Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
MỤC LỤC
CHƯƠNG I: PROTEIN 2
BÀI 1: PHẢN ỨNG BIURE 2
BÀI 2: KẾT TỦA THUẬN NGHỊCH BẰNG MUỐI TRUNG TÍNH 4
BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP SORENSEN 6
(PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẠM FORMOL) 6
BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNGPROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 7
(GIẢNG TRÊN MÔ HÌNH) 7
CHƯƠNG II: ENZYME 9
BÀI 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME 9
BÀI 2: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HOẠT HÓA VÀ KÌM HÃM ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA
ENZYME 10
BÀI 3: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ α -AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH 11
CHƯƠNG III: GLUCIDE 13
BÀI 1: PHẢN ỨNG VỚI THUỐC THỬ FEHLING 13
BÀI 2: PHẢN ỨNG SELIWANOFF 15
BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ 17
CHƯƠNG IV: VITAMIN 19
BÀI 1: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN A 19
BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN C 20
BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C 21
BÀI 1: SỰ NHŨ TƯƠNG HÓA LIPIDE 23
BÀI 2: PHẢN ỨNG XÀ PHÒNG HÓA 24
BÀI 3: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ IOD CỦA CHẤT BÉO 25
BÀI 4: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ ACIDE CỦA CHẤT BÉO 27
BÀI 5: XÁC ĐỊNH LIPIT TỔNG SỐ 28
(GIẢNG TRÊN MÔ HÌNH) 28
- 2010 -
1
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5

Dung dịch màu tím
Chú ý không cho quá nhiều CuSO
4
vì màu xanh của Cu(OH)
2
được tạo thành
 Giải thích:
- 2010 -
2
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
− Thuốc thử của phản ứng màu biure là dung dịch NaOH và CuSO
4
, đôi khi nó còn
được gọi là tác chất biure
− Tuy nhiên chữ biure ở đây không phải là thuốc thử có chứa biure mà là vì cả biure
và protein đều cho phản ứng màu giống nhau với NaOH và CuSO
4
, Cường độ màu
thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide
− Phản ứng so màu Biure, liên kết peptide với Cu
2+
trong MT kiềm, là phản ứng đặc
trưng để nhận biết protein
 Nguyên tắc các phản ứng màu khác của protein:
− Phản ứng xantoproteic: đặc trưng với các axit amin vòng thơm. Các gốc
amino acid Tyr,Trp,Phe trong protein tác dụng với HNO
3
đặc tạo thành màu
vàng và sau khi thêm kiềm sẽ chuyển thành da cam
− Phản ứng ninhydrin: đặc trưng với các α- axit amin.

các yếu tố gây kết tủa ,protein trở về trạng thái dung dịch keo bền.
− Các protein khác nhau có thể bị kết tủa vơí các nồng độ muối khác nhau,vì vậy có
thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng.
II) Nguyên liệu và hóa chất:
− Dung dịch lòng trắng trứng không pha loãng.
− Dung dịch (NH
4
)
2
SO
4
bảo hòa .
− Tinh thể NaCl.
− Nước cất.
III) Cách tiến hành & kết quả:
1) Cho vào ống nghiệm 3ml lòng trắng trứng + 3ml dd (NH
4
)
2
SO
4
bảo hoà, lắc đều đến
khi dung dịch bán bảo hoà và xuất hiện kết tủa globulin. Để 5 phút, lọc bỏ kết tuả ( thấm
ướt giấy lọc bằng dd (NH
4
)
2
SO
4
) vào một ống nghiệm khác .

- 2010 -
4
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
Mỗi loại protein kết tủa ở các nồng độ khác nhau .Khi cho NaCl vào ,đầu tiên
Globulin kết tủa trước .Sau đó đó lọc hết kêt tủa ,cho vào dịch lọc CH
3
COOH 1%, pH
giảm làm xuất hiện kết tủa Albumin.
- 2010 -
5
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
Bài 3: PHƯƠNG PHÁP SORENSEN
(Phương pháp xác định đạm formol)
I) Nguyên tắc:
− Các amino acide có thể phản ứng với formol trung tính để tạo thành dẫn xuất
metylenic.Kết quả là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó ,ngược lại nhóm
cacboxyl trong amino acide tồn tại dạng metylen tự do có thể chuẩn độ với NaOH .
− Phương pháp được ứng dụng trong trường hợp nhóm cacboxyl và nhóm amin tự
do bằng nhau.
II) Nguyên liệu và hóa chất:
− Dung dịch formol ½ (pha formol : nước cất tỉ lệ 1:1 và chỉ chuẩn bị trước
khi dùng).
− Nước mắm,nước cất.
− Dung dịch NaOH 0,1N.
− Thuốc thử Phenolphtalein 3%.
III) Cách tiến hành & kết quả:
Lấy 2 bình nón và đánh dấu bình 1 và bình 2
 Bình 1 : Dùng làm bình kiểm tra. Cho vào 50ml dd formol ½ và thêm vào đó 3
giọt phenolphthalein 3%.Sau đó dùng dd NaOH 0,1N để hiệu chỉnh màu trong
bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt. Ta được formon ½ trung hòa

a là lượng mẫu (ml) ứng với 10ml dịch mẫu pha loãng x lần (a= 1 ml =
0,001 l).
⇒ M(g/l) = 1,4 (0,0 106 – 0,00045 )/0.001 = 14,21
- 2010 -
6
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
Bài 4: ĐỊNH LƯỢNGPROTEIN BẰNG PHƯƠNG
PHÁP KJELDAHL
(Giảng trên mô hình)
I) Nguyên tắc:
− Dưới tác dụng cùa H
2
SO
4
đặc ở nhiệt độ cáo ,các hợp chất hữu cơ có chứa
nitơ bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO
2
và H
2
O ,còn nitơ chuyển thành ammoniac và
tiếp tục kết hợp với H
2
SO
4
tạo thành muối amoni sulphate . Quá trình được tiến hành
theo các bước sau :
− Vô cơ hóa mẫu :
R-CHNH
2
– COOH + H

3
được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ là máy
Parnas –Wargner (máy chưng cất đạm )và được dẫn đến một bình tam giác có chứa
một lượng thời H
2
SO
4
.Từ đây cho phép chúng ta xác định được lượng NH
3
phóng
thích ra ,có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu :
NH
3
+ H
2
SO
4
 (NH
4
)
2
SO
4
+ H
2
SO
4dư
− Chuẩn độ H
2
SO

− HCl loãng .
(Nên dùng ống chuẩn để chuẩn bị H
2
SO
4
và NaOH 0,1N)
III) Cách tiến hành & kết quả:
− Đầu tiên hút 1ml (đối với nguyên liệu lỏng ) hay cân chính xác 1g (đối với
nguyên liệu khô đã nghiền nhuyễn ) cho vào bình Kjendanl ,cho thêm 10ml H
2
SO
4
đậm đặc (d=1,84).Để tăng quá trình vô cơ hóa (đốt cháy) cần cho thêm chất xúc
tác.Tốt nhất là dùng 0,5g hỗn hợp K
2
SO
4
: CuSO
4
: Se (100:10 :1). Có thể dùng một
mình Se kim loại 0,05g hoặc dùng hỗn hợp CuSO
4
và K
2
SO
4
hoặc acid perchloric.
- 2010 -
7
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5

2
SO
4
dư bằng dung dịch NaOH
0,1N.
− Sau khi đã lấy bình hấp phụ đặt bình nước cất vào ,đóng khóa,đồng thời
mở khóa ở bình rửa .Dung dịch chuyển từ bình cất sang bình rửa ,tháo bỏ dung dịch
bẩn đi .Sau khi thí nghiệm xong phải rửa sạch máy cất vi lượng 1 lần bằng HCl loãng
và nhiều lần bằng nước cất .
Tính kết quả :
Hàm lượng nitơ tính theo công thức sau :
V
ba
X
.10
100.10000.0014,0).( −
=
X: hàm lượng nitơ (g/l)
a: số mol H
2
SO
4
0,1N đem hấp thụ NH
3
b: số mol NaOH 0,1N tiêu xchuẩn tiêu tốn cho chuẩn sđộ
V: số ml phẩm vật đem vô cơ hóa
0,0014: lượng g nitơ ứng với 1ml H
2
SO
4

nhiệt độ trên và đặt các ống nghiệm ở các nhiệt độ cũ
− Sau 1, 2, 4, 6, 8 và 12 phút lấy từ mỗi ống 1 giọt, nhỏ vào các
giọt thuốc thử Lugol đã chuẩn bị sẵn trên bản kính. Quan sát màu tạo thành
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4
1 phút
Xanh đen Tím đen Đen Đen đậm
2 phút
Xanh đen Đen nhạt Tím đen Nâu đất
4 phút
Xanh đen Nâu đen Nâu nhạt Nâu đất nhạt
6 phút
Xanh đen Nâu đen Nâu nhạt nhạt Nâu đất nhạt
8 phút
Xanh đen Nâu đất Nâu nhạt hơn Nâu đất nhạt hơn
12 phút
Xanh đen Nâu đen Nâu rất nhạt Màu của lugol
Qua bảng trên ta thấy : trong ống 1 và ống 2 thì màu dd tinh bột thay đổi không đáng
kể, trong ống 3 và ống 4 màu của dd tinh bột thay đổi nhờ enzyme đã thủy phân
 Giải thích :
Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ phản ứng của enzyme. Nhiệt độ tối
thích của phản ứng enzyme nằm trong phạm vi 40-50
0
C và có thể biển đổi phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như độ sạch của enzyme, thời gian phản ứng…Nhiệt độ mà enzyme bị mất
hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn, thường vào khoảng trên 70
0
C. Ở nhiệt
độ tới hạn, enzyme bị biến tính, ít khi có khả năng được hồi phục lại hoạt độ. Ngược lại,
- 2010 -
9

I) Nguyên tắc:
− Các amylase là các enzyme thủy phân tinh bột, có 2 loại là α-amylase và
β-amylase. Sự tác dụng của hỗn hợp α-amylase và β-amylase trên tinh bột cho ta hỗn
hợp càng lúc càng nhiều glucose, maltose và dextrin đơn giản
− Để xác định hoạt độ của enzyme, ta xác định nồng độ enzyme thấp nhất có
khả năng gây thủy phân hoàn toàn tinh bột cho các sản phầm không đổi màu dd iode.
Đó là nguyên tắc của phương pháp Wohlgemouth
− Đơn vị Wohlgemouth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn
1mg tinh bột ở 37
o
C sau 30 phút có Cl
-
làm chất hoạt hóa
II) Nguyên liệu và hóa chất:
− Dung dịch amylase (dd nước bọt pha loãng 10 lần) => nước bọt của bạn nữ
− Dung dịch tnh bột 0,1%
− Dung dịch NaCl 0,9%
− Dung dịch Iode 0,02N
− Nước cất
III) Cách tiến hành & kết quả:
Chuẩn bị 10 ống nghiệm, đánh số từ 1-10,cho vào mỗi ống 1ml dd NaCl 0,9%. Trong
ống nghiệm 1 cho vào 1ml dịch enzyme, lắc đều. Sau đó lấy 1ml từ ống nghiệm 1 cho
vào ống nghiệm 2, lắc kỹ và lặp lại cho tới ống nghiệm 10 thì hút 1ml và bỏ đi. Trong
mỗi ống nghiệm cho vào 2ml dd tinh bột 0,1%, lắc đều và để vào tủ ấm ổn nhiệt ở 37
o
C
trong 30phút. Khi thời gian hết, làm nguội các ống đến nhiệt độ phòng và cho vào mỗi
ống 2 giọt dd Iode 0,02N và lắc đều
- 2010 -
11

Còn nếu nhóm OH glucoside của nhóm này liên kết với nhóm OH alcol
của monosaccharid kia thì disaccharid tạo thành vẫn còn tính khử
− Khi đun đường khử với dd thuốc thử Fehling thì kết tủa đỏ của Cu
2
O hình
thành ( do đường khử đã khử Cu(OH)
2
có trong Fehling thành CuO
2
)
II) Nguyên liệu và hóa chất:
− Dung dịch Glucose 1%
− Dung dịch Mantose 1%
− Dung dịch Saccharide 1%
− Thuốc thử Fehling A (CuSO
4
)
− Thuốc thử Fehling B (Seignet + NaOH)
III) Cách tiến hành & kết quả:
Lấy 3 ống nghiệm, đánh số từ 1-3 như sau :
 Ống 1 : cho 2ml glucose 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút
- Kết quả: có kết tủa đỏ gạch tươi ( Cu
2
O )
- PTPỨ:
 Ống 2 : cho 2ml maltose 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút
- Kết quả: có kết tủa đỏ gạch tươi ( Cu
2
O )
- PTPỨ:

2+
, chức aldehit bị oxi hóa thành axit hoặc
muối tương ứng
− Do glucose và maltose có tính khử nên khi
đun với dd thuốc thử Fehling thì kết tủa đỏ của
Cu
2
O hình thành ( do đường đã khử Cu(OH )
2
có trong Fehling thành CuO
2
)
- 2010 -
14
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
Bài 2: PHẢN ỨNG SELIWANOFF
I) Nguyên tắc:
− Khi trộn dd acid ascorbic với dd xanh metylen thì dd sẽ mất màu. Phản
ứng xảy ra do acid ascorbic bị oxi hóa thành acid dehidro ascorbic và xanh metylen
trở thành dạng không màu
II) Nguyên liệu và hóa chất:
− Dung dịch fructose 1%
− Dung dịch glutose 1%
− Dung dịch NaCl 1%
− Thuốc thử Seliwanoff
III) Cách tiến hành & kết quả:
Cho vào mỗi ống nghiệm 2ml thuốc thử Seliwanoff và thêm vào :
 Ống 1 : 2ml dd fructose 1%
 Ống 2 : 2ml dd glucose 1%
 Ống 3 : 2ml nước cất

− Lấy 1ml dd mẫu pha loãng thành 30-100ml dd dùng để xác định đường
khử
II) Chuẩn bị mẫu:
− 1g nguyên liệu thơm + H
2
SO
4
10% (ngập mẫu), đun cách thủy khoảng 1h,
lấy ra cho NaOH vào để trung hòa đến pH=7, lọc nếu có cặn ta được dung dịch mẫu
− Lấy 1ml dd mẫu pha loãng thành 30-100ml dd dùng để xác định đường
khử
III) Cách tiến hành & kết quả:
Thực hiện 9 ống nghiệm theo mẫu sau:
Số ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ml glucose 0,02mg/ml 0 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6
ml nước cất 1 1 0,95 0,9 0,8 0,6 0,4
ml đường định nồng độ 1 2
Nồng độ trong mỗi ống
chuẩn (µg/ml)
0 0 1 2 4 8 12 17,994 20,337
− Cho vào mỗi ống 1ml thuốc thử A (Na
2
CO
3
+ KCN/H
2
Ocất) và 1ml thuốc thử
B(K
3
Fe(CN)

4
đậm đặc , Vitamin A bị mất nước và tạo thành sản phẩm
ngưng tụ có màu không bền .Sau đó biến đổi nhanh thành màu đặc trưng của liporom
(nâu đen).
II) Cách tiến hành & kết quả:
− Nhỏ 1 giọt dầu cá hòa tan trong 25
giọt Cloroform, sau đó cho 1 giọt H
2
SO
4
đđ vào
rồi lắc đều
− Do khi tác dụng với H
2
SO
4
đđ, vitamin
A trong dầu cá bị mất nước tạo thành sản phẩm
ngưng tụ có màu hồng không bền, sau đó biến
đổi nhanh thành màu nâu đen
- 2010 -
19
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
Bài 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN C
I) Nguyên tắc:
Khi trộn dd acid ascorbic với dd xanh metylen thì dd sẽ mất màu .Phản ứng xảy ra do
acid ascorbic bị oxy hoá thành acid dehydro ascorbic và xanh metylen trở thành dạng
không màu
II) Nguyên liệu và hóa chất:
− Dd Vitamin C.

vào trong bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch 100ml. Lắc đều cho lượng
axit ascorbic có trong nguyên liệu được hoà tan hoàn toàn, lọc cặn vào trong bình
tam giác 250ml, ta có dung dịch mẫu hay dd nguyên liệu
− Hút 20ml dd nguyên liệu đã được lọc cặn vào trong bình nón, thêm5-10 giọt hồ
tinh bột 1%
− Dùng I
2
0,01N chuẩn độ cho đến khi dung dịch bắt đầu xuất hiện màu xanh lam
nhạt là được
− Lặp lại chuẩn độ 3 lần, lấy kết quả trung bình ta được V(ml) dd I
2
0,01N dùng để
chuẩn độ Vitamin C
Chuẩn độ bằng dd I
2
0,01N
Lần 1
0,5
Lần 2
0,5
Lần 3
0,6
Trung bình
V= 0,533ml
 Hàm lượng Vitamin C : X(%) =
mV
VV
.
100.00088,0
2

− Triiođua oxy hóa vitamin C tạo acid dehydroascorbic:
C
6
H
8
O
6
+ I
3
–
+ H
2
O → C
6
H
6
O
6
+ 3I
-
+ 2H
+
- 2010 -
22
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
Chương V: LIPIDE
Bài 1: SỰ NHŨ TƯƠNG HÓA LIPIDE
I) Nguyên tắc:
− Sự nhũ tương hoá lipide trong cơ thể là giai đoạn đầu của sự hấp thụ chung.
− Để giữ sự cân bằng giữa môi trường phân hoá ( H

trắng đục ,để
một thời gian sẽ
phân lớp .
Cho mật rỉ đường vào thì
do trong rỉ đường do có
muối mật là chất gây nhũ
tương nên xảy ra hiện
tương nhũ tương nhưng
yếu hơn ống 1
- 2010 -
23
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
Bài 2: PHẢN ỨNG XÀ PHÒNG HÓA
I) Nguyên tắc:
− Chỉ số savon hóa là lượng mg KOH cần để trung hòa acide béo tự do cũng
như liên kết có trong 1g chất béo
− Dưới tác dụng của kiềm, glyxerit bị thủy phân tạo thành glyxerin và xà
phòng ( muối Natri hoặc Kali của acid béo )
II) Cách tiến hành & kết quả:
− Cho vào cốc sứ 0,5ml dầu lạc + 10 ml KOH 30%
− Khấy đều và đun cách thủy cho đến khi quánh lại thì ta được xà phòng, nếu cho nước
vào lắc lên sẽ thấy xuất hiện bọt xà phòng
 Giải thích:
Dưới tác dụng của enzyme, axit hoặc kiềm, đun nóng, mỡ bị thủy phân tạo thành
glixerin và axit béo hoặc muối của axit béo bậc cao gọi là xà phòng
Phản ứng như sau :
- 2010 -
24
Thực hành Hóa Sinh Lớp K14S1_Nhóm 2_tổ 5
Bài 3: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ IOD CỦA CHẤT BÉO

2
0,1N. Sau đó dùng giấy
bịt kín miệng bình tam giác để tránh bay hơi I
2
1ml H
2
O cất 2g Dầu ăn
Bình (1) (2) (3) (4) (5) (6)
Để yên trong tối từ 10 – 15 phút, rồi sau đó chuẩn độ bằng Na
2
S
2
O
3
0,1N đến khi
dung dịch có màu vàng nhạt
Na
2
S
2
O
3
0,1N dùng chuẩn độ
(ml)
9,7 9,7 9,8 9,7 9,6 9,7
Thêm vào mỗi bình 1ml dung dịch tinh bột 1%, và tiếp tục chuẩn độ đến khi mất
màu xanh
Na
2
S






++
=
(ml)
- 2010 -
25