1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****

VIRUS PRRS VÀ PROTEIN TÁI TỔ HỢP N
ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN
Giáo viên hướng dẫn: Bộ môn : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện:
NGUYỄN THỊ LI NA
MSSV: 06126081

Thành Phố Hồ Chí Minh
31/10/2009


một số protein tái tổ hợp để ứng dụng trong chẩn đoán cũng như chế tạo
vaccine. 3

II.Tổng quan
A. Tổng quan về virus PRRS
1. Lịch sử phát hiện bệnh
Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 tại Mỹ nhưng một số nghiên cứu
dịch tễ học cho rằng có thể bệnh đã lưu hành trước đó tại Canada. Bệnh xuất
hiện ở Châu âu vào năm 1990 và hiện đã lưu hành ở nhiều nước thuộc châu lục
này. Các kiểm tra huyế
t thanh học và virus học cho thấy PRRS cũng đã có mặt
tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines, Nam Mỹ, các nước vùng Ca-ri-bê
Trong những ngày gần đây, bệnh đã xuất hiện tại Trung Quốc và cũng đã xuất
hiện ở nhiều địa phương ở nước ta và gây thiệt hại kinh tế lớn trong nghành
chăn nuôi heo trên thế giới
2. Virus PRRS
2.1. Hình thái, cấu tạo phân tử virion của PRRSV:
Virus Nidovirales hay còn được gọ
i là virus PRRS (porcine reproductive
and Respiratory Syndrome virus) thuộc họ Arteviridae, giống Artevirus, đây là
virus ARN sợi đơn,dương có vỏ envelope bao bọc. Phân tử virion PRRS có
dạng hình cầu hoặc trứng với đường kính trung bình là 58nm, trong đó có một
số ít phân tử có đường kính lớn hơn 70nm, phân tử virus có bề mặt ngoài trơn
với chỉ một vài điểm lồi ra, cách biệt với vỏ bọc một khoảng 2-3nm bên trong

31-35kD GP4(Van Nieuwstadt và cộng sự, 1996).
2.3. Sự đa dạng trong các chủng virus PRRS lưu hành trên thế giới
PRRS lưu hành trên thế giới với 2 dòng khác nhau: dòng Châu Mỹ (tiêu
biểu là chủng VR-2332) và dòng Châu Âu (tiêu biểu là Lelystad-LV). Những
chủng virus giữa hai dòng Châu Mỹ và Châu Âu khác nhau về đặc tính gây
bệnh và chúng có sự khác nhau về đặc điểm bộ gene và yếu tố kháng nguyên.
Các chủng trong cùng một dòng thì có sự tương đồng về cấu trúc kháng
nguyên. Tùy theo ORF mà s
ự tương đồng về gene của hai dòng virus PRRS
Châu Âu và Châu Mỹ dao động từ 52 đến 81%. Việc giải mã trình tự
nucleotide của từng ORF là cơ sở dữ liệu phân tử quan trọng cho phép xác định
và sử dụng trình tự nào trong việc so sánh, chẩn đoán phân biệt các dòng
PRRSV cũng như xác định sự tiến hóa của chúng. Ví dụ qua phân tích gene và
theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng PRRSV người ta đã xác
định được rằng ở PRRSV dòng Châu Mỹ, các ORF 6 và 7 có tính ổn định r
ất
cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hóa của dòng virus
này. Tuy nhiên sự khác biệt giữa dòng virus PRRS Châu Âu và Châu Mỹ ở hai
khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự acid amin của
ORF7 giữa hai dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORF6 là 70-
81%. Trong khi đó khung đọc mở ORF5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng
trong cùng một dòng Châu Mỹ (giống nhau chỉ từ 88-97%) và chỉ tương đồng
với dòng Châu Âu khoảng từ
51-59%. Các epitope trung hòa chính nằm trên
protein quy định bởi ORF5, tuy có sự biến động lớn trong vùng ORF5 giữa các
chủng virus PRRS nhưng các epitope trung hòa thường có sự bảo tồn tốt giữa
các dòng PRRS khác nhau. Các epitope trung hòa khác nằm ở trên GP3, GP4
và protein M. Sự tương đồng về trình tự acid amin quy định do các khung đọc
mở ORF 2, 3, và 4 giữa các dòng Châu Âu và Châu Mỹ chỉ ở mức độ từ 63, 58,
và 68%. Sự khác biệt kiểu gene đương nhiên đưa đến sự khác biệt về kiểu hình

Căn cứ vào sự biểu hiện các triệu chứng của bệnh, người ta có thể chia
thành hai loại triệu chứng: biểu hiện của các triệu chứng rối loạn sinh sản ở heo
nái và biểu hiện của các triệu chứng hô hấp. Các triệu chứng sinh sản bao gồm:
heo nái bị sốt 39-40°, bỏ ăn,mệt mỏi, giảm tỉ lệ thụ thai và số con đẻ ra, sảy
thai (tỷ lệ này có thể đến 50% trong các đàn mới bị nhiễm virus), giảm tiết sữa
hoặc mất sữa hoàn toàn, thai gỗ, chết thai, đẻ non, chậm động dục hoặc không
động dục trở lại, rối loạn sinh sản có thể kéo dài đến vài tháng. Biểu hiện các
triệu chứng hô hấp bao gồm: loạn hô hấp, lợn biểu hiện đau khi thở, hắt hơi,
tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng. Khi bị nhiễm virus PRRS heo con
có tỉ lệ chết trước cai sữa cao, gầy yếu, bỏ ăn phù mắt,các nốt phồng rộp trên
da, ỉa chảy, đi không vững và run, đứng choãi chân. Heo lớn có biểu hiện sốt
nhẹ, bỏ ăn. Các triệu chứng khác nhẹ hơn. Heo đực giống có các biểu hiện
giảm hưng phấn, giảm thể tích và chất lượng tinh dịch (hình thái, hoạt lực và
nồng độ tinh trùng).
3.2. Bệnh tích
Đối với heo nái, ngoài các triệu chứng sảy thai, tăng tỉ lệ thai chết, heo
mắc bệnh thường không có các bệnh tích đặc thù.
Đối với heo con thường mang các bệnh tích rõ hơn heo trưởng thành và
heo nái, bao gồm: dịch thẩm thấu trong đường tiêu hóa và đường hô hấp đặc
biệt trong các phế quản, phù, thanh dịch trong xoang phúc mạc, xoang ngực,
xoang phế mạc và tung các mạc, sưng hạch bạch huyết, da nhiều vùng có màu
xanh tím.
3.3. Phương thức truyền lây
Virus thường xâm nhiễm heo thông qua đường hô hấp và xâm nhập vào
tế bào đại thực bào của phế nang phổi rồi nhân lên ở đó, chúng kích thích tạo
đáp ứng interferon rất ít trước khi phát tán bên trong vật chủ. Virus PRRS thích
hợp với một loại tế bào chuyên biệt với các đại thực bào đã biệt hóa như là đại
thực bào túi phổi heo (PAM). Tuy nhiên, cơ chế chính xác của tế bào đích và

8

ới thiệu
Trong 3 protein cấu trúc chính của PRRSV thì người ta nhận thấy rằng
N protein quy định bởi ORF 7 hiện diện với số lượng lớn nhất trong phân tử

9
virion của PRRS và huyết của heo bị xâm nhiễm bởi PRRS phản ứng mạnh với
N protein, hầu hết kháng thể đơn dòng thu được từ chuột bị cho nhiễm PRRS
bán tinh sạch nhận biết đặc hiệu với N-protein. Ngoài ra qua nghiên cứu ORF 7
mã hóa cho Protien N có cấu trúc ổn định và được bảo tồn cao. Chính vì thế
nên N protein được xem là ứng viên sáng giá trong việc phát hiện chẩn đoán
heo bị nhiễm PRRS. Hiện nay người ta đã phát triển các kit thương mạ
i chẩn
đoán PRRS dựa trên ORF7. ELISA là phương pháp thông dụng và tin cậy
trong phát hiện chẩn đoán PRRS hiện nay, người ta thường dùng ELISA để
phát hiện kháng thể PRRS kháng protein N sản phẩm của ORF7 chính vì thế
cần một lượng lớn kháng nguyên là protein N dùng trong các kit chẩn đoán
này. Nhưng hiện tại có một hạn chế là PRRSV thường khó nuôi trên môi
trường tế bào. Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trường đại thực bào túi phổi
heo (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi, tuy nhiên, hiệ
n tại người
ta chưa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi cấy
nhân tạo. Các dòng tế bào thận khỉ thường không nhạy cảm cho tất cả các
chủng virus PRRS. Chính vì thế phương pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho
PRRSV là hướng đi đúng và mang lại nhiều ưu điểm, đặc biệt sản xuất protein
tái tổ hợp N mã hóa bởi ORF7 mang tính ứng dụng cao trong các thử nghiệm
như dùng làm vật liệu trong các kit chẩn
đoán ELISA. Sản xuất protein N tái tổ
hợp mở ra khả năng tạo số lượng lớn kháng nguyên dùng làm vật liệu trong
chẩn đoán nhất là khi dịch bệnh bùng phát. Sản xuất protein tái tổ hợp cũng
góp phần khắc phục được nhược điểm hiện tại là khó nuôi cấy PRRSV trên môi

3.1. giới thiệu
Trong phần trình bày này người ta sản xuất protein N tái tổ hợp bằng
cách chèn gene ORF7 mã hóa cho protein nucleocapsid N của Lelystad virus
(LV) vào sau promoter P10 của baculor virus Autographa califonia nuclear
polyhedrosis. Kết quả tạo ra baculovirus tái tổ hợp là bac-ORF7, biểu hiện
protein 15kDa trong tế bào côn trùng. Protein này có kích thước tương tự với
kích thước protein N biểu hiện bởi LV trong tế
bào CL2621và vẫn giữ được

11
cấu trúc kháng nguyên của Protein N tự nhiên. Protein tái tổ hợp này được đem
đi chủng cho heo và kháng thể chống lại protein N tái tổ hợp được sản xuất
tăng lên trong cơ thể heo. Tuy nhiên chủng protein N tái tổ hợp không giúp bảo
vệ heo khỏi sự xâm nhập của PRRSV. Qua kiểm tra cả hai dòng virus PRRS
Châu Âu và Châu Mỹ đều phản ứng với protein N biểu hiện bởi bac-ORF7,
như vậy protein N tái tổ hợp có thể được sử dụng trong vi
ệc phát hiện kháng
thể trong huyết thanh kháng lại các chủng khác nhau của PRRSV. Nhưng
protein tái tổ hợp này không có khả năng ứng dụng trong sản xuất vaccine
chống virus PRRS.

3.2. Quy trình sản xuất như sau:
Chuẩn bị tế bào và virus: virus Autographa California nuclear polyhidrosis
(AcNPV) và các virus tái tổ hợp được nuôi cấy trong dòng tế bào Spodoptera
frugiperda Sf21. LV và ATCC VR2332 được phát triển trong tế bào đại thực
bào túi phổi của heo(PAM) hoặc trong tế bào CL2621.
Thiết lập plasmid: tổng hợp hai đoạn oligonucleotide chuyên biệt nằm ở

trước và sau của ORF7 là LV40
(59-GATTGGAT

được hòa trong dung dịch buffer Laemmli, hỗn hợp này được đun nóng trong
hai phút ở nhiệt độ 100°C trước khi được phân tích bằng điện di bằng phương
pháp sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE) trên gel
polyacrylamide 12,5 %. Gel được ngâm trong Amplify trong 30 phút để nhuộm
huỳnh quang và sau đó được làm khô và protein miễn dịch kết tủa được quan
sát bằng phóng xạ tự ghi. Quy trình này cũng đượ
c dùng để kết tủa miễn dịch
protein từ dung dịch ly giải tế bào CL2621 bị xâm nhiễm LV.
Đo sản lượng Protein N tái tổ hợp theo thời gian bằng phương pháp
ELISA: tế bào Sf21 được xâm nhiễm với baculovirus tái tổ hợp bac-ORF7 với
liều hữu hiệu là TCID50s. Tại 24, 48, 72 và 96 giờ sau xâm nhiễm, tế bào được
thu hoạch, rồi được rửa với phosphate-buffered saline (PBS), rồi được ly giải
trên đá trong dung dịch ly giải (30mM Tris-HCl [pH7,5], 10mM MgCl
2
và 1%
Nonidet-P40; 40×10
6
tế bào/ml). Dung dịch ly giải được ly tâm ở 1400
vòng/phút để loại các mảnh vỡ của tế bào. Dung dịch sau ly tâm của bac-ORF7
được bảo quản ở -70°C.Đĩa phản ứng ELISA được phủ với dung dịch ly giải
của tế bào bac-ORF7 và được ủ qua đêm với tỉ lệ 1:125 trong dung dịch
coating buffer (50mM NaHCO
3
[pH 9,65]. Đĩa được rửa trong PBS chứa 0,05
% tween 80 và được ủ ở 37°C trong một giờ với độ pha loãng 1:500 của ascetic
fluid của kháng thể đơn dòng WBE6 đặc hiệu cho protein N trong ELISA
buffer ( PBS, 0,05% Tween 80, 4% huyết thanh ngựa). Đĩa phản ứng được rửa
và ủ trong một giờ ở 37°C với kháng thể horseradish peroxidase (HRPO)-

13

bệnh tích. Kháng nguyên virus được quan sát bằng phương pháp
immunoperoxidase staining với MAbs SDOW17 và kháng thể chuột HRPO-
conjugated gắn trực tiếp với immunoglobin như đã miêu tả ở trên.
14
III. Kết luận
PRRS virus là virus đang được quan tâm nghiên cứu bởi các nhà khoa
học trên thế giới vì đây là virus gây thiệt hại lớn trong nghành chăn nuôi heo
thế giới. mặt khác sự đa dạng di truyền của virus này cùng với sự biến đổi lien
tục của chúng dẫn đến sự khó khăn trong chẩn đoán cũng như tạo ra loại
vaccine đặc hiệu và có hiệu quả trong công tác phòng chống dịch bệnh xả
y ra.
Do đặc điểm khó nuôi cấy trên môi trường tế bào nên có những khó khăn nhất
định trong việc sản xuất các kháng nguyên dùng làm vật liệu cho các kit chẩn
đoán virus cũng như nuôi cấy virus để tạo nguyên liệu sản xuất vaccine nhược
độc cho virus này. Chính vì thế protein tái tổ hợp là hướng đi tiềm năng trong
việc sản xuất kháng nguyên ứng dụng trong sản xuất kit chẩn đoán trên quy mô
lớn và khắc phục được nhược đ
iểm nêu trên, ngoài ra protein tái tổ hợp cũng
mở ra tiềm năng cho sản xuất vaccine bảo vệ heo khỏi PRRSV.
Trong bài báo cáo này em chỉ trình bày những kiến thức hiểu biết chung về
virus PRRS và hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo do virus này gây ra.
Đồng thời nêu ra nghiên cứu về sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF7 của
virus là vùng có tính bảo tồn cao, có ứng dụng rõ ràng trong công tác chẩn
đoán và phân biệt các dòng virus PRRS. Hiện nay còn có hướng nghiên cứu
ứng dụng protein tái t
ổ hợp dựa trên ORF5 của virus PRRS trong sản xuất
vaccine vì protein GP5 được quy định bởi ORF này có chứa những epitope

Reproductive Syndrome Virus Variants, Viet Nam and China, 2007.
5. Kyoung-Jin Yoon, assistant professor; Chih-Cheng Chang, Graduate assistant;
Jeffrey Zimmerman, associated professor; and Karent Harmon, associated
scientist, Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal
Medicine. Field and Experimental Assessment of PRRSV Evolution.
6. Dee S, Deen J, Rossow K, Weise C, Eliason R, Otake S, Joo HS, Pijoan C. Can
J Vet Res. 2003.Mechanical transmission of porcine reproductive and
respiratory syndrome virus throughout a coordinated sequence of events during
warm weather.
7. T Dokland, A Deshpande, Y Fang, E Nelson, Department of Microbiology,
University of Alabama at Birmingham; Department of Veterinary Science,
South Dakota State University AM Burrell, W Xu, Q Hoang, RC Willis, R

16
Shah, M Bounpheng, X Fang Applied Biosystems, Austin, Texas, Cryo-
electron microscopy of PRRSV virions.
3.1. Triệu chứng lâm sàng 7
3.2. Bệnh tích 7
3.3. Phương thức truyền lây 7
B.
Tổng quan về protein tái tổ hợp dựa trên ORF7 và ứng dụng trong chẩn
đoán 8

1. Giới thiệu 8
2. Cấu trúc phân tử của Protein N 9
3. Sản xuất protein N tái tổ hợp 10
3.1. giới thiệu 10
3.2. Quy trình sản xuất như sau: 11
III.
Kết luận 14
IV. Tài liệu tham khảo 15