Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠ I HỌ C THÁ I NGUYÊN
TRƢỜ NG ĐẠ I HỌ C SƢ PHẠ M


V TH NHƢ TRANG XC ĐNH HM LƢNG CHOLESTEROL TRONG TRNG V
SO SÁ NH TRÌ NH TƢ̣ VÙ NG ĐIỀ U KHIỂ N D-LOOP DNA TY
THỂ CỦ A GÀ RI, G C, G TRE
LUẬ N VĂN THẠ C SĨ SINH HỌ C

G RI, G C, G TRE
Chuyên ngà nh: SINH HỌ C THƢ̣ C NGHIỆ M
M s: 60.42.30 LUẬ N VĂN THẠ C SĨ SINH HỌ C

Ngƣờ i hƣớ ng dẫ n khoa họ c: PGS. TS Nguyễ n Trọ ng lạ ng

THI NGUYÊN, 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Lờ i cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trì nh nghiên cứ u củ a tôi . Cc kt qu, số
liệ u nêu trong luậ n văn là trung thự c và chưa từ ng đượ c công bố trong bấ t kỳ
công trình nà o khá c .
Tc giả luận văn

V Th Nhƣ Trang
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

bp
Base pair
EDTA
Ethylene diamine tetra – acetic acid
EtBr
Ethidium bromide
Kb
Kilo base
PCR
Polymerase Chain Reaction
RNase
Ribonuclease
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate
TAE
Tris- acetate-EDTA
COI
Cytochrome oxidase I
PBS
Phosphate Buffer Saline
epp
eppendorf
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Danh mụ c cá c bả ng

Bảng
Tên bả ng
Trang
2.1

Trang
1.1
Cấu trc ho hc của cholesterol
6
1.2
Bn đ gen mtDNA của g nh Gallus gallus
12
2.1
Đường chuẩn cholesterol da theo diện tích cc peak
chuẩn cholesterol
20
2.2
Đường chuẩn cholesterol da theo chiu cao cc peak
chuẩn cholesterol
21
3.1
Biu đ hm lưng cholesterol trong trứng của cc mẫ u
nghiên cứ u
33
3.2
Kt qu điện di DNA tổng s
35
3.3
Kế t qu điện di sn phẩm PCR
36
3.4
So snh trnh t đon D -loop của 3 mu g Ri, Ác, Tre
vi gà Gallus gallus gallus m s NC 007236 v g
Gallus gallus gố c Nhậ t m s AB114078
41

1.3.1 Đặc đim cấu trc v trnh t của DNA ty th 10
1.3.2 Ý nghĩa v mặt tin ho của DNA ty th 11
1.4 Đặc đim cấu trc v di truyn hệ gen ty th g 12
1.5 Tnh hnh nghiên cứu DNA ty th g trên th gii v ở Việt Nam 14
1.5.1 Tnh hnh nghiên cứu DNA ty th g trên th gii 14
1.5.2 Tnh hnh nghiên cứu DNA ty th g ở Việt Nam 16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Chƣơng 2
VẬT LIỆU V PHƢƠNG PHP NGHIÊN CU
2.1 Vt liệu 18
2.1.1 Ngun gc mu 18
2.1.2 Đị a đim thí nghiệm 18
2.2 Ho chất v thit bị 18
2.2.1 Hóa chất 18
2.2.2 Thit bị sử dụng 18
2.3 Phương php nghiên cứu 19
2.3.1 Phương php ho sinh xc định hm lưng cholesterol 19
2.3.2 Phương php sinh hc phân tử 22
2.3.2.1 Tch chit v tinh sch DNA tổng s từ mu động vt 22
2.3.2.2 Kỹ thut điện di DNA trên gel agarose 25
2.3.2.3 Nhân vng điu khin D- loop bằng kỹ thut PCR 26
2.3.2.4 Tinh sch sn phẩm PCR 29
2.3.2.5 Phương php xc định trnh t DNA. 31
2.3.3 Phương php xử lý s liệu 31
Chương 3. KẾT QUẢ V THẢO LUẬN
3.1 Hm lưng cholesterol trong trứng của cc mu nghiên cứu 33
3.2 Xc định trnh t nucleotide của vng D-loop v đnh gi đa dng
di truyn của 3 mu g nghiên cứu 35
3.2.1 Tch chit v tinh sch DNA tổng s từ mu g 35
3.2.2 Nhân vng điu khin D-loop của DNA ty th 36

pht trin thuộc th gii tây phương. Có nhiu nguyên nhân k hc nhau dn ti
nhưng căn bệ nh như trên , nhưng một nguyên nhân rất quan trng đó l do
hm lưng cholesterol trong cơ th cao. Khi ch độ ăn ung thay đổi th hm
lưng cholesterol cũng thay đổi theo. Những ngun thc phẩm giu
cholesterol đó l những loi thức ăn có ngun gc động vt nhất l bu dục,
no, tim, lòng đỏ trứng Do sở thích v tnh hnh kinh t, nhiu người rất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
thích ăn trứng g v coi đó l ngun thc phẩm chính trong gia đnh. Trong
trứng, đặc biệt l lòng đỏ có hm lưng cholesterol rất cao. Có nhiu loi
trứng khc nhau như trứng g, trứng chim, trứng vịt Mỗi ging g khc
nhau th trứng có hm lưng cholesterol cũng khc nhau. Như vy việc la
chn loi trứng vừa đm bo dinh dưng vừa đp ứng nhu cu, sở thích của
mỗi c nhân m vn bo vệ sức khoẻ l rất quan trng.
Đng thời cng vi s pht trin của kĩ thut sinh hc phân tử, chng tôi
mun xc định s đa dng di truyn ở mức phân tử của cc ging g qua
nghiên cứu trnh t vng điu khin D-loop ty th của cc ging g đó.
Xuất pht từ những lý do trên chng tôi đ tin hnh đ ti : “ Xác định
hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vng điều khiển D-
loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xc định hm lưng cholesterol trong trứng của 3 ging g.
- Xc định v so snh trnh t vng điu khin D-loop DNA ty th của
3 ging g.
- Đnh gi quan hệ di truyn giữa cc ging g.
3. Nội dung nghiên cứu
- Xc định hm lưng cholesterol trong trứng g Ri, g Ác, gà Tre.
- Xc định v so snh trnh t vng điu khin D-loop ty th của g Ri, g Ác,
gà Tre.

Lp chim (Aves)
Bộ g (Galliformes)
H Trĩ (Fasianidea)
Chủng Gallus (giố ng gà Bankip )
Loài Gallus gallus.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
G đưc thun ho đu tiên ở Ấn Độ cch đây 5000 năm, sau đó l Ba
Tư. Nhờ s tin bộ trong công tc chn ging, từ cc ging g địa phương của
châu Á, sau khi nhp vo châu Âu th kỷ XVIII v XIX, đu tiên l ở nưc
Anh, sau đó l Mỹ, cc ging g ny đưc lai to thnh nhiu ging g có
năng suất cao hơn.
Ở nưc ta, g rừng đưc thun ho v nuôi sm nhất ở vng Vĩnh Ph,
H Bắc, H Tây… Từ ging g nuôi ban đu l tin thân của g Ri hiện nay
nhân dân ta đ to đưc nhiu ging g: g Mía, g Ác, g Ri, gà Tre, gà
Đông To, g Vng …
1.1.1 Gà Ác
Gà Ác có tên khoa hc l Gallus domestices brisson. Đây l loi g c
nhỏ đặc biệt đưc thun ho v nuôi dưng như cc ging g khc, lông trắng
mưt, ton bộ da, mắt, thịt v xương, nội tng đu đen, chân đen có 5 ngón.
Trưc đây, g Ác đưc nuôi chủ yu ở đng bằng sông Cửu Long và
min tây Nam Bộ v mặc d l ging g đưc coi l vị thuc quý có th chữa
nhiu bệnh, nhưng không ai dm nuôi trn lan v kh năng cho thịt thấp m
gi thnh li cao. Nhưng cuộc sng ngy cng đi lên, những đặc sn quý mi
đưc bit ht gi trị của nó. G Ác đ đưc nuôi nhiu ở min Trung v min
Bắc như Nghệ An, Hi Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Đông Anh, Hưng
Yên Lc ny th người nuôi mi thấy rằng đây l ging g nhanh nhẹn, chăm
chỉ chịu khó nhặt nhnh kim mi, chịu lnh tt v có sức sng cao. Như th
có th nuôi đưc c qung canh (nuôi chăn th) hay nuôi thâm canh (nuôi

kh năng chịu đng tt hơn khi nuôi ở điu kiện thời tit lnh. G Ri đẻ trứng
sm, tuổi đẻ đu lc 123 ngy tuổi. Sn lưng trứng của g mi trong một
năm từ 80-120 qu. Khi lưng trứng bnh quân là 38 – 42 g. G Ri có khi
lưng cơ th ở tuổi trưởng thnh như sau: con trng từ 1,800 g đn 2,500 g,
con mi từ 1,300 g đn 1,800 g.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
Đây l ging g thích hp vi khí hu v điu kiện chăn nuôi qung
canh ở nưc ta. G chịu khó kim ăn khi nuôi trong điu kiện chăn th trong
vườn hay ngoi đng. Hng ngy người nuôi chỉ phi cho ăn rất ít, một vi
nắm thóc vi cho c đn khi gi chng v chung, ngoi ra chng t kim đủ
khi đưc th ngoi vườn [4], [7], [8].
1.1.3 Gà Tre
L ging g địa phương đưc nuôi ở một s tỉnh Nam Bộ ở Việt Nam.
Kích thưc của g nhỏ con, g trng có lông mu trắng, đuôi v cổ đen. G
mi mu vng, thấp chân. G trng v g mi nhỏ hơn g Ri. G Tre có tp
tính l hay bay v đu trên hng ro. Người nuôi chủ yu l nuôi lm cnh.
Trong những năm gn đây, nh nưc có nhiu d n nhằm gn giữ v bo tn
quỹ gen của cc loi gia cm của nưc ta.
1.2 Cholesterol
1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol của trứng gà
Cholesterol l chất bo steroid, nó km tan trong nưc nhưng tan nhiu
trong m v có th to este vi axit bo, nó không th tan v không di chuyn
ở dng t do ở trong mu. Cholesterol có công thức cấu to như sau:

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của cholesterol
Nhn vo công thức cấu to ta thấy, cấu trc cơ bn của cholesterol l
nhân sterol đưc tổng hp từ cc phân tử axetyl - CoA và một phn phân tử
của cholesterol l rưi cn (alcohol). Cholesterol có ở nhiu loi thc phẩm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
- Một tỷ lệ nhỏ cholesterol đưc sử dụng theo cc con đường:
+ Đưc tuyn thưng thn sử dụng đ tổng hp hormon vỏ tuyn
thưng thn.
+ Hnh thnh estrogen v progesterol ti bung trứng.
+ Đưc dịch hon sử dụng đ tổng hp testostereone.
+ Cholesterol tham gia cấu trc mng t bo.
+ Một lưng nhỏ cholesterol có mặt ti biu b của da. Cng vi cc
chất bo khc, cholesterol to cho da cc chức năng:
+) Khng li việc hấp thu cc chất ho tan trong nưc
+) Khng tc động của nhiu ho chất.
+) Ngăn cn qu trnh bc hơi nưc của da [15],[19], [28].
Như vy cholesterol có vai trò rất quan trng trong cơ th khi hm lưng
của nó trong cơ th ở mức ph hp. Ở người trưởng thnh, cholesterol ton
phn ở mức bnh thường vo khong 4-5,6 mmol/lít. Những người có mức
cholesterol cao hơn mức ny sẽ dn đn nhiu bệnh khc nhau.
1.2.4 Tc hại cholesterol trong cơ thể khi vƣợt qu mức bnh thƣờng
Người ta thấy rằng, cholesterol l nguyên nhân gây nên cc bệnh tim
mch, xơ động mch, huyt p cao, thiu năng mch vnh, nhi mu cơ tim,
tai bin mch mu no Trên th gii cũng như ở nưc ta, cc bệnh v tim
mch ngy cng tăng và l nguyên nhân gây tử vong hng đu ở nhiu nưc.
Đn ông có nguy cơ bị bệnh tim cao hơn đn b. Ở Mỹ, hng năm có khong
6 triệu người bị bệnh tim v trong s ny có khong 1,5 triệu bị đau tim v
trong s ny có khong 1/3 bị cht. Khong 1/5 trong s cc trường hp đau
tim không h có triệu trứng hay cnh bo trưc. Tn suất đn ông Mỹ bị cht
v bệnh tim l khong 200/100.000 dân s. Ở Anh, tỉ suất ny l khong
250/100.000 dân s [16], [21].
*Cơ chế gây bệnh xơ vữa động mạch của cholesterol

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
khi hnh thnh trong động mch gan, động mch thn, động mch cc chi,
động mch d dy, ruột [16], [21].
*Biện php điều chỉnh cholesterol trong mu
Đ gim hm lưng cholesterol trong mu có nhiu biện php khc nhau
như sử dụng cc loi thuc có chứa chất Simvastatine v chất Ezetimibe hay
cc loi thuc có chứa Statin. Nhưng một biện php hữu hiệu đ điu chỉnh
cholesterol trong mu l bằng ch độ ăn ung hp lý.
Do sở thích v s thiu hiu bit v thnh phn dinh dưng của cc loi
thc phẩm, một s người thường xuyên sử dụng một s lưng ln cc thc
phẩm có chứ a nhiu cholesterol như óc, gan, cc loi thịt có chứa nhiu chất
béo (thịt heo, g, vịt, c) v đặc biệt l trứng. Có những người ăn thường
xuyên một lưng ln trứng trong một thời gian di m không bit ti hu qu
m nó sẽ gây ra. Trứng l thức ăn rất bổ dưng cho cơ th. Tuy nhiên, chng
ta chỉ nên ăn vi một lưng hp lý đ góp phn đ phòng v gim lưng
cholesterol trong mu đ trnh cc bệnh v tim mch.
1.3 Đặc điểm DNA ty thể
1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trnh tự của DNA ty thể
DNA ty th (mtDNA) ở dng chuỗi kp, trn, mch vòng. Kích thưc
của bộ gen ty th thay đổi khc nhau ở mức phân loi Bộ trở lên.
Ở t bo động vt kích thưc của mtDNA nhỏ, cho ti nay đ xc định
đưc trnh t đy đủ của bộ gen ty th người, chuột, bò, tất c đu có kích
thưc khong 16,5 kb. Mỗi t bo có vo khong vi trăm ty th. Mỗi ty th
có nhiu bn sao của DNA. Nấm men có kích thưc bộ gen ty th khong 84
kb (ở S.cerevisiae), trong đó rất nhiu vng không mang intron di xen kẽ
giữa cc vng exon. Ở thc vt th có s bin động rất ln v kích thưc bộ
gen ty th, mtDNA của thc vt có kích thưc ti thiu khong 100 kb. Chức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


12
protein to ra đưc sử dụng đ vn chuyn điện tử v phosphoril hóa trong ty
th. Gen ty th g có cc đặc đim riêng, khc vi lp th v lưng cư đó l:
một đim khởi đu sao chp của chuỗi nhẹ tương đương vi trnh t nằm giữa
hai gen tRNA (Cys) và tRNA (Asn) đu có ở tất c động vt có xương sng
đ đưc gii trnh t genome ty th, riêng ở g li không có đặc đim ny.
Đng thời gen COI (cytochrome oxidase I) có m mở đu l GTG thay v
ATG.
Trnh t đy đủ ny của hệ gene ty th g nh là cơ sở cho nhiu công
trình nghiên cứu v DNA ty th của cc ging, cc loi thuộc bộ g
(Galliormes). Ton bộ DNA ty th g nh đưc lp thnh sơ đ như sau:

Hình 1.2. Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus
(Desjadins và Morais, 1990)
ND: NADH đehidrogenaza
CO: cytocrom oxidaza
H (Heavy strand): chuỗi nặng
L (Light strand): chuỗi nhẹ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


14
1.5.1 Tnh hnh nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới
Hiện nay, trên th gii ngnh chăn nuôi gia cm phát trin nhanh c v
s lưng v chất lưng. Mỹ l nưc đi đu th gii v ngnh chăn nuôi gia
cm, đặc biệt trong lĩnh vc to ra những ging g cơ bn. Sau Mỹ l Php,
Trung Quc, Anh, Đức, H Lan… Ở cc nưc Đông Âu, chăn nuôi gia cm
cũng pht trin, đin hình là Hungari và Bungari.
Dưi đây l một vi nghiên cứu cụ th trên một s loi thuộc bộ G:
Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đ công b trnh t đy đủ của
mtDNA của g nh (Gallus gallus) gm 16775 bp. Vi trnh t ny, cc nh
khoa hc đ có cơ sở đ tin hnh nghiên cứu mi quan hệ chủng loi giữa
cc đi tưng thuộc bộ g.
Năm 1994-1995, Fumihito v cộng s [20] đ nghiên cứu mi quan hệ
chủng loi giữa cc loi g rừng, công, trĩ, da trên phân tích đon điu
khin ty th. Kt qu phân tích đa hnh chiu di cc đon gii hn (RFLP)
trên vng điu khin mtDNA cho php cc tc gi ny đưa ra một sơ đ phân
loi giữa cc loi trên. Đng thời h đ xc định đưc trnh t của 400
nucleotid đu tiên trên vng điu khin của mtDNA. Kt qu nhn đưc đ
chỉ ra s lặp li của một đon khong 60 nucleotide trên vng điu khin của
mtDNA l đim đặc trưng của ging Gallus.
Randi v cộng s (1997) [29] đ phân tích trnh t của một phn đon
điu khin ty th (đon D-loop) của 2 loi g Lôi đặc hữu ở Việt Nam v đ
chỉ ra s khc biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa hai ging ny.
Năm 1999, Kimball v cộng s [23] cũng da trên s phân tích đy đủ
của gen cytocrom b (1143bp) v đon siêu bin (350bp) của vng điu khin
mtDNA đ xc định mi quan hệ chủng loi của một s loi Trĩ v g Gô. Hai
cây phân loi đưc xây dng từ hai hệ thng s liệu nhn đưc trên hai đon
gen cho thấy s khc nhau l rất ít.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


16
Từ đó xc định bưc đu đưc s khc biệt trên vng điu khin D-loop của
mtDNA của 3 loi g Lôi. Tuy nhiên, đ có những kt lun chính xc v vấn
đ ny cn phi xc định trnh t vng điu khin của 3 dòng g Lôi nói trên.
Năm 2000, Nguyễn Hi H v cộng s [3] đ to dòng phân tử đon
gen điu khin DNA ty th của 2 loi g Lôi đặc hữu Việt Nam trong vector
pBluescript KS(-) đ chuẩn bị cho việc đc v so snh trnh t nucleotide
vùng D-loop.
Năm 2006, Địch Thị Kim Hương v cộng s [5] đ xc định đưc trnh
t vng D-loop gm 1227 nucleotide của 2 mu g Ác Tim v Lương
Phưng, đ pht hiện đưc 22 vị trí khc biệt v nucleotide giữa 2 đi diện
trên.
Năm 2007, Lê Đức Long v cộng s [6] đ gii trnh t v so snh trnh
t nucleotide vng D-loop của 3 đi diện g Mông có ngun gc từ Điện
Biên, H Giang v Yên Bi đưc nuôi ti tri g Nông Lâm Thi Nguyên theo
d n g sch. Kt qu nghiên cứu đ xc định trnh t vng D-loop gm
1227 nucleotide của 3 mu g nghiên cứu v đ xc định đưc 10 vị trí khc
biệt v nucleotide giữa cc đi diện của 3 mu g ny.
Năm 2008, Bi Thị Kiu Vân v cộng s [14] đ gii trnh t v so
snh trnh t nucleotide vng D-loop của 3 ging g Ri, g Mông, g Sao
nuôi ti Thi Nguyên. Kt qu nghiên cứu đ xc định trnh t vng D-loop
gm 1220 nucleotide của 3 mu g nghiên cứu v đ xc định đưc 16 vị trí
khc biệt v nucleotide giữa cc đi diện của 3 mu g ny.