẩn acetic chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo
thành những lớp màng dày, mỏng khác nhau. Một số loài tạo thành lớp màng dày như
sứa, nhẵn, trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó một lớp màng
mỏng mới lại tiếp tục phát triển. Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt. Màng
này có chứa sợi cellulose giống như sợi bông. Loại thứ hai có màng mỏng như giấy
xelofan. Một số khác có màng không nhẵn mà nhăn nheo. Một số nữa tạo màng mỏng
dễ vỡ bám trên thành bình và dung dịch nuôi không trong [Đinh Thị Kim Nhung,
1996; Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1975].
, oxy hoá được sorbit thành
đường sorbose – dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C, oxy hoá glycerin thành
dioxyaceton, glucose thành acid gluconic. Đa số các loài Acetobacter có khả năng
đồng hoá muối amon, khả năng phân giải pepton yếu.
Trong quá trình phát triển, vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với một số acid amin
như acid pantothenic, valin, alanin, prolin …, một số chất kích thích sinh trưởng như p
– aminobenzoic, acid nicotinic, folic, biotin… và một số chất khoáng K, Ca, Mg, Fe,
S, P … ở dạng muối vô cơ hay hợp chất hữu cơ. Do đó, dịch tự phân nấm men, nước
mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của
Acetobacter [Trần Phú Hòa, 1996].
Vi khuẩn acetic rất hiếu khí. Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ 1 tế
bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và
phát triển, chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh
trưởng của chúng [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003].
Nhiệt độ tối thích đối với sinh trưởng của các loài vi khuẩn acetic là 20 – 30
0
C,
pH tối thích là 5,5 – 6,2. Chúng có tính chịu acid cao, một số loài vẫn phát triển được
ở pH = 3,2 [C.S. Pedeson, 1995].
7
2.2.1.3 Phân loại vi khuẩn acetic

Vi khuẩn acetic thuộc vào 2 giống chính:
Acetobacter : có chu mao hoặc không
Gluconobacter (còn gọi là Acetomonas) : đỉnh mao (đơn mao)
Acetobacter và Gluconobacter là 2 giống vi khuẩn acetic quan trọng nhất của họ
Acetobacteriaceae.

-
-
+

+
-
+
+/- -
+/-
+
+/-

Thủy phân tinh bột và
lactose
- - +/-
Phân giải gelatin - - +/-
Tạo sắc tố lục huỳnh quang - - +/- 8
Từ trước đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn
trong giống Acetobacter (Rothenbach - 1989, Beijerinch - 1899, Hoyer - 1899, Hansen
- 1911, Janke - 1916, Vissert Hoft - 1925, Henneberg - 1926, Hermann - 1931,
Vaughm - 1948) nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của J – Frateur.
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa
trên các tính chất sinh hoá cụ thể sau:
Khả năng tạo catalase

9
Bảng 2.2: Những khác biệt giữa các loài Acetobacter

Đặc điểm tiên
mao
Chu mao Đỉnh mao
Giống
Acetobacter
Glucono
bacter
Loài
aceti
xylinum
mesoxy
- dans
lovani
- ensis
rances
ascen
- dens
peroxy
- dans
para
-doxum
oxydans
1. Oxy hóa tiếp
tục etanol thành
CO
2
và H

A. xylinum có thể chuyển hoá 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ [Brown
và ctv, 1976].

10
Theo khóa phân loại của Bergey, Acetobacter xylinum thuộc:
Lớp : Schizomycetes
Bộ : Pseudomonadales
Bộ phụ : Pseudomonadiace
Họ : Pseudomonadaceae
Giống : Acetobacter
[Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]

2.2.2.1 Đặc điểm hình thái

Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, kích thước khoảng
2 m thay đổi tùy loài. Các tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động
hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể bị thay đổi do
tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, vì vậy chúng
tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí.
Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy
tạo thành váng nhăn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và acid sulfuric (do
phản ứng của hemicellulose) [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003].
Acetobacter xylinum có thể tích lũy 4,5% acid acetic, sinh trưởng ở pH thấp hơn
5. Acid acetic sinh ra do quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng sinh ra
quá mức giới hạn cho phép sẽ ức chế lại chính hoạt động của chúng.
Trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, A. xylinum dễ
dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt: tế bào có thể phình to hoặc kéo dài,

Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không phát
triển ở 37
0
C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt độ tối ưu
để A. xylinum phát triển là 25 – 30
0
C. Còn theo Marcormide (1996) thì A. xylinum có
thể phát triển ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 12 – 35
0
C và nồng độ ethanol lên đến 10%
[Trần Thị Ánh Tuyết, 2004].
Nguồn carbohydrate mà A. xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là
glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol,
lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose,
cellobiose, erythritol, ethanol và acetat [Julian a. Ba, 1990 - dẫn liệu của Phùng Lê
Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003].
12
2.2.2.3 Chức năng sinh lí của cellulose đối với Acetobacter xylinum

Theo Costeron (1999), trong môi trường tự nhiên, vi khuẩn có khả năng tổng
hợp các polysaccharid ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bảo vệ bao quanh tế bào, và
màng BC là một ví dụ như thế. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám
chặt trên bề mặt môi trường và làm cho tế bào thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn
so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Một vài tác

Năm 1989, nhóm I.M. Saxena trường Đại học Texa thu nhận được enzyme
cellulose synthase tinh sạch của A. xylinum. Enzyme này gồm 2 chuỗi polypeptid có
trọng lượng phân tử là 83 và 93kD. Trong đó, tiểu phần 83kD liên quan đến quá trình
sinh tổng hợp cellulose tinh khiết. Năm 1990, nhóm đã xác định được gen tổng hợp
cellulose ở A. xylinum (dòng hoá và giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose).
Ngày nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm về cấu trúc,
cơ chế tổng hợp và ứng dụng của BC [Trương Thị Anh Đào, 2004].

2.3.2 Cấu trúc của BC

BC có cấu trúc hóa học tương tự như cấu trúc của cellulose thực vật (plant
cellulose - PC), là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua cầu nối
- 1,4 – glucan. Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der
Waals. Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền
sợi với chiều rộng 1,5 nm. Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích
thước từ 3 – 4 nm và chiều rộng 70 – 80 nm.
Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dải là 3,2 x 133 nm; còn theo Brown và
cộng sự (1976) thì là 4,1 x 177 nm. So với PC thì BC có độ polymer hóa cao hơn và
kích thước nhỏ hơn, BC có độ polymer hóa từ 2000 – 6000, có trường hợp lên đến
16000 hay 20000. Trong khi đó, khả năng polymer hóa của PC chỉ từ 13000 – 14000
[dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. Hình 2.4: Cấu trúc BC và PC [26; 27]
14
Trong tự nhiên, cellulose kết tinh phổ biến ở dạng I và II. Cellulose I có thể
chuyển thành cellulose II nhưng cellulose II thì không thể chuyển ngược lại thành


15
2.3.4 Quá trình sinh tổng hợp BC từ vi khuẩn A. xylinum

Khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy
đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B
1
, B
2
, B
12
… và các chất kích thích sinh trưởng),
chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ
môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một
phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển
ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [Đinh Thị Kim
Nhung, 1996]
Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: các tế bào
A. xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của
mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền
chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên
màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose [J. A.
Bazon, 1984 - dẫn liệu của Đinh Thị Kim Nhung, 1996].

Hình 2.5: Con đƣờng dự đoán quá trình sinh tổng hợp cellulose trong tế
bào vi khuẩn Acetobacter xylinum [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]

Tương tự như các thực vật thượng đẳng, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các
oligo và polysaccharid nội bào, lượng oligo và polysaccharid nội bào đạt tới 60% khối
lượng khô tế bào, còn polysaccharid ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi

Frc F6P phosphate

PTS FBD

F1P FDP EMP TCA

Hình 2.6: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose của A.xylinum
PGM
FHK
1PFK 17
Glc: glucose UDPG: uridin diphosphate glucose
GHK: glucose hexokinase UGP:uridin glucose pyrophosphorylase
G6PD: glucose – 6 – phosphate PGM: phosphoglucomutas
G1P: glucose – 1 – phosphate G6P: glucose – 6 – phosphate
PGI: phosphoglucose isomerase FHK: fructose hexokinase
Frc: fructose F6P: fructose – 6 – phosphate
PGA: phosphogluconic acid PTS: phosphotransfer system
F1P: fructose – 1 – phosphate 1PFK: fructose – 1 phosphate kinase
FDP:fructose – 1,6 – diphosphate dehydrogenase

2.3.5 Ứng dụng của BC

Dựa vào những đặc tính ưu việt mà BC có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực:
Thực phẩm: - Thức ăn tráng miệng (thạch dừa, cocktail,
Kombucha, trà Manchurian…)
- Các loại bánh snack, kẹo có năng lượng thấp
- Chất làm đặc để bổ sung trong kem, dầu trộn salad

Công nghiệp máy: - Chế tạo thân xe hơi, các thành tố cấu trúc máy
bay, tên lửa…
- Màng siêu âm thanh
- Thiết bị siêu lọc nước
- Màng thẩm thấu 2 chiều
[Trần Thị ÁnhTuyết, 2004]; [32]

2.4 Thành phần nguyên liệu sử dụng trong sản xuất BC

2.4.1 Nƣớc dừa già

Hiện nay tại Việt Nam và một số quốc gia, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất
thạch dừa là nước dừa. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hoá
học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa
tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau đó giảm dần). Đường ở
đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol.