TCNCYH 29 (3) - 2004

13
Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ của
bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam

Phan Thị Ngà
1
, Kouichi Morita
2
1
Viện Vệ sinh dịch tễ trung ơng, Hà Nội
2
Viện Y học Nhiệt đới, Trờng Đại học Nagasaki Nhật Bản

Trong năm 2002, có 2 chủng virut Arbo mới đợc phân lập từ dịch não tuỷ (DNT) của bệnh nhân
có hội chứng não cấp (HCNC) ở miền Bắc Việt Nam bằng dòng tế bào muỗi C6/36. Virut hình cầu, có
vỏ (envelop), kích thớc khoảng 50 nm, vật liệu di truyền là ARN. Trình tự vật liệu di truyền của chủng
virut có ký hiệu 02VN208 không giống trình tự của các chủng virut đã công bố trên thế giới. Cặp mồi
đặc hiệu (specific) đợc thiết kế từ một phần trình tự clone gen của chủng virut có ký hiệu 02VN208
để định loại những chủng virut phân lập từ bệnh nhân và từ muỗi năm 2002 bằng kỹ thuật RT-PCR.
Có 2 chủng virut phân lập từ dịch não tuỷ (DNT) của bệnh nhân HCNC và có 4 chủng virut phân lập
từ muỗi đợc xác định dơng tính; Kết quả này là một bằng chứng cho thấy đây có thể là một loại virut
Arbo do muỗi truyền gây viêm não, mới đợc phát hiện ở Việt Nam. Virut Nam Định là tên của virut
đợc đặt theo tên địa phơng của bệnh nhân. Những nghiên cứu về huyết thanh học, siêu cấu trúc
của virut cần đợc thực hiện để có cơ sở phân loại virut Arbo mới này.

I. Đặt vấn đề
Viêm não do virut là một trong những
nguyên nhân gây tử vong ở trẻ em trong khu
vực châu á, đặc biệt là viêm não do virut viêm

bệnh và sau khi khỏi bệnh trên một năm (của
bệnh nhân - chủng virut có ký hiệu 02V208
đợc phân lập từ DNT).
Kháng thể kháng virut nhóm Alpha, Flavi,
Bunya, kháng thể gắn FITC do trung tâm
kiểm soát bệnh tật CDC, Colorado Mỹ cung
cấp.
Kháng thể định loại virut VNNB do Viện
VSDTTƯ, Hà Nội cung cấp.
Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR và cặp
mồi đặc hiệu định loại virut VNNB do Viện Y
học Nhiệt đới, Nagasaki cung cấp (841 N và
2670 R).
TCNCYH 29 (3) - 2004
Cặp mồi đặc hiệu với chủng virut có ký hiệu
02VN208 đợc thiết kế từ chuỗi kéo dài để tổng
hợp một sản phẩm PCR khoảng 400 bp.
Hoá chất cho kỹ thuật nhuộm âm bản do
Viện VSDTTƯ, Hà Nội cung cấp.
Dòng tế bào muỗi C6/36. tế bào Vero và
BHK 21, tế bào thần kinh chuột (Mouse
neuronal cells) môi trờng nuôi tế bào, các
trang thiết bị và vật liệu cần thiết khác.
2. Phơng pháp:
Phân lập virut: Mẫu DNT đợc làm tan
băng, gây nhiễm vào tế bào C6/36 [4, 7],
quan sát tế bào trong 5 ngày. Chai tế bào gây
nhiễm có hình ảnh huỷ hoại tế bào, nớc nổi
tế bào gây nhiễm đợc lọc qua lọc 0,22 nm,
hỗn dịch lọc đợc cấy truyền lần thứ hai trên

Kết quả phân lập virut bằng tế bào
C6/36. Hình 1. Hình ảnh chủng virut có ký hiệu 02VN208 đợc phát hiện bằng kính hiển vi
điện tử với kỹ thuật nhuộm âm bản (mũi tên chỉ hạt virut X 150.000 )

14
TCNCYH 29 (3) - 2004
Từ 148 mẫu dịch não tuỷ của bệnh nhân
có HCNC năm 2002, không phát hiện đợc
kháng thể IgM kháng virut VNNB bằng kỹ
thuật MAC-ELISA, sử dụng tế bào C6/36
phân lập đợc 4 chủng virut VNNB và 2
chủng virut không định loại đợc với các
kháng thể kháng virut nhóm Alpha, Flavi,
Bunya. Hai chủng virut không định loại đợc
có ký hiệu 02VN193 và 02VN208. Hình thái
virut đợc xác định bằng kính hiển vi điện tử
theo phơng pháp nhuộm âm bản, hai chủng
virut này có hình thái giống nhau: virut hình
cầu, có vỏ, kích thớc khoảng 50 nm.
Kết quả xác định virut.
Trong nghiên cứu này chủng virut có ký
hiệu 02VN208 đợc chọn để xác định các đặc
tính của virut. Kết quả thực nghiệm cho thấy
chủng virut này không gây liệt chuột, nhng
virut thích ứng trên tế bào C6/36 và nhiều
dòng tế bào của động vật có vú khác đặc biệt
là dòng tế bào thần kinh chuột. Sự thích ứng

Culex Tritaeniorhynchus và Culex Vishnui
(chủng virut có ký hiệu 02VN9, 02VN18,
02VN178 và 02VN108).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hình 2. Kết quả định loại các chủng virut phân lập năm 2002 bằng cặp mồi đặc hiệu
với chủng virut có ký hiệu 02VN208 (sản phẩm PCR khoảng 400 bp)

15
TCNCYH 29 (3) - 2004
Ghi chú các cột gen kiểm tra sản phẩm
PCR trên Agarose 1%: 1: Thang chuẩn DNA
100 bp; 2: Chứng dơng (02VN208); 3:
02VN193, 4: 02VN 9; 5: 02VN18,
6: 02VN178, 7: 02VN180, 8: vi rut VNNB;
9: Chứng âm; 10: Thang chuẩn DNA 1 kb)
IV. Bàn luận
Trong nghiên cứu này có 2 chủng virut
Arbo mới có vật liệu di truyền là ARN đợc
phân lập bằng dòng tế bào muỗi C6/36. Trình
tự vật liệu di truyền của chủng virut này đợc
xác định không giống trình tự vật liệu di truyền
của các virut đã đợc công bố trong ngân
hàng số liệu, nh vậy đây là một chủng virut
mới đợc phát hiện ở Việt Nam cũng nh trên
thế giới. Kết quả xác định dơng tính với các
chủng virut phân lập từ bệnh nhân và từ muỗi
năm 2002 bằng cặp mồi đặc hiệu với chủng
virut có ký hiệu 02VN208 là cơ sỏ để khẳng
định đây là virut gây HCNC do muỗi truyền

PCR trên Agarose 1%: 1: Thang chuẩn DNA
100 bp; 2: Chứng dơng (02VN208); 3 - 7:
ARN của virut trong nớc nổi tế bào gây
nhiễm chủng virut có ký hiệu 02VN208 sau 1,
2, 3, 4 và 5 ngày; 8: Chứng âm.

V. Kết luận
1. Virut Arbo mới đợc phân lập từ DNT
của bệnh nhân có HCNC năm 2002 có đặc
điểm: hình cầu, có vỏ, kích thớc khoảng 50
nm, vật liệu di truyền đợc xác định là ARN.
2. Virut thích ứng trên tế bào muỗi C6/36,
BHK-21và đặc biệt là tế bào thần kinh chuột.
Trình tự vật liệu di truyền của virut không giống

16
TCNCYH 29 (3) - 2004

17
trình tự của các chủng virut đã công bố trong
ngân hàng số liệu, nó là một chủng Arbo virut
mới đợc phát hiện ở Việt Nam.
Đề tài đợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm
virut Viêm não, Khoa Virut, Viện VSDTTƯ, Hà
Nội, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Y tế và Viện
VSDTTƯ.
Các tác giả xin trân trọng cảm ơn sự hợp
tác trong nghiên cứu này của:
- Tập thể cán bộ Khoa lây Viện Nhi
Trung ơng.

1997. Polyadenylation of telomerase RNA in
budding yeast. RNA 3:1337 1351.
6. Ha D. Q., Calisher C. H., Tien P. H.,
Karabatsos N., and Gubler D. J. 1995.
Isolation of a newly recognized Alphavirus
from mosquitoes in Vietnam and evidence for
human infection and disease. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 53 (1): 100 -104.
7. Igarashi, A. (1978). Isolation of singls
Aedes Albopictus cell clone sensitive to
Dengue and Chikungunyaviruses. J. Gen.
Virol. 40: 531 544.
8. Mackenzie J. S., Chua K. B., Daniels
P. W., Eaton B. T., field H. E., Hall R. A.,
Halpin K., Johansen C. A., Kirkland P. D.,
Lam S. K., McMinn P., Nisbet D. J., Paru R.,
Pyke A. T., ritchie S. A., siba P. Smith d. w.,
Smith G. a., Hurk A. F., Wang L. F., Williams
D. T. 2001. Emerging viral Diseases of
Southeast Asia and the Western Pacific.
Emerging Infectious Disease, Vol. 7, No.
3:497 504.
Summary
Detection of new viral encephalitis from Cerebrospinal fluids
of acute encephalitis syndrome patients in North Vietnam

Two new Arbo viruses were isolated from cerebrospinal fluids of acute encephalitis syndrome
patients in the North Vietnam in 2002 by C6/36 cells. It was determined spherical, envelope and RNA
virus. The sequence of the virus did not homology with any known sequences that are available in the
data bank. Specific primer pair was designed for RT-PCR to examine unknown human and mosquito