Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2009: Tp 7, s 6: 780 - 787 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI
780

LựA CHọN ĐIềU KIệN TốI ƯU Để SảN XUấT CHITOSANASE
Từ
Streptomyces griceus
(chủng NN2)

Selection of Optimal Conditions to Produce Chitosanase from Streptomyces griceus
(strain NN2)
Ngụ Xuõn Mnh, Nguyn Th Phng Nhung
Khoa Cụng ngh Thc phm, Trng i hc Nụng nghip H Ni
a ch email tỏc gi liờn lc :
TểM TT
Chitosanase thy phõn chitosan thnh chitosan oligosaccharide (COS) cú ng dng rt ln
trong sn xut. Mc tiờu ca ti l la chn c chng x khun cú kh nng sinh tng hp
chitosanase cao, t ú chn la iu kin tt nht sn xut chitosanase. Trong 4 chng x khun
(Streptomyces griceus) cú kh nng sinh tng hp chitosanase, chng NN2 cú kh nng sinh tng
hp chitosanase cao nht ó c tuy
n chn. T ng cong sinh trng ca chng NN2 ó chn
thi im tip ging thớch hp l khong 36 h sau khi nuụi mụi trng hot húa. Mụi trng nuụi
cy thớch hp sinh tng hp chitosanase ca chng NN2 ó c chn la, l mụi trng thay th
MT3 ( cú thnh phn r ng l 3%), pH = 6,0, thi gian nuụi cy l 3 ngy. So sỏnh hai phng phỏp
lm sch bc u enzyme l ta mui amoni sunfate v ta ethanol cho thy phng phỏp ta mu
i
amoni sunfate tt hn v phõn xut 50 - 70% cho hiu qu lm sch cao nht, mc lm sch l 1.8
ln, hot tớnh riờng ca enzyme l 201,9 U/ml.
T khoỏ: Chitosan, chitosan oligosaccharide, Chitosanase, Streptomyces griceus.
SUMMARY
Chitosanase hydrolyzes chitosan to produce chitosan oligosaccharide (COS) which is applied
widely in industry. To select the best train of microorganisms and optimal conditions to produce

oligosaccharide (COS) rất đợc quan tâm do
có nhiều các tính năng công nghệ v tính
năng sinh học nh khả năng kháng vi sinh
vật, giảm cholesterol, miễn dịch v kháng
ung th (Wang v cs., 2007). Sử dụng
phơng pháp enzyme để sản xuất COS đã
khắc phục các nhợc điểm của phơng pháp
hóa học nh phải sử dụng lợng acid lớn, sản
lợng thấp v chất lợng của COS không
cao. Enzyme chitosanase thủy phân liên kết
-(1-4)-glycoside của chitosan thnh COS, nó
đợc tìm thấy từ: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm,
virus, sâu bọ, côn trùng v một số loi thực
vật, hiện nay nguồn cung cấp chủ yếu l vi
khuẩn, xạ khuẩn v nấm.
Sự sinh tổng hợp chitosanase phụ thuộc
vo nhiều yếu tố nh: nguồn C, N, chitosan,
pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy (Phạm Thị
Trân Châu v Phan Tuấn Nghĩa, 2007; Yoon
v cs., 2001; Zhou v cs., 2008). Nghiên cứu
ny đã lựa chọn đợc chủng xạ khuẩn NN2 có
khả năng sinh tổng hợp cao chitosanase, bớc
đầu nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy trong
đó sử dụng rỉ đờng 3% lm nguồn cơ chất
thay thế, thực hiện lm sạch bớc đầu enzyme
bằng amoni sunfate phân xuất 50 - 70%.
2. NGUYÊN LIệU V PHƯƠNG PHáP
2.1. Nguyên liệu
Chitosan (96% acetyl hóa), agar,
peptone, cao thịt, các hóa chất NaCl, NaOH,

C, sau 2 - 3
tuần cấy truyền lại một lần. Môi trờng cấy
truyền gồm: Manitol 1%, peptone 0,2%, cao
thịt 0,1%, cao men 0,1%, K
2
HPO
4
0,15%,
MgSO
4
.7H
2
O 0,05%, KNO
3
0,05%,
FeSO
4
.7H
2
O 0,001%, KCl 0,05%, (NH
4
)
2
SO
2
0,05%, tinh bột tan 2%, agar 2%, nớc cất.
2.4. Nuôi cấy
Các chủng xạ khuẩn đợc nuôi cấy trong
các bình tam giác 250 ml. Cấy mẫu giống đã
hoạt hoá (hoạt hóa 1 vòng que cấy trong 5ml

chủng xạ khuẩn
Tiến hnh nuôi chủng xạ khuẩn trong
môi trờng lỏng (môi trờng nuôi cấy). Cứ
sau 6 h lại lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp
thụ quang học (Absorbance) ở bớc sóng 620
nm (A
620
). Đờng cong sinh trởng đợc xác
định chính l sự thay đổi của độ hấp thụ
quang học trong quá trình nuôi cấy.
2.6. Xác định các điều kiện tối u cho sự
sinh tổng hợp chitosanase
Chủng xạ khuẩn đợc lựa chọn sẽ nuôi
cấy trong các bình tam giác chứa 100ml môi
trờng ở các môi trờng MT0, MT1,MT2,
MT3, MT4 v MT5, l môi với nồng độ rỉ
đờng tơng ứng từ 0%, 1%,,5%, pH từ 5-
7, thời gian 1-4 ngy. Sau khi chọn đợc điều
kiện tốt nhất, thực hiện nuôi cấy với thể tích
300 ml.
Ngụ Xuõn Mnh, Nguyn Th Phng Nhung
782
2.7. Xác định đờng kính vòng phân giải
của enzyme (phơng pháp đục lỗ
thạch)
Sau khi dừng nuôi cấy, ly tâm, lấy 50 l
dịch thu đợc nhỏ vo các lỗ thạch trên đĩa
petri có môi trờng agar-chitosan, để tủ lạnh
trong 2 h, ủ tủ ấm 37
o

o
C trong 5 - 10
phút, nhỏ vo mỗi ống 1 ml dung dịch Kali
natri tartrate 40%, để nguội đến nhiệt độ
phòng v đo A
575
. Hoạt tính enzyme đợc
tính theo đờng chuẩn D-glucosamin. Một
đơn vị hoạt tính enzyme chitosanase l lợng
enzyme cần thiết xúc tác phản ứng thuỷ
phân Chitosan để giải phóng ra 1 mol đờng
khử trong thời gian 1 phút ở các điều kiện
tiêu chuẩn của phơng pháp phân tích.
2.10. Xác định hm lợng protein theo
phơng pháp Bradford
Lấy 0,1 ml dung dịch protein cần xác
định, thêm 5 ml dung dịch thuốc nhuộm
Coomasie Blue G250, trộn đều, so mu trên
máy quang phổ ở bớc sóng 595 nm. Mỗi
mẫu đợc lm lặp lại 3 lần. Tính hm lợng
protein của mẫu theo đờng chuẩn.
3. KếT QUả V THảO LUậN
3.1. Hoạt tính của chitosanase từ các chủng
xạ khuẩn
Nuôi cấy cả 4 chủng trên môi trờng
MT0. Thu dịch thô enzyme rồi thử hoạt tính
bằng phơng pháp đục lỗ thạch v xác định
hoạt tính bằng phơng pháp DNS. Kết quả
trình by ở bảng 1 v hình 1. Kết quả cho
thấy 4 chủng xạ khuẩn đều có khả năng sinh

0
0.43
0
1.16
1.57
0.55
1.48
2.07
1.89
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66
h
A 620
MT0
MT2
0.184
0.371
0.082
0.252
0
0.1
0.2
0.3
0.4
SG 1SG 2SG 3XK 14

Hình 2. Đờng cong động học của chủng NN2 trên môi trờng MTO v MT2
Ngụ Xuõn Mnh, Nguyn Th Phng Nhung
784
0.30 d
0.38 c 0.38 c
0.51 b
0.91 a0.92 a
0
0.25
0.5
0.75
1
MT0 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5
Hoa t ti nh(U/ml)
0.525 c
0.919 b
1.157 a
0
0.5
1
1.5
p
H=5
p
H=6
p
H=7
Hình 3. ảnh hởng của môi trờng đến khả năng sinh chitosanase của SG2 Hình 4. ảnh hởng của pH môi trờng nuôi Hình 5. ảnh hởng của pH môi trờng nuôi

cấy trên MT2 đến hoạt tính chitosanase cấy trên MT3 đến hoạt tính chitosanase
La chn iu kin ti u sn xut chitosanase t Streptomyces griceus (chng NN2)

(U/ml)
3.5. ảnh hởng của thời gian nuôi cấy
Khi nuôi NN2 trên MT2 thì đến ngy
nuôi cấy thứ hai chitosanase có hoạt tính cao
nhất còn đối với môi trờng MT3 l sang
ngy thứ ba. Tuy nhiên hai giá trị cực đại
ny l khác nhau, trên MT2 l 1.157 U/ml
còn MT3 l 1.475 U/ml (Hình 6 v 7). Nh
vậy việc sử dụng môi trờng MT3 với 3 ngy
nuôi cấy cho khả năng chitosanase cao hơn.
Từ những kết quả đã đạt đợc, điều kiện
nuôi cấy đợc chọn lựa nh sau:
- Môi trờng nuôi cấy: MT3
- pH môi trờng nuôi cấy: 6
- Thời gian nuôi cấy: 3 ngy
- Nhiệt độ nuôi cấy: 37
o
C
- Chế độ lắc: 200 rpm
Trc cụ c
Cụ c
1,335
4,408
0,0102
0,0396
130,9
111,3

Ngụ Xuõn Mnh, Nguyn Th Phng Nhung
786
3.7. Tủa phân đoạn enzyme bằng amoni
sulfate v cồn ethylic
Đối với phơng pháp tủa cồn ethylic phân
đoạn enzyme thu đợc có hoạt tính riêng cao
nhất l phân đoạn 40 - 50% v 50 - 60% cồn,
tuy nhiên khi so sánh hiệu quả phân tách
giữa các phân đoạn l không cao, điều ny
cho thấy khả năng lm sạch cho chitosanase
bằng việc tủa cồn l không hiệu quả.
Đối với phơng pháp tủa phân đoạn
bằng muối amoni sunphate cho thấy hiệu
quả phân đoạn enzyme cao hơn, hoạt tính
riêng giữa các phân đoạn khác nhau rất rõ
rng. Trong các phân đoạn thì phân đoạn có
nồng độ muối 50 - 60% v 60 - 70% cho hoạt
tính riêng của chitosanase l cao nhất, 186
v 177,6 U/mg (Bảng 3 v 4).
Dựa trên những kết quả trên, phơng
pháp tủa muối amoni sunphate đã đợc lựa

Protein tng
(mg)
Hot tớnh riờng
(U/mg)
0 30 1,730 0,087 19,9
30 40 1,639 0,032 51,2
40 50 1,710 0,025 68,4
50 60 3,534 0,019 186,0
60 70 2,664 0,015 177,6
70 80 1,776 0,033 53,8
Bảng 5. Hoạt tính chitosanase tủa bằng muối amoni sunphate ở phân đoạn 50 - 70%
Phõn on
Th tớch
(ml)
Hot tớnh tng
(U)
Protein tng
(mg)
Hot tớnh riờng
(U/mg)
0 50
50 70
70 80
Ban u
10
10
10
40
a


- Trong quá trình thu nhận v lm sạch
enzyme thì phơng pháp tủa muối amoni
sunphate cho hiệu quả cao hơn so với phơng
pháp tủa bằng cồn ethylic, nồng độ muối
amoni sunphate thích hợp cho tủa phân
đoạn thu hồi chitosanase l 50 - 70%, mức độ
lm sạch l 1.8 lần.
TI LIệU THAM KHảO
Phạm Thị Trân Châu v Phan Tuấn Nghĩa
(2007). Công nghệ sinh học. NXB. Giáo dục.
Choi Y. J. et al. (2004). Purification and
Characterization of Chitosanase from
Bacillus sp. Strain KCTC 0377BP and Its
Application for the Production of Chitosan
Oligosaccharides. Applied and environmental
microbiology, 70 (8), 45224531.
Jung H.S. et al. (1999). Effective production
of chitosanase and chitinase by
Streptomyces griseus HUT 6037 using
colloidal chitin and various degrees of
deacetylation of chitosan. Biotechnol.
Bioprocess Eng, 4, 26-31.
Nogawa M. et al. (1998). Purification and
Characterization of Exo--D-