NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NẤM Aspergillus SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
TRÊN LẠC BẰNG PHẢN ỨNG PCR ĐẶC HIỆU
Trần Tuấn Tú, Đàm Quang Hiếu,
Hoàng Thị Ngát, Lê Huy Hàm
và Phạm Xuân Hội
Summary
Identification of Aspergillus flavus induced Aflatoxin in peanut in the orth of
Vietnam using PCR method
Aflatoxins are carcinogenic metabolites produced by several members of Aspergillus group, such
as Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius.Number of methodologies have
been developed for detection of aflatoxin in grain and food, including thin-layer chromatography
(TLC), high-performance liquid chromatography (HPLC), overpressured chromatography,
polymerase chain reaction (PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) At least, more
than 20 genes have been determined to be involved in Aflatoxin biosynthesis pathway. In which,
genes ver-1, omt-1 and apa-2 play an important role in the pathway. In this study, we use ver as a
target gene to detect peanut contaminated aflatoxin in the North of Vietnam by employing PCR
approach. Peanut samples on the field, household and market from different area have been
collected for isolating Aspergillus flavus induced Aflatoxin strains using from a separate hypha. A
primer pair complementing the coding portion of ver gene was generated. DNA extracted from
Aspergillus flavus, Aspergillus niger strains from Nghean, Haiduong and Hanoi provinces was used
as PCR template. Positive results as designed PCR products were observed only with all DNA
templates of Aspergillus flavus from different sources, while no PCR products were observed with
DNA templates of Aspergillus niger. The results is suggesting a posibility to use PCR as selective
method for early, accurate detection of aflatoxin contaminated in peanut as well as in grains and
foods.
Keywords: Aflatoxin, Aspergillus flavus, peanut, PCR, identification.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm sinh độc tố là một trong những tác
nhân gây bệnh phổ biến làm giảm chất lượng
và giá tr sn phNm nông nghip do sinh ra
các loi c t gây hi cho sc kho con

Aflatoxin B
1
- cht c nht và ph bin
trong nhóm Aflatoxin) làm gen ích 
bưc u xác nh s có mt ca nm bnh
Aspergillus sinh c t trên các mu lc thu
thp  mt s tnh min Bc Vit N am.
II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CU
1. Vật liệu nghiên cứu
Các ging lc thu thp trong nhà dân,
trên ng rung và trên th trưng  các
tnh N gh An, Hi Dương và Hà N i ưc
s dng  phân lp ngun nm bnh. Cp
mi c hiu cho gen ver, các hóa cht s
dng trong sinh hc phân t phc v vic
tách chit ADN tng s si nm và các
nguyên liu cho phn ng PCR ưc mua
ca hãng Sigma, Fermentas
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Thu thp mu lc và thu nhn
nm bnh t mu lc. Các mu lc thu v
ưc bo qun trong phòng lnh  iu
kin 4 - 8
0
C ti B môn Bnh hc phân t
thc vt.  thu ưc nm bnh, chúng tôi
tin hành theo 2 cách: (i) t ht lc trc
tip trên ĩa petri có lót giy kh trùng
sch, gi trong iu kin 28

quan sát trên ĩa petri và kt hp vi hình
dng bào t, cung sinh bào t, th bình
quan sát trên kính hin vi chúng tôi tip
tc làm thun các isolate bng vic chn
lc và cy chuyn các mu nm trên môi
trưng c. Trên cơ s các c im nhn
dng trong quá trình phân lp, các mu
nm ưc phân thành các isolate A. flavus,
A. paraciticus hay A. niger. Sau ó, các
mu nm này ưc s dng làm nguyên
liu phc v cho các thí nghim tip sau.
2.3. Tách chit ADN tng s. Các mu
nm thu ưc trên môi trưng c ưc tip
tc nuôi cy lc 200v/p trong môi trưng
PDA và Czapek lng t 5 - 7 ngày,  28
0
C
 thu sinh khi. Sau khi ưc ra bng
nưc ct t 3 - 4 ln các mu nm ưc gi
trong t lnh sâu - 80
0
C làm nguyên liu
tách chit ADN tng s. Trong nghiên cu
này, chúng tôi ã s dng phương pháp
tách chit ADN tng s t nm Aspergillus
theo quy trình ca Eric W. Boehm. Cho 200
- 300 mg sinh khi nm ã ưc nghin nh
bng nitơ lng vào ng eppendorf 1,5 ml,
b sung 500 l dung dch tách chit
(100 mM Tris-pH 8.0, 10 mM EDTA, 2%

ã ưc ăng ký trong ngân hàng gen th
gii, chúng tôi s dng chuơng trình CLC
Bio 3.1  thit k cp mi VER-496F (5’-
ATGTCGGATAAT CACCGTTTAGATGGC-3’)
và VER-1391R (5’-ATGTCGGATAAT
CACCGTTTAGATGGC-3’)  nhân phân
on có kích thưc 896 bp ca gen ver-1
(Hình 1). N hng chng nm có băng ADN
kích thưc 900bp ưc khuych i bng cp
mi trên ưc xem là có kh năng sinh c t
Aflatoxin. Hưng nghiên cu trên s là cơ s
cho chúng tôi xây dng phương pháp có th
chuNn oán s nhim và nh lưng ưc
mc  nhim nm Aspergillus spp. sinh c
t Aflatoxin t các mu lc hay các cây lương
thc khác.
Hình 1. Cấu trúc gen ver và vị trí cặp mồi được thiết kế trên gen. Gen ver có kích thước
khoảng 1.76 kb, tận cùng đầu 5’ và đầu 3’ là vùng không phiên mã (5’UTS và 3’UTS) dài
khoảng 400bp và 372bp; khung đọc mở (ORF) nằm từ vị trí 400 đến vị trí 1393, mã hoá
cho 262 a.amin; trong khung đọc mở có tồn tại 3 đoạn exon và 2 đoạn intron. Cặp mồi
được thiết kế nằm trọn trong khung đọc mở, có kích thước lý thuyết 896bp (~ 900bp).
2.5. Phn ng PCR c hiu. Các mu
DN A ã tách chit ưc pha loãng v nng
 20ng/l  làm khuôn cho phn ng

mồi ở 55
0
C trong 45 giây và kéo dài ở
72
0
C trong 1 phút. Các phân đoạn sản
phNm ưc in di kim tra trên gel
agarose 1% và ghi nhn hình nh bng h
thng máy nh N ikon.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. Phân lp nm bnh Aspergillus
spp. t mt s mu lc ca Vit N am. S
dng c 2 phương pháp thu thp nm:
(i) t ht lc lên ĩa petri có lp giy
thm kh trùng ưc làm ưt (5 - 6
ht/ĩa) và (ii) t v la ht lc lên môi
trưng PDA c (5 - 6 ming v/ĩa) chúng
tôi ã thu ưc các chng nm Aspergillus
spp. nh vào các c im hình thái bên
ngoài như màu sc và vt loang ca
khuNn lc trên môi trưng (Hình 2). Kt
qu nhn thy bng phương pháp t v
lc trên ĩa môi trưng PDA c, 
nhim khuNn và ln nhiu loi nm khác
(nhim 40%) là thp hơn nhiu so vi
phương pháp t c ht lc trên giy
thm kh trùng (nhim 70%).

Hình 2. Phương pháp thu nhận và phân lập
mẫu nấm bệnh từ hạt lạc trên giấy thấm

qua 7 ngày nuôi cy, ưng kính trung bình
ca khuNn lc ch t ưc là 3,5 - 4 cm, ti
a t ưc là 7 cm sau 20 ngày. Xét riêng
vi 2 loài nm A. flavus và A. niger, chúng tôi
nhn thy mc  nhim nm trên lc cũng
như tc  phát trin ca nm loài A. flavus là
cao hơn so vi loài A. niger, t ó có th thy
A
B
nguy cơ ln ca vic nhim nm cũng như
nhim c t Aflatoxin cao trên các mu lc
ưc kho sát  Vit N am (Hình 3). Hình 3. Hình thái nấm Aspergillus spp. phân lập được từ mẫu lạc. A. Mẫu nấm A. flavus:
trên môi trường PDA (A1) khun lạc phát triển nhanh và vùng nấm mới phát triển có màu
vàng nhạt, vùng nấm bên trong có màu xanh. Trên môi trường Czapek (A2) nấm sinh
trưởng chậm hơn, màu sắc đậm hơn và có xuất hiện các hạch nấm màu đen. A3: Hình ảnh
thể bình và cuống sinh bào tử của nấm A.flavus quan sát dưới kính hiển vi (X 1600).
A4: ấm A. flavus trong nuôi cấy lỏng. B. Mẫu nấm A. niger: Trên môi trường Czapek (B1)
khun lạc phát triển chậm hơn và màu của khun lạc cũng đậm hơn và có xuất hiện một số
“hạch nấm” trên khun lạc - có thể do môi trường Czapek nghèo dinh dưỡng hơn;
B2: Hình ảnh sợi nấm A. niger quan sát dưới kính hiển vi (X 1600).
Các mu nm Aspergillus thu ưc sau
khi làm thun s ưc cy chuyn sang môi
trưng PDA và Czapek lng  nuôi cy
thu sinh khi. Kt qu cho thy, không có
s khác bit nào áng k khi nuôi cy nm
Aspergillus trên 2 môi trưng lng này, sau
khong 5 ngày, s thu ưc lưng sinh khi

nm A. niger. Kt qu chúng tôi thu ưc
15 mẫu ADN tổng số nấm A. flavus với
hình ảnh điện di trên gel agarose 1% rõ nét
với hàm lượng ADN trung bình từ 300 -
500 ng/µl (Hình 4) và 5 mẫu ADN tổng số
nấm A. niger sử dụng làm đối chứng cho
phản ứng PCR. Các mẫu ADN tổng số
được sử dụng làm sợi khuôn cho phản ứng
PCR đặc hiệu với cặp mồi đã thiết kế.

Hình 4. Ảnh điện di AD tổng số các mẫu nấm trên gel agarose 1%.
M: Marker λ HindIII; 1 - 4: ấm A. flavus ghệ An, 5 - 7: ấm A. flavus Hải Dương;
8 - 10 nấm A. flavus Hà ội; 11 - 13: ấm A. niger ghệ An; 14: ấm A. niger Hải Dương
và 15: ấm A. niger chun.
3. Kt qu phân tích bng phn ng
PCR c hiu. Từ 15 mẫu ADN tổng số
thu được của isolate A. flavus chúng tôi
chọn ra 7 mẫu ADN tổng số để làm khuôn
cho thí nghiệm tối ưu hoá điều kiện phản
ứng PCR đặc hiệu với cặp mồi VER. Điều
kiện cho phản ứng PCR như đã trình bày ở
phần vật liệu và phương pháp. Nồng độ
khuôn ADN tổng số được thay đổi từ 1 ng,
2 ng, 10 ng, 20 ng, 100 ng và 200 ng cho
thể tích phản ứng là 20 µl để tối ưu hoá
nồng độ khuôn ADN. Kết quả phân tích
cho thấy khoảng nồng độ thích hợp cho
mồi VER dao động từ 2 - 20 ng, tuy nhiên
ở nồng độ 20 ng các phân đoạn ADN được
khuyếch đại tốt nhất và nồng độ 20 ng

kết quả âm tính với các mồi đặc hiệu (Hình
5). Điều này chứng tỏ cặp mồi đã thiết kế
và điều kiện phản ứng PCR chúng tôi thiết
lập được là có thể sử dụng phân biệt loài
A. flavus và A. niger. Điều đó cũng có
nghĩa là phương pháp của chúng tôi hoàn
toàn có thể nhận biết được các nấm có khả
năng sinh độc tố Aflatoxin với các nấm
không sinh độc tố, bởi các nấm A. flavus
được coi là loài sinh độc tố Aflatoxin rất
mạnh trong khi nấm A. niger là loài hoàn
toàn không sinh độc tố. Hình 5. Hình ảnh điện di sản phm khuyếch đại với mồi Ver trên gel agarose 1%
M: Marker; 1 - 3: A. flavus ghệ An; 4 - 6: A. flavus Hải Dương; 7: A. flavus Hà ội;
C: Đối chứng A. niger chun. Các mẫu có đặc điểm hình thái điển hình của A. flavus đều
cho băng đặc hiệu ~ 900bp còn mẫu đối chứng là mẫu A. niger chun không có băng đặc
hiệu (Hình ảnh thu nhận bằng máy chụp ảnh ikon)
IV. KẾT LUẬN
Con đường sinh tổng hợp Aflatoxin ở
nấm bệnh Aspergillus đã được nghiên cứu
khá chi tiết ở mức độ phân tử. Ít nhất có 20
gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào
con đường này và một số gen quan trọng đã
được giải trình tự và nghiên cứu chức năng
đầy đủ. Trong các gen quan trọng tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin, ver,
omt và apa đang được quan tâm và sử dụng
làm gen đích trong các nghiên cứu xác định

ở nấm bệnh Aspergillus.
Gen apa là gen điều khiển liên quan đến việc chuyển averufin thành versiconal hemiacetal
acetate, dẫn đến sự tập trung acetate cần thiết trước khi bước vào con đường sinh tổng
hợp Aflatoxin. Gen ver mã hoá cho enzyme chuyển hoá versicolorin A thành
sterigmatocystin và gen omt mã hoá cho enzyme chuyển hoá sterigmatocystin thành
O- methylsterigmatocystin là tiền chất của Aflatoxin B
1
.
TÀI LIU THAM KHO
1. Kurtzman C.P., et al., 1987. Antonie
Leeuwenhoek 53:147-157.
2. Yu J., et al., 2005. Rev. Iberroem.Miccil.
22:194-202.
3. Kolosova A.Y., et al., 2006. Anal.
Bioanal.Chem. 384:286-94.
4. Jarvis B., D.A.L.Seiler., A.J.L.Ould and
A.P.William, 1983. J.Appl.Bacteriol.
55:325-336.
5. Stroka J., Van O. R. and Anklam E,
2000. J.Chromatoqr.A. 904(2):251-6.
6. Jaimez J., Fente CA., Vazquez BI.,
Franco CM., Cepeda A., Mahuziez G.,
and Pronqnon P, 2000. J.Chromatoqr
A. 882(1-2):1-10.
7. Bintvihok, A., Y. Adachi, and K. Hirano,
1992. Toxicon 30:492-497.
8. Cheng, R., J. Tsay, Y. Huang, and R. Y.
Chiou, 2002. J. Food Prot., 65:840-844.
9. Farber, P., R. Geison, and W. H.
Holzapfel, 1997. Int. J. Food Microbiol.