TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
Nghiên cứu hoàn chỉnh kỹ thuật nuôi cấy
đơn bào ký sinh và gây bệnh
Phạm Trí Tuệ, Phạm Văn Thân, Trơng Thị Kim Phợng,
Phạm Ngọc Minh, Lê Thị Tuyết Khanh, Cao Vân Huyền
Bộ môn Ký sinh trùng, Trờng Đại học Y Hà Nội
Đáp ứng yêu cầu nuôi giữ dài ngày một số chủng đơn bào phục vụ nghiên cứu và giảng dạy, chúng tôi đã
tiến hành đề tài này và có một số nhận xét sau:
1. Môi trờng Palova có thể sử dụng tốt để nuôi giữ E. histolytica và một số loại đơn bào khác nh: E.
gingivalis, Acanthamoeba, T. vaginalis. Những yếu tố đảm bảo cho sự phát triển tốt của đơn bào trong nuôi
cấy là: nhiệt độ, tỷ lệ huyết thanh ngựa, pH của môi trờng và lợng tinh bột gạo.
2. Quy trình nuôi cấy
- Nhiệt độ nuôi cấy luôn giữ ổn định ở 37
0
C.
- Đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy.
- Môi trờng nuôi cấy thích hợp cho sự phát triển của đơn bào:
+ Tỷ lệ huyết thanh ngựa: 10%.
+ pH của môi trờng nuôi cấy: 6 - 6,5.
+ Lợng tinh bột gạo: 5mg/1 ống nuôi cấy.
- Khi cấy truyền, lấy ở rìa đáy ống môi trờng có nhiều đơn bào nhất.
- Thời gian cấy truyền tốt nhất là ngày đơn bào có mật độ cao nhất và hoạt động khỏe. Với nuôi cấy amíp:
+ Ngày thứ 2 (3 lần cấy đầu).
+ Ngày thứ 3 (các lần cấy sau).
- Với quy trình này (tính đến tháng 7 năm 2004), chúng tôi đã nuôi giữ đợc 12 mẫu đơn bào thuộc các giống:
Entamoeba, Acanthamoeba và Trichomonas với thời gian từ 6 đến 24 tháng và hiện vẫn đang phát triển tốt.

i. Đặt vấn đề
Vấn đề nuôi cấy amíp trong phòng thí nghiệm
đã đợc chú ý từ lâu. Đến năm 1918 hai tác giả là
Boeck và Drbohlav đã tìm ra môi trờng để nuôi

tôi đã phân lập đợc 4 mẫu bệnh phẩm có E.
histolytica, ký hiệu là H1, H2, H3, H4. Mẫu H2 đã
làm phản ứng PCR với gen mồi là E. histolytica và
cho kết quả dơng tính.
- E. gingivalis: bốn mẫu bệnh phẩm có E.
gingivalis đợc phân lập từ bựa răng của những
bệnh nhân viêm quanh răng, ký hiệu là G1, G2, G3
và G4.
- Acanthamoeba: hai mẫu bệnh phẩm có
Acanthamoeba phân lập từ mảnh giác mạc của
bệnh nhân bị viêm loét giác mạc, ký hiệu là M1 và
M2 (Bệnh viện Mắt trung ơng gửi đến).
- Trichomonas vaginalis: bốn mẫu bệnh phẩm
có T. vaginalis phân lập từ dịch nhầy âm đạo của
bệnh nhân viêm âm hộ - âm đạo, ký hiệu là V1,
V2, V3 và V4.
2. Vật liệu nghiên cứu
2.1. Môi trờng nuôi cấy Palova
Là loại môi trờng lỏng, rẻ tiền, dễ pha chế đã
đợc sử dụng từ lâu gồm:
- NaCl: 4,25g; Na
2
HPO4: 0,30g; H
2
PO4: 0,23g;
Nớc cất: 500ml.
2.2. Huyết thanh động vật cho môi trờng
nuôi cấy: huyết thanh ngựa đợc cho vào môi
trờng ngay trớc khi cấy với các tỷ lệ 5%, 10% và
15%.

3.4. Kỹ thuật xác định mật độ đơn bào trong
môi trờng nuôi cấy: đếm số lợng đơn bào có
trong 0,05ml môi trờng nuôi cấy.
3.5. Kỹ thuật nhuộm đơn bào: nhuộm
Hematoxylin feric của Heidenhain và nhuộm cải
tiến Hematoxylin Eosin (HE).
3.6. Phản ứng PCR để định loại đơn bào: tiến
hành tại Labo Trung tâm, Trờng Đại học Y Hà
Nội.
3.7. Xử lý số liệu: theo phơng pháp thống kê y
sinh học.
iii. Kết quả 62
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
Bảng 1. Theo dõi sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trờng Palova qua các lần cấy
Mật độ (số con/0,05ml MTNC)
Ngày thứ 1 Ngày thứ 2 Ngày thứ 3 Ngày thứ 4 Ngày thứ 5
L
ầ

4
6
5
1
4
8
2
4
2
5
2
4
2
4
1
2
1
2
1
1
1
1
2 1 1 1
2 4
1
46 45 4
4
6
0
6

8
3
7
8
2
4
2
6
2
8
2
6
1
3
1
1
1
5
1
3
3 0 2 1
4 5
7
67 55 5
9
7
8
8
5
7

7
4
8
5
7
0
7
6
8
9
9
5
9
2
9
2
2
9
3
2
2
8
2
9
1
1
1
5
911
6 5

1
1
5
12
7 5
6
51 58 5
5
7
4
7
9
8
3
7
8
8
5
9
2
9
4
8
9
2
7
3
3
2
9

TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
Trong môi trờng Palova pH = 6,5 amíp phát triển rất tốt và không khác biệt so với môi trờng có pH
= 6 (p > 0,05). Tuy nhiên trong môi trờng Palova có pH = 7 amíp phát triển kém hơn rất nhiều và sự
khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001.
Bảng 4. So sánh mật độ ngày thứ 3 của mẫu amíp H2 trong môi trờng
Pavlova HT ngựa 10%, pH 6,5 với lợng tinh bột gạo khác nhau
Lợng tinh bột gạo (mg) Số lần đếm (n) TB p
3 (1) 30 71 p 1/2 < 0,001
5 (2) 30 113 p 2/3 < 0,001
10 (3) 30 75 p 1/3 < 0,001
Môi trờng Palova với lợng tinh bột gạo 5mg amíp phát triển tốt nhất và đạt mật độ trung bình ngày
thứ 3 cao hơn hẳn so với cùng môi trờng nhng lợng tinh bột gạo là 3mg và 10mg. Sự khác nhau này
có ý nghĩa thống kê với p < 0,001.
Bảng 5. Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trờng Pavlova ở nhiệt độ 37
0
C
Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC)
Ngày
theo dõi
ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5
Trung
bình
1 50 49 41 45 51 47
2 75 67 70 68 79 71
3 121 115 109 122 145 122
4 41 39 27 31 33 34
5 15 12 11 11 15 12
6 3 1 5 2 4 3
7 0 0 1 0 1 0
Trong môi trờng Palova (10% huyết thanh ngựa, pH = 6,5 và 5mg tinh bột gạo) ở nhiệt độ 37

C
Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC)
Ngày
theo dõi
ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5
Trung
bình
1 47 45 39 41 46 43
2 25 17 12 8 11 14
3 3 1 2 0 2 1
4 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0
ở nhiệt độ 36
0
C, amíp không những không phát triển mà còn giảm rất nhanh kể từ ngày thứ 2 và ngày
thứ 3 hầu nh không còn.
Bảng 8. Sự phát triển của mẫu amíp H2 trong môi trờng Pavlova ở nhiệt độ 37,5
0
C
Mật độ amíp (số con/0,05ml MTNC)
Ngày
theo dõi
ống 1 ống 2 ống 3 ống 4 ống 5
Trung
bình
1 46 42 39 47 45 43
2 39 42 37 29 31 35
3 9 11 12 7 6 9

G2
G3
Palova pH = 6,5
huyết thanh ngựa 10%,
5mg tinh bột gạo
10 tháng
9 tháng
9 tháng
Entamoeba
(Không gây bệnh)
sp nt 24 tháng
Acanthamoeba
(Mắt)
M1
M2
nt
12 tháng
5 tháng
T. vaginalis
(Sinh dục - tiết niệu)
V1
V2
V3
nt
15 tháng
8 tháng
8 tháng
6 tháng

Trong môi trờng Palova giống nh với amíp

cũng phù hợp với các nghiên cứu của một số tác
giả khác [4].
- Lợng tinh bột gạo trong môi trờng: kết quả
nghiên cứu của chúng tôi cho thấy với môi trờng
Palova huyết thanh ngựa 10%, pH 6,5 có 5mg tinh
bột gạo thì đơn bào phát triển tốt nhất. Lợng tinh
bột gạo 3mg và 7mg, đơn bào phát triển kém hơn
hẳn. Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê với p <
0,001 (bảng 4). Nghiên cứu của một số tác giả
khác chỉ nói nên cho một chút tinh bột gạo, mà
không đề cập cụ thể nên chúng tôi không so sánh
đợc [2], [8].
2. Qui trình nuôi cấy đơn bào: nh đã tiến
hành nghiên cứu áp dụng thích hợp trong Labo
để giữ chủng dài ngày
- Bệnh phẩm có amíp phải đợc tiến hành nuôi
cấy ngay. Môi trờng nuôi cấy cần thiết phải làm
ấm (khoảng 37
0
C) trớc khi cấy.
- Khi cấy từ bệnh phẩm sang môi trờng nuôi
cấy nên lấy chỗ có nhiều đơn bào (nhầy máu đối

66
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004
với amíp). Sau khi cho bệnh phẩm vào môi trờng
nên lắc nhẹ và cho ngay vào tủ ấm 37
0
C.
- Khi cấy truyền, lấy ở rìa đáy ống môi trờng

+ Tỷ lệ huyết thanh ngựa.
+ pH của môi trờng nuôi cấy.
+ Lợng tinh bột gạo.
+ Nhiệt độ nuôi cấy.
2. Qui trình nuôi cấy đơn bào trong Labo để
giữ chủng dài ngày
- Nhiệt độ nuôi cấy luôn giữ ổn định ở 37
0
C.
- Đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình
nuôi cấy.

- Môi trờng nuôi cấy thích hợp cho sự phát
triển của đơn bào:
+ Tỷ lệ huyết thanh ngựa: 10%.
+ pH của môi trờng nuôi cấy: 6 - 6,5.
+ Lợng tinh bột gạo: 5mg/1 ống nuôi cấy.
- Khi cấy truyền, lấy ở rìa đáy ống môi trờng
có nhiều đơn bào nhất.
- Thời gian cấy truyền tốt nhất là ngày đơn bào
có mật độ cao nhất và hoạt động khỏe. Với nuôi
cấy amíp:
+ Ngày thứ 2 (3 lần cấy đầu).
+ Ngày thứ 3 (các lần cấy sau).
- Với quy trình này (tính đến tháng 7 năm
2004), chúng tôi hiện đang nuôi giữ đợc 12 mẫu
đơn bào thuộc các giống: Entamoeba,
Acanthamoeba và Trichomonas với thời gian từ 6
đến 24 tháng.
Tài liệu tham khảo

Jun, 84 (3), pp. 638 - 9.
7. Mata - Cardenas BD, Vargas - Villarreal
J, Martinez - Rodriguez HG, Said - Fernandez
S (1995), “Entamoeba histolytica axenic growth
improvement by ox bile”, Arch Med Res, 26 (4),
pp. 441 - 4.
8. Said - Fernandez S, Mata - Cardenas BD
(1992), “Axenic cultivation of Entamoeba
histolytica in suspension”, Trans R Soc Trop Med
Hyg, Mar - Apr, 86 (2), pp. 173 - 4.

Summary
Study on culture technique improvement of routine, standard
procedure for maintenance of several parasitic protozoa
Responding to our research purposes of considerable interest in improvement of culture techniques to
maintain long time several strains of E. histolytica and other parasitic protozoa as material serving for research
work and for formation in practice, one study of improved culture techniques has been carried out with result
obtained as follows:
1. The Palova culture medium could be applied effectively to maintain long time trophozoites of E.
histolytica and some other parasitic protozoa.
- Optimal proportion of horse serum added into the medium is 10%. Optimal quantity of purified rice starch
added into medium 5mg/500ml medium.
- Optimal pH of culture medium trophozoites should be from 6 to 6.5 and 37
o
C should be optimal incubation
temperature.
2. Three types of media for material samples transport have been applied successfully: sterile 0,85% salin
solution, Method of Silard, Method of Gleason can keep trophozoites surviving from 12 hours to 3, 4 days in
outside environtment.
3. One routine standard culture procedure for E. histolytica and other protozoa with 4 steps of performance