1
LIÊN HIỆP CÁC HỘI KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT VIỆT NAM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ SỨC KHOẺ
CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI

BÁO CÁO TỔNG KẾT
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

Tên đề tài:
“Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng
và biện pháp phòng trừ”
CƠ QUAN CHỦ QUẢN: Liên hiệp các hội Khoa học và kỹ thuật Việt Nam
CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ

cây trồng và vật nuôi
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. Hà Viết Cường

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ

cây trồng và vật nuôi
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. Hà Viết Cường
THỜI GIAN THỰC HIỆN: 5/2009 – 11/2010

HÀ NỘI, 12/2010
3
LIÊN HIỆP CÁC HỘI KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT VIỆT NAM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ
SỨC KHOẺ CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: “Nghiên cứu bệnh do Phytoplasma hại tre luồng và biện pháp
phòng trừ”
- Chủ nhiệm: TS. Hà Viết Cường
- Cơ quan chủ trì: Trung tâm nghiên cứu bảo vệ sức khoẻ cây trồng và vật
nuôi
- Thời gian thực hiện: 5/2009 – 12/2010
2. Mục tiêu: Đề tài nhằm xác định tác nhân gây bệnh giống bị nhiễm
Phytoplasma trên tre luồng và đề xuất biện pháp kiểm soát bệ
nh.
3. Kết quả nghiên cứu:
- Các kết quả PCR và giải trình tự chứng tỏ rằng các mẫu biểu hiện triệu

cứu chẩn đoán bệnh phytoplasma. Đã sử dụ
ng kỹ thuật PCR với nhiều tổ hợp
mồi khác nhau, nhiều điều kiện phản ứng khác nhau và 3 loại PCR khác nhau
(PCR thường, PCR lồng và Touch-Down PCR) để phát hiện phytoplasma trên
mẫu cây bệnh và rầy. Kết quả nghiên cứu đã không phát hiện được phytoplasma
trên cây bệnh cũng như trên rầy.
- Đã lần đầu tiên phát hiện và xác định được ở cả mức hình thái và phân tử
nấm Heteroepichloe bambusae gây bệnh cựa gà trên cây luồng Thanh Hóa.
- Qua nghiên cứ
u giải trình tự đã phát hiện được một loạt các vi khuẩn và
nấm liên quan đên rầy và cây. Trong số này, có nhóm sống nội sinh, có nhóm là
tác nhân gây bệnh cây tiềm tàng và có nhóm có thể ứng dụng trong phòng chống
5
sinh học hoặc sử dụng để tạo các chế phẩm trong y học. Các vi khuẩn và nấm
phát hiện được bao gồm:
a. Hai vi khuẩn là Wolbachia spp. và Arsenophonus sp. từ rầy nâu vằn.
Đây là các vi khuẩn sống nội sinh trong côn trùng.
b. Bảy vi khuẩn là Pantoea ananatis, Rheinheimera sp., Enterobacter sp.,
Luteibacter, Xanthomonas albilineans, một vi khuẩn chưa định danh và
Acinetobacter từ cây bị bệnh. Trong số này, đáng chú ý nhất là X.
albilineans phát hiện từ cây luồng bị bệnh sọc tím. X. albilineans là một
vi khuẩn ký sinh thực vật quan trọng, đặc biệt trên cây 1 lá mầm, thuộc
nhóm vi khuẩn biệt dưỡng (không thể nuôi cấy trên môi trường thông
thường), thuộc nhóm giới hạn mạch xylem, lan truyền nhờ rầy. Đây có
lẽ là một tác nhân cần chú ý khi nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh sọc
tím trong tương lai.
c. Bảy nấm túi là Shiraia sp., Fusarium sp., F. equiseti, Microdochium sp.,
Xylaria feejeensis, một nấm thuộc họ Magnaporthaceae và một nấm
thuộ
c bộ Pleosporales từ cây bệnh. Tất cả các loài nấm này không cảm

Đã ký

7

LIÊN HIỆP CÁC HỘI KH & KT VIỆT NAM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU BẢO VỆ SỨC KHOẺ
CÂY TRỒNG VÀ VẬT NUÔI
__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày 2 tháng 12 năm 2010

DANH SÁCH TÁC GIẢ THỰC HIỆN
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
(Danh sách những cá nhân đã đóng góp sáng tạo chủ yếu cho đề tài, dự án
được sắp xếp theo thứ tự đã thoả thuận)
1. Tên đề tài, dự án: :


Chủ nhiệm đề tài/dự án
(Họ, tên và chữ ký)
Đã ký
Thủ trưởng tổ chức chủ trì
đề tài/dự án
(Họ, tên, chữ ký và đóng dấu)

Đã ký

9
Môc lôc
PHẦN I: MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề
1
2. Mục tiêu của đề tài
3
3. Nội dung nghiên cứu chính

14
3.2 Phương pháp thu mẫu bệnh hại
14
3.3 Phương pháp phân lập mẫu (Doungporn Morakotkarn, 2006).
14
3.4 Phương pháp chiết DNA
15
3.5 Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) xác định Phytoplasma, vi
khuẩn 16
3.6 Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) xác định nấm.
18
3.7 Chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm PCR.
19
3.8 Nhân dòng sản phẩm PCR trong vi khuẩn E.coli
20
3.9 Giải trình tự DNA
20
10
3.10 Phân tích trình tự 20
3.11 Phương pháp lây bệnh nhân tạo
20
3.12 Thí nghiệm phòng trừ
20
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
22
CHƯƠNG 1. ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH BỆNH, ĐIỀU TRA, THU THẬP MẪU
BỆNH CÁC BỆNH GIỐNG BỊ NHIỄM PHYTOPLASMA 23
4
Triệu chứng các bệnh giống như nhiễm Phytoplasma 23
4.2

Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR (U3/U5) 46
4.6.4
Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi P1/P7 (kết hợp với Nested – PCR) .49
4.6.5
Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN01119 / SN910601 52
4.6.6
Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi SN910601/P7 54
4.6.7
Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U
5
/Phy1R 58
4.6.8
Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer1R và cặp mồi
Phy1F/Phy1R 59
11
4.6.9 Kiểm tra PCR với cặp mồi Phy1F/Spacer2R và Phy1F/Spacer3R 64
4.6.10
Dòng hóa và giải trình tự 73
4.6.11
Thảo luận kết quả phát hiện Phytoplasma 78
CHƯƠNG 3. XÁC ĐỊNH NẤM liên quan đẾN BỆNH
80
4.7
PHÂN LÂP NẤM 80
4.7.1
Bệnh sọc tím luồng 80
4.7.2
Bệnh chổi sể 82
4.7.3
Bệnh cựa gà 85

THÍ NGHIỆM PHÒNG TRỪ 104
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
107
5.1. Kết luận
107
5.2. Đề nghị
109
PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO
110

12
Danh mục chữ viết tắt

bp: Base pair
DNA: Deoxyribonucleic acid
E.coli Escherichia coli
ha Hec ta
PCR Polymerase
RNA Rebonucleic acid
Ta Nhiệt độ gắn mồi

13
DANH MôC H×nh
Hình 2-2. Bệnh chổi phù thủy do phytoplasma trên cây trúc đen tại Hàn Quốc
(Jung et al., 2006) 11
Hình 1-1 Bệnh chổi sể trên luồng (2 ảnh hàng trên, Thanh Hóa, 2009), trên
bương (ảnh góc trái hàng dưới, Lào Cai, 2010) và trên tre (ảnh góc phải hàng
dưới, Lào Cai, 2010) 25
Hình 1-2. Bệnh sọc tím trên luồng tại Thanh Hóa (2009). A) Sọc tím trên thân,
B) Măng bất thường phát triển thành các cây rất nhỏ, C) Các măng bất thường

là thang DNA, trong đó M1, M2 và M3 tương ứng với lượng dùng 1 µL, 0.5
µL và 0. 25 µL. Các mẫu đều được chạy với lượng 2 µL theo thứ tự sau: 1:
Luồng lá nhỏ (P-28), 2: Tre cảnh chổi phù thủy (P-20), 3: Luồng sọc tím (L5).46
Hình 2-7. Đồ thị trình tự nucleotide của 3 mẫu PCR được giải trình tự bằng mồi
U5 (Lần 1). 48
Hình 2-8 Sơ đồ cụm gen DNA ribosome (rDNA) của Phytoplasma và vị trí
tương đối của mồi cũng như sản phẩm PCR trong Nested-PCR dùng 2 cặp mồi
P1/P7 và U3/U5 49
Hình 2-9 PCR với cặp mồi P1/P7 ở nồng độ MgCl2 = 1,5µL/25µL (150 µM).
M là Thang DNA (GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Fermentas). 1: Luồng lá nhỏ
(P-28), 2: Tre cảnh chổi sể (P-20), 3: Luồng sọc tím (L6). Băng có sản phẩm với
kíc thước mong muốn ~ 1.8 kb được chỉ bằng mũi tên 52
Hình 2-10 Kết quả điện di PCR lần 1 bằng cặp mồi SN01119 / SN910601. Sản
phẩm mong đợi ~ 1,8 kb. M = Thang DNA (GeneRuler 1kb, Fermentas). Số thứ
tự các giêng tương ứng theo thứ tự các mẫu trong bảng 2-8.
54
Hình 2-11 Kết quả kiểm tra PCR lần 1 với cặp mồi SN910601 / P7. M là thang
DNA (1 kb, Fermentas. Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 2-9) . 57
Hình 2-12 Kết quả kiểm tra PCR lần 3 với cặp mồi SN910601 / P7. M là thang
DNA (1 kb, Fermentas. Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 2-9) . 57
Hình 2-13 Kết quả kiểm tra PCR lần 1 với cặp mồi U5/Phy1R. M là thang DNA
(1 kb, Fermentas. Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 2-10 59
Hình 2-14 Kết quả PCR bằng cặp mồi Phy1F/ Spacer1R và cặp mồi
60
Phy1F/Phy1R trên mẫu cây
60
Hình 2-15 PCR bằng cặp mồi Phy1F/Phy1R trên mẫu rầy. Chỉ minh họa 8 trong
38 mẫu rầy thí nghiệm. Từ 1-3 và 6-14 là rầy nâu vằn. Từ 4-5 là rầy trắng 61
15
Hình 2-16 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR với cặp mồi Phy1F/Phy1R

Hình 3-3 Đặc điểm tản nấm phân lập được từ mẫu bệnh chổi sể nuôi cấy trên
môi trường T2.( thứ tự mẫu theo bảng 3-3) 84
Hình 3-4 Mẫu nấm số 5 hình thành quả thể dạng gạc hươu.
84
16
Hình3-5 Bệnh cựa gà trên luồng Thanh Hóa (trái) và bệnh “chổi phù thủy” trên
tre do nấm Heteroepichloë gây ra tại Nhật Bản (phải) (Tanaka et al., 2002) 85
Hình 3-6 So sánh đặc điểm nấm cựa gà trên luồng Thanh Hóa (cột trái) và nấm
Heteroepichloë (cột phải, theo Tanaka et al., 2002). Hai ảnh hàng trên cùng là
hình dạng và cách xắp xếp của quả thể (perithecium) trên tử tọa. Hai ảnh hàng
giữa là một phần của túi. Hai ảnh hàng dưới cùng là bào tử túi (chú ý vẫn còn 1
túi ở nấm Heteroepichloë) 86
Hình 3-7 Tổ chức vùng rDNA của nấm và vị trí tương đối của cặp mồi ITS4 và
ITS5 87
Hình 3-8 Minh họa kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên mẫu nấm thuần
phân lập từ bệnh chổi sể và sọc tím. M là thang DNA 1 kb (Fermentas). Số thứ
tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu ở Bảng 3-4. Sản phẩm PCR (~ 0.6 kb) được
chỉ bằng mũi tên. 89
Hình 3-9 Minh họa kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên các mẫu cựa gà.
M là thang DNA 100bp (Fermentas). Số thứ tự các cột tương ứng số thứ tự mẫu
ở Bảng 3-5. Kích thước sản phẩm PCR ~ 0.6 kb được chỉ bằng mũi tên 89
Hình 3-10. Kết quả biến nạp 6 mẫu nấm vào vi khuẩn XL1-blue (không thể hiện
đĩa đối chứng và đĩa cựa gà 6) 90
Hình 3-11 Minh họa kiểm tra PCR khuẩn lạc vi khuẩn tái tổ hợp. Băng PCR
dương (~0.6 kb) được chỉ bằng mũi tên 91
Hình 3-12 Đồ thị kết quả giải trình tự sản phẩm PCR các mẫu nấm (mồi ITS4/ITS5)
(chỉ minh họa 1 phần đồ thị trình tự của các phản ứng giải trình tự) 98
Hình 4-1 Phân lập vi khuẩn từ vết bệnh sọc tím
99
Hình 4-2 PCR nhân gen mã hóa RNA ribosome của 2 mẫu vi khuẩn ST4 và ST5

56
Bảng 2-10 Kết quả kiểm tra PCR bằng cặp mồi U5/Phy1R
58
Bảng 2-11 Kiểm tra PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer1R và cặp mồi
Phy1F/Phy1R trên mẫu cây 60
Bảng 2-12 Kiểm tra PCR trên mẫu rầy bằng cặp mồi Phy1F/Phy1R
61
Bảng 2-13 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR nhân bằng cặp mồi
Phy1F/Phy1R 62
Bảng 2-14 PCR bằng cặp mồi Phy1F/Spacer2R và Phy1F/Spacer3R
65
Bảng 2-15 Kết quả kiểm tra PCR dùng cặp mồi Phy1F/Spacer2R và TrueStart
Taq DNA Polymerase (Fermentas) 67
Bảng 2-16 Kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR nhân bằng cặp mồi
Phy1F/Spacer2R 71
Bảng 2-17 Kiểm tra vector tái tổ hợp (miniprep) bằng BamHI và E.coRI
75
Bảng 2-18 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR được dòng hóa
77
Bảng 3-1. Phân lập mẫu bệnh sọc tím luồng ở tỉnh Thanh Hóa
81
Bảng 3-2 Phân lập mẫu chổi sể trên cây luồng
83
Bảng3-3 Đặc điểm tản nấm phân lập được từ mẫu bệnh chổi sể nuôi cấy trên
môi trường T2 83
Bảng 3-4 Kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên mẫu nấm nuôi cấy thuần
88
19
Bảng 3-5 Kết quả PCR bằng cặp mồi ITS4/ITS5 trên các mẫu cựa gà trên nấm
cựa gà 89

khoảng 1250 loài thuộc 75 chi trên toàn thế giới. Việt Nam ước tính có 216 loài
thuộc 25 chi (Nguyễn Hoàng Hộ, 2005). Tổng diện tích cây họ tre nứa năm
2004 khoảng 1,6 triệu ha, trong đó 800,000 ha rừng tự nhiên thuần loài, 700.000
ha rừng tự nhiên hỗn loài và 100.000 ha rừng trồng (Nguyễn Ngọ
c Bình và
Phạm Đức Tuấn, 2007).
Ở Việt Nam, ngoài ý nghĩa văn hóa, nhiều loài cây họ tre nứa còn có giá trị
kinh tế lớn như tre, nứa, bương và đặc biệt là luồng. Cây luồng (Dendrocalamus
membranaceous) được trồng để lấy măng, nguyên liệu cho xây dựng, sản xuất
đồ mỹ nghệ và chế biến giấy. Cây luồng được trồng ở nhiều nơi nhưng đặc biệt
nhiều tại tỉnh Thanh Hóa. T
ại tỉnh này, luồng là 1 trong những cây lâm nghiệp
chiến lược, cây xóa đói giảm nghèo. Năm 2006, diện tích luồng của tỉnh lên tới
69,000 ha , tập trung tại 3 huyện Quan Hóa, Lang Chánh và Ngọc Lặc. Hiện
nay, cây luồng bị một số bệnh tấn công trong đó đặc biệt nghiêm trọng là các
bệnh sọc tím. Ngoài ra, một số bệnh khác cũng công bố thấy trên luồng tại
Thanh Hóa là bệnh chổi xể (chổi phù thủy) và bệnh lá nhỏ. B
ệnh sọc tím mới
xuất hiện vài năm tại các khu vực trồng luồng tại Thanh Hóa nhưng ảnh hưởng
đáng kể đến năng suất, chất lượng luồng. Đối với bệnh sọc tím, các triệu chứng
chính của bệnh là măng mọc nhiều từ gốc cây con (trên một tuổi) và mọc thành
chùm trên đốt cây trưởng thành cách mặt đất 1-2 m và ngừng sinh trưởng khi đạt
chiều cao khoảng 20-30cm; cây măng mọ
c từ đất có thể đạt 5-6 m nhưng đường
kính giảm mạnh. Đặc biệt trên thân măng có các sọc tím chạy từ các đốt phía
dưới lên trên. Cây bị bệnh khoảng 2-3 năm rất còi cọc. Trên cây bệnh, lá mọc ít
và nhỏ.
21
Vì các bệnh trên có triệu chứng khá giống với triệu chứng do Phytoplasma
gây ra nên năm 2007, một nghiên cứu thăm dò nhằm xác định nguyên nhân gây

2. Mục tiêu của đề tài
Đề tài nhằm xác định tác nhân gây bệnh giống bị nhiễm Phytoplasma trên
tre luồng và đề xuất biện pháp kiểm soát bệnh.
3. Nội dung nghiên cứu chính
1. Điều tra, thu thập bệnh giống bị nhiễm Phytoplasma trên cây họ tre nứa, tập
trung bệnh trên luồng tại Thanh Hóa và một số tỉnh miền Bắc.
2. Đánh giá tình hình bệnh sọc tím, bệnh luồng lá nhỏ, chổi phù thuỷ trên
luồng tại Thanh Hoá.
3. Xác định nguyên nhân gây bệnh sọc tím, lá nhỏ, chổi phù thuỷ, tập trung
vào đối tượng phytoplasma.
4. Xác định vector và phương thức truyền bệnh do phytoplasma
5. Thử nghiệm và đề xuất biện pháp phòng trừ bệnh do phytoplasma
23
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Lịch sử nghiên cứu Phytoplasma

organism” hay MLO (Lee et al., 2000).
2.2. Hình thái Phytoplasma
Phytoplasma là vi khuẩn thiếu vách nên có hình dạng không cố định. Khi
quan sát dưới tiêu bản cắt ngang, chúng có dạng hình cầu, với đường kính trung
bình từ 200µm đến 800µm. Chúng cũng có thể có dạng hình sợi, hình dây, phân
nhánh (Lee et al., 2000).
2.3. Tầm quan trọng của Phytoplasma
Phytoplasma là nguyên nhân gây bệnh của hàng trăm cây trồng quan trọng
như: cây lương thực, cây rau, cây ăn quả, cây trang trí, cây gỗ và cây tre bóng
mát. Trong những năm gần đây, nhiều bệnh mới xuất hiện
đã được xác định là
do Phytoplasma (Bertaccini, 2007; Lee et al., 2000).
Bệnh Phytoplasma là yếu tố hạn chế đầu tiên cho sản xuất của nhiều cây
trồng quan trọng trên toàn thế giới. Ví dụ như Phytoplasma gây vàng cây cúc tây
là một trong những yếu tố quan trọng làm giảm lợi nhuận kinh tế của nhiều loại
cây rau (như cây cà rốt, cây rau diếp, cây cần tây), cây hoa và cây cảnh (như cây
hoa lay ơn, cây tú cầu, cây hoa cúc Trung Quốc) ở Bắc Mỹ và một phần Châu
Âu. Thiệ
t hại kinh tế thường ở mức 10 – 25%, cá biệt có khi lên tới 80 – 90%.
Bệnh vàng cây đào làm giảm chất lượng đào và bệnh X ở cây đào làm giảm
phẩm chất và làm thất thu vụ mùa ở Mỹ. Bệnh vàng lùn lúa làm giảm sản lượng
thóc trong vài vùng ở Đông Nam Á, bệnh chổi phù thủy ở khoai tây và bệnh ngô
lùn mọc rậm rạp làm giảm sản lượng khoai và bắp ở miền Trung và Nam Mỹ,
bệnh chổi phù thủy ở
cây khoai lang và bệnh liên quan làm giảm sản lượng
khoai ở Châu Á và Austraylia, bệnh chổi phù thủy ở cây sắn làm giảm sản lượng
sắn ở Nam Mỹ. Bệnh vàng nho làm giảm chất lượng nho ở Châu Âu và
Australia. Bệnh cây lê còi cọc, cây táo phát triển quá mức và các loại cây ăn quả
khác bị còi cọc làm giảm chất lượng, sản lượng quả ở Mỹ, Châu Âu. Bệnh
Phytoplasma gây hại ở cây họ đậu như chồi phù thủy ở cây lạ