TCNCYH 23 (3) 2003
Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích
đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt

Lê Thị Kim Tuyến
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng, Hà Nội

Các enzym giới hạn cắt ADN kép ở các vị trí đặc hiệu ngoài hoặc trong trình tự nucleotid đợc
nhận ra và để lại 3 dạng các đầu tận cùng: phẳng; chéo có ADN đơn 3 thừa, chéo có ADN đơn 5
thừa. Nghiên cứu này dùng một phơng pháp cho phép xác định kiểu cắt của các enzym giới hạn.
Phơng pháp giải trình tự Sanger đợc sử dụng để phân tích ADN ở xung quanh vị trí cắt nhng
dùng chất không phóng xạ. Song song các đoạn ADN tổng hợp kéo dài đợc cắt bằng enzym giới
hạn. Phản ứng Klenow mang hai hoạt tính là tổng hợp ADN 5 3 và exonucleasa 3 5 cho
phép xác định kiểu cắt của enzym giới hạn. Kết quả đã cho phép xác định vị trí cắt của hai enzym
mới. Điểm cắt Sml I nằm trong trình tự đối xứng đợc nhận: 5- C TPuPy AG - 3. BciV I nhận ra
một trình tự không đối xứng và cắt ngoài vị trí nhận : 5 - GTATCC(N)
6
- 3/3- CATAGG(N)
5
- 5.

I. Đặt vấn đề
Trong y học việc chẩn đoán và nghiên cứu
bệnh lý ở mức độ ADN ngày càng quan trọng.
Để phân tích đợc các ADN genom cần dùng
đến phản ứng cắt ADN giới hạn để tạo thành
các mảnh nhỏ có kích thớc nhất định. Phản
ứng này đợc xúc tác bắng các enzym giới hạn
thuỷ phân ADN ở các vị trí quyết định sau khi
đã nhận trình tự đặc hiệu gồm từ 4 đến 8 bp.
Tập hợp các enzym giới hạn là hết sức đa dạng

ADN đích pUC19 và ADN mồi ngợc có vị
trí 2627-2608 gắn biotin.
Sml I và BciV I là hai enzym giới hạn mới
đợc tìm ở hai chủng vi khuẩn thiên nhiên phân
lập tại Việt Nam từ Stenotrophomonas
maltophilia và Bacillus circulans. Sml I nhận
trình tự 5-CTPyPuAG-3. BciV I nhận trình tự
5-GGATAC-3 /5-GTATCC-3.

106
TCNCYH 23 (3) 2003
2. Phơng pháp giải trình tự nucleotid
Phơng pháp của Sanger [5] đợc sử dụng
nhng dùng các hoá chất không phóng xạ. Các
đoạn ADN điện di trên gel acrylamid đợc
truyền lên màng nylông theo phơng pháp
Southern blot [6]. Các đoạn ADN hiện lên bằng
phơng pháp miễn dịch học dùng avidine, cộng
hợp biotin-phosphatase và cơ chất CDP star tạo
sản phẩm phát quang của Phototope-Star
Chemiluminescent Detection kit (New England
Biolabs).
3. Xác định dạng cắt của các đoạn ADN
giới hạn
Đoạn dài ADN đợc tổng hợp và cắt với
enzym giới hạn phân tích, 30 phút, 37C. Tiếp
theo 3 àg ADN cắt đợc sử lý với 2U Klenow,
ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
III. Kết quả
Sml I cắt ADN của phagơ M13mp18 tại bốn

-5.
+ A T G C - C - T A G C + Hình 1: Vị trí cắt Sml I:
5C T Pu Py A G 3
3G A Py Pu T C 5
-: không có Klenow +: có Klenow
Hình 2: Vị trí cắt BciV I:
5GTATCC(N)
6


3
3CATAGG(N)
5

5
-: không có Klenow +: có Klenow

107
TCNCYH 23 (3) 2003
IV. Bàn luận
Đến nay, các enzym giới hạn đợc xác định
chủ yếu bằng các trình tự nucleotit đặc hiệu
nhận ra. Nhng vị trí cắt có thể xẩy ra ở nhiều
điểm khác nhau hoặc ngay trong các trình tự có
tính chất đối xứng hoặc ở ngoài các trình tự
không đối xứng cách vài nucleotit [7]. Các
enzym giới hạn nhận cùng một trình tự có khả

exonucleasa của enzym Klenow để lại sản
phẩm ADN nhỏ hơn; ADN đơn 5 thừa, phần
endonucleasa tổng hợp để lại sản phẩm ADN
dài hơn; ADN cắt phẳng có đặc điểm hoàn toàn
kép, Klenow không có tác động và ADN vẫn
giữ nguyên.
Phơng pháp đợc áp dụng trong trờng
hợp của hai enzym giới hạn đợc tìm ở Việt
Nam. Vị trí cắt của Sml I là 5- C TPuPy AG
- 3 nằm ngay trong trình tự đối xứng đợc
nhân ra. Vị trí cắt của BciV I là: 5-
GTATCC(N)
6
- 3/3- CATAGG(N)
5
- 5
nằm phía ngoài trình tự không đối xứng cách
vài nucleotit.
Phơng pháp này không dùng phóng xạ
hoàn toàn phù hợp với nhiều phóng thí nghiệm
không có điều kiện làm thí nghiệm với các chất
phóng xạ.
V. Kết luận
Phơng pháp đợc tả trong công trình này
cho phép phân tích các đầu tận cùng của các
đoạn ADN giới hạn. Trên cơ sở đó có thể xác
định thêm một đặc điểm quan trọng của một
enzym giới hạn nhất định là điểm cắt của nó.
Hai enzym giới hạn mới tìm ở Việt Nam đã
đợc phân tích.

inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977,
74:5463-67.
6. Southern E.M Detection of specific
sequences among DNA fragments separated by
gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 1975, 98 :
503-517.
7. Szybalski W., Kim S. C., Hasan N. and
Podhajska A. J. Class-IIs restriction enzymes-a
review. Gene, 1991, 100: 13-26.
8. Endow S.A., Roberts R.J. Two
restriction-like enzymes from Xanthomonas
malvacearum. J. Mol. Biol., 1977, 112: 521-
529.
9. Klenow H., Henningsen I. Selective
elimination of the exonuclease activity of the
deoxyribonucleic acid polymerase from
Escherichia coli B by limited proteolysis. Proc.
Natl. Acad. Sci., 1970, 65:168.
Summary
Nucleotide analysis of restricted fragment DNA
extremities for characterizing the restriction enzyme
cutting activity
The analysis of genomic DNA requires mostly its restriction into small fragments of definite
sizes. This reaction is catalyzed by restriction enzymes recognizing specific sequences 4-8
nucleotides long. Each restriction enzyme is characterized by one recognition nucleotide sequence
and its cut site on DNA. So far, more than 200 restriction enzymes with different specificities have
been found. If considering all the possibilities of palindrome sequences of 4-8 nucleotides,
interrupted or not, the number of restriction enzymes should be more than one thousand. With the
purpose to get a collection of restriction enzymes that cut DNA anywhere, we still continue to find
restriction enzymes having new specificities. This study presents a method able to characterize