1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP
THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN HỌC: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH
HỌC TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BÀI TIỂU LUẬN: QUY TRÌNH SẢN XUẤT
AMYLASE TỪ VI SINH VẬT

GVDH: Ths. Nguyễn Thị Thu Sang
Nhóm: 09
Lớp: 02DHLTP2
SVTH gồm có:
01 - Trần Thị Chiến - 2205115008
02 - Đỗ Tuấn Hưng - 2205115221
03 - Nguyễn Thị Huyện - 2205115020
04 - Nguyễn Thị Diễm Kim - 2205115131
05 - Trần Thị Hoài Thông - 2205115059
06 - Nguyễn Thị Thơ – 2205115122

Tháng 12- 2012
2

LỜI MỞ ĐẦU
Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ
3

PHẦN 1
TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE

1.1 Giới thiệu về enzyme Amylase
1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, định nghĩa
Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá
trình lên men. Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước
chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hoá tinh bột thành đường ở nhiệt
độ thường. Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã
chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được
ở dạng bột. Thí nghiệm này được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết
của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa. Kết tủa được hình thành
này có khả năng chuyển hoá tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác dụng
chuyển hoá. Danh từ diastase là do Payen và Persor dung để gọi enzyme lúc
bấy giờ.
Enzyme Amylase đã được tìm ra góp phần quan trọng cho nhiều ngành
công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzyme amylase có thể tìm thấy ở nhiều

 Endoamylase:
α– amylase Amylase có khả năng
phân cắt các liên kết 1,4-
glucoside của cơ chất một cách
ngẫu nhiên và là enzyme nội
bào. α-amylase không chỉ có khả
năng phân hủy hồ tinh bột mà
còn có khả năng phân hủy các
hạt tinh bột nguyên vẹn.
Khử trực
tiếp
Khử gián

enzyme quan trọng nhất trong chế
biến tinh bột. Enzyme này được sử
dụng trên một quy mô lớn trong
glucose và các ngành công nghiệp
sirô maltose. Pullulanase là một loại
enzyme rất mạnh cho sự thoái hóa
tinh bột thành glucose hoặc maltose.
Pullulanase thủy phân α-1, 6-
glycosidic liên kết của chuỗi phân
nhánh và α-1, 4-glycosidic. -Khử gián tiếp
Transglucosylase (oligo-1,6-
glucosidase) và Maylo-1,6-glucoside:
Enzyme này thủy phân liên kết β-1,6-
glucoside trong isomaltose, panose và
các dextrin tới hạn có thể chuyển hóa đường có thể lên men được.
 Exoamylase
β–amylase
(β-1,4-glucan-maltohydrolase)
β–amylase xúc tác từ sự thủy phân các liên
kết 1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và
polysaccharide, phân cắt từng nhóm
maltose từ đầu không khử của mạch.
Maltose được hình thành do sự xúc tác của
β-amylase có cấu hình β.
γ–amylase (glucose amylase)
Glucose amylase có khả năng
thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6-

nấm sợi có pH từ 4.0 – 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4. 5 – 5.8), vi
khuẩn có pH từ 5.9 – 6. 1 (pH<3 thì enzyme α – amylase bị vô hoạt trừ enzyme
của Asp.Niger có pH 2.5 – 2.8).
α - amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa cao tạo ra một lượng lớn
glucose và maltose.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α-amylase của Asp.oryzae
bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylase từ các nguồn khác
nhau cũng không đồng nhất. α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác
động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C (Kozmina,
1991).
α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham
gia vào sự hình thành, ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme và duy trì hoạt động
của enzyme. Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác
động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải
protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết
khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác.
Một số kim loại như: Li
+
, Na
+
, Cr
3+
, Mn
2+
, Zn
2+
, CO
2+

và isomaltose 8%. 8 PHẦN 2
TỔNG QUAN VỀ NGUỒN GIỐNG VI SINH VẬT

2.1 Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme
Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
 Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.
 Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là
hoạt tính enzyme).
 Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.
 Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm.

2.2 Vi sinh vật dùng để sản xuất enzyme Amylase
2.2.1 Các giống vi sinh vật sản xuất enzyme Amylase
Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu
enzyme amylase chủ đạo. Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường
được phân lập từ các nguồn tự nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều
hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn,còn xạ khuẩn thì ít hơn.
Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus.
Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces,
Endomycopsy, Endomyces cũng tạo amylase.
Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac.polymyxa,
Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng
sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị
nhiễm vi sinh vật khác.
Condium of Aspergillus Oryzae

Aspergillus Oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp
Ascomyctes (năng khuẩn). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm
những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7m, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn,
chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Từ những sợi nằm ngang này
hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan
sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus Oryzae thường dài 1-2mm
nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên
gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là
những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử
đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Aspergillus Oryzae có
màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…. Bào tử cùng thành phần môi trường
10

được sấy khô ở nhiệt độ < 50
o
C cho đến khi độ ẩm <8
o
C, đưa vào bao, hàn kín
và bảo quản ở nhiệt độ thường.
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu cả enzyme thủy phân nội bào và
ngoại bào (amylase, protease, pectinasae,….), ta rất hay gặp chúng ở các kho
nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo….đã hết nhưng không được
rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, bã sắn….chúng mọc và phát triển có

đặc điểm này chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV
sinh tổng hợp enzyme mà ta cần.
Ví dụ: nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease
cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều protein trong tự nhiên, còn nếu muốn phân
11

lập vsv có khả năng sinh tổng hợp amylase ta cần phải tìm nơi có chứa nhiều
tinh bột trong tự nhiên.

Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi
với điều kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua
giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm.
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những
giống đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc
điểm sinh hóa hơn các giống vi sinh vật hoang dại.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men,
dịch nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả
năng thu nhận của những chủng có khả năng sinh tổng hợp cao thường rất cao.

Phân lập giống trong môi trường giống đã hư hỏng
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có
thể rất nhiều tế bào vi sinh vật giống bị thoái hóa, nhưng cũng còn nhiều tế bào
không bị thoái hóa. Việc phân lập lại từ nguồn gốc này nhiều khi lại đạt được
những kết quả tốt.

Phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme
amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay

 Đổ 10ml H
2
O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.
 Lắc đều cho bào tử hòa trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch
huyền phù.
 Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có
chứa môi trường sinh trưởng của nấm.
KH
2
PO
4
1,4 MgSO
4
.7H
2
O 0,1
NH
4
NO
3
10 FeSO
4
. 7H
2
O 0,01 pH=6,5
KCl 0,5 Hồ tinh bột 20
 Phân phối khoảng 30 – 40 ml môi trường vào erlen 50ml đem
khử trùng bởi Autoclave ở 73 - 121
0
C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt

Bảo quản giống trong đất hoặc trong cát
Phương pháp dựa trên nguyên tắc : Trong môi trường tối thiểu có độ ẩm
thấp, vi sinh vật có bào tử có thể bảo tồn khả năng sinh tổng hợp enzyme trong
thời gian dài. Phương pháp này rất phù hợp và có hiệu quả đối với nấm mốc
Asp.oryzae.
Trước khi sử dụng, đất, cát phải được làm sạch và sấy đến độ ẩm < 5%.
Asp.oryzae được nuôi cho đến khi tạo bào tử. Người ta trộn bào tử với đất hoặc
cát đã được làm sạch và sấy khô. Sau đó hỗn hợp này cho vào bao hàn kín và
bảo quản ở nhiệt độ thường.


Bảo quản giống trong hạt ngũ cốc
Phương pháp dựa trên nguyên tắc bào tử nấm được giữ trong hạt ngũ
cốc đã xử lý nhiệt có độ ẩm < 8% và giữ được khả năng sinh tổng hợp enzyme
trong thời gian dài.
Người ta thực hiện bảo quản giống trong hạt ngũ cốc như sau: Giống
ống nấm mốc được nuôi trong môi trường hạt ngũ cốc cho đến khi tạo nhiều
.
2.3 Yêu cầu đối với giống vi sinh vật
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và
được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong
công nghệ enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định.
Đó là:
 Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải
có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình
trao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng
nghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV
cần tổng hợp nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính
vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này
phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng.

15

PHẦN 3
QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME
Α- AMYLASE TỪ ASPERGYLLUS ORYZAE

3.1 Bảo quản giống Aspergyllus oryzae:
-Cho cát vào ống nghiệm, tiệt trùng trong autoclave 130
o
C trong 30
phút.
-Trộn bào tử vào cát.
-Sấy chân không < 40
o
C (độ ẩm 5%).

NGUYÊN LIỆU
XỬ LÝ
THANH TRÙNG
LÀM NGUỘI
PHỐI TRỘN
THU NHẬN ENZYME THÔ
NUÔI CẤY
GIỐNG VSV
SẤY
NGHIỀN MỊN
TRÍCH LY
LỌC
KẾT TỦA ENZYME
THU NHẬN ENZYME THÔ SẮC KÝ
SẤY
THÀNH
PHẨM
BAO GÓI
17 3.4 Thuyết minh quy trình:
-Xử lý nguyên liệu: cám gạo, trấu và mạt cưa được xử lý để loại bỏ các
tạp chất. Trấu cho vào với tỉ lệ 20-25% so với khối lượng cám gạo.
-Thanh trùng: Nhiệt độ thanh trùng là 95
o
C trong 60 phút. Đồng thời

1lít enzyme.
-Enzyme thu được là 1 hỗn hợp nhiều enzyme khác nhau như: amylase,
proteinase, cellulase… Do đó, phải tiến hành sắc ký lọc gel để thu được
enzyme amylase. Gel sử dụng là Sephadex G200.
-Sấy: sản phẩm sau sắc ký được sấy ở nhiệt độ 30-40
o
C để bảo đảm hoạt
tính cho enzyme, độ ẩm sản phẩm là 5%.

3.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp này:
a. Ưu điểm:
18

Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được tạo
thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm.
- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối
VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc
vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, rất dễ xử lý. Môi trường đặc là
môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại
bỏ khu
vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy.
b. Nhược điểm:
Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương
pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường nên cần nhiều diện tích. 3.6 Các ảnh hưởng đến chất lượng enzyme:
a. Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh dưỡng:

2
0.15 - -
NH
4
NO
3
0.15 98 4100
19

NH
4
NO
3
0.3 45 4900
NH
4
H
2
PO
4
0.3 5.5 8000
b. Ảnh hưởng của amino acid:
- Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nguồn nito vừa là
nguồn năng lượng.
- Một số amino acid riêng rẻ (glutamic acid, aspatic acid ) đóng vai trò
vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid, cụ thể là sinh tổng hợp nhiều
amino acid khác trong quá trình chuyển amine hóa.
- Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong
nước như: pantotenic acid, biotin, folic acid,…các vitamin này có ý nghĩa sinh
học rất lớn. Ngoài ra sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật phụ

Ngoài các yếu tố đa lượng cần chú ý tới các yếu tố vi lượng. Chẳng hạn: coban,
kẽm…và các yếu tố gây ức chế sự tổng hợp enzyme amylase như: đồng, thủy
ngân,…

3.7 Các yếu tối ảnh hưởng đến quá trình lên men:
a. Độ ẩm môi trường:
20

Tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ ẩm
môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho
độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển. Ảnh hưởng của
việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của Asp.oryzae
nuôi bằng phương pháp bề mặt:
Bảng: ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-
amylase của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt
Phương
án thí
nghiệm
20 giờ 34 giờ 42 giờ
Độ
ẩm
%
Hoạt độ
amylase với
canh trường
khô
Độ
ẩm
%
Hoạt độ

trưởng của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzyme amylase. Nhiệt đọ
thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme là 28-32
o
C. Nhiệt độ do nấm
mốc tỏa ra môi trường có thể nóng lên 40
o
C hoặc hơn. Do vậy cần gữi cho
nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27
o
C và không cao hơn 36
o
C.
e. Ảnh hưởng thời gian nuôi nấm mốc:
Hầu hết các chủng nấm mốc Asp.oryzea có hoạt động cực đại của amylase ở
khoảng giờ thứ 30-38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36-42.
f. Ảnh hưởng của pH: thích hợp cho Asp.oryzae là môi trường acid
yếu khoảng 5,5-6,5.

21

3.8 Một số thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất enzyme
a. Máy sấy phun sương
 Công dụng: Sấy và tạo hạt từ dung dịch.


định, tức là sử dụng bộ phun li tâm tốc độ caolàm nguyên liệu bị phân tán
thành dạng sương mù, tiếp xúc đầy đủ với không khí nóng và đượcsấy khô
trong thời gian rất nhanh, tạo ra thành phẩm có dạng bột mịn. Máy sấy phun ly
tâm tốcđộ cao chuyên dụng cho thuốc cao lỏng Đông y là thiết bị sấy phun
chuyên dùng, giải quyết vấnđề sấy khô thuốc cao và thu dịch chiết thực vật
trong Đông y, thiết bị này đã giải quyết đượcnhững vấn đề tồn tại của dạng
máy sấy phun li tâm thông thường. Các hạn chế của mấy sấy khô phun li tâm
tốc độ cao LPG:
-Vật liệu bám trên thành ống năng suất tạo bột thấp.
-Vật liệu bám trên thành trong một thời gian dài, gây biến chất.
-Khó vệ sinh, không phù hợp với yêu cầu GMP.
-Công suất đầu ra thấp: với các máy sấy LPG-150 chỉ có thể cung cấp
mức 50 đến 60 kg/h.
Thiết bị cơ bản đã giải quyết được những hạn chế của các máy sấy cùng
loại xuất hiện trước đó, nguyên liệu sau khi sấy khô có màu đẹp, không bị biến
chất, nâng cao hiệu quả kinh tế của đơn vị sử dụng. Thiết bị của chúng tôi có
những thuận lợi sau:
-Có bộ lọc không khí 3 cấp, lượng khí đưa vào đạt yêu cầu cấp 300.000.
-Có bộ phận giải nhiệt vách lò, giữ nhiệt độ vách lò ở mức 80OC,
nguyên liệu trong thời gian dừng lại trên vách lò cũng không bị cháy.
-Thể tích tổng thể bằng 3.5 lần lò phun li tâm theo tiêu chuẩn LPG.
-Có bộ phận xối rửa mở nhanh, thích hợp với yêu cầu sản xuất nhiều
loại sản phẩm.
-Phần khử bụi thiết kế khử bụi dạng ẩm, bụi
không thoát ra ngoài, phù hợp yêu cầu bảo vệ môi
trường.
23

-Có bộ quét không khí cho hiệu quả khiến người sử dụng hài lòng.
- Cung cấp 2 bộ phun sương, điều tốc bằng biến tần.


24  Sơ đồ hệ thống 1 、Máy nén khí 2 、Buồng tích áp 3 、Máy sấy khí
4 、Máy nghiền QYF 5 、Tách sản phẩm
6 、Thu sản phẩm 7 、Quạt hút
 Đặc tính
- Ứng dụng nghiền các nguyên liệu có độ cứng dưới cấp 9.
- Khả năng nghiền đạt độ mịn d = 2~15um
- Trong quá trình không bị lẫn tạp chất do bản thân nguyên liệu tự va
đập.
- Trong quá trình nghiền không sinh nhiệt.
- Khí nén nghiền có thể dùng loại khí trơ nhằm tránh cháy nổ ô xi hóa đối
với một số nguyên liệu đặc thù.
 Nguyên lý hoạt động

Máy nghiền khí nén dùng luồng khí tốc độ cao tác động nghiền tán
nguyên liệu bột dạng khô. Hệ thống máy bao gồm đầu nghiền, bộ phân ly, bộ
trục vít tiếp liệu, khi máy hoạt độ, nguyên liệu được đưa vào trong buồng
nghiền, tại đây, nguyên liệu gặp luồng khí tốc độ cao và hạt nguyên liệu tự va

nước.
a. Cốm enzyme EMEDYC amin
 THÀNH PHẦN: mỗi gói cốm
3gr gồm:
Enzyme Amylase … .≥85UI
Enzyme Protease ……… ≥40UI
Enzyme Maltase …… ≥40UI
Bột acid amin …… …….50mg
Vitamin B2…… …0.5mg
Vitamin B5…… …2.0mg
Vitamin B6……… 0.5mg
Vitamin B9…… 150mcg
Vitamin B1……… 0.5mg

 CÔNG DỤNG:
Bổ sung các men tiêu hóa, vitamin, acid amin có ích cho cơ thể, giúp trẻ
ăn ngon miệng và ăn được nhiều hơn.