BỘ Y TẾ
VIỆN DINH DƯỠNG
][\^ Báo cáo kết quả đề tài khoa học công nghệ
BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DAIDZEIN, GENISTEIN VÀ
17 ACID AMIN TRONG ĐẬU TƯƠNG VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾNChủ nhiệm đề tài: ThS. Lê Hồng Dũng
ThS. Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện:
Khoa Thực phẩm - VSATTP

Cơ quan chủ quản: Viện Dinh dưỡng

ThS. Lê Thị Hồng Hảo
Cán bộ phối hợp:
PGS. TS. Hà Thị Anh Đào
KS. Vũ Thị Hồi
CN. Bùi Thị Ngoan
KS. Trần Thắng

Kinh phí:
40 triệu đồng
Nguồn:
Chiến lược dinh dưỡng Quốc gia
HÀ NỘI - 2007
1. Đặt vấn đề
Đậu, đỗ là nhóm thực phẩm quan trọng cung cấp một lượng đáng kể protein cho cơ thể. Các
loại đậu hạt thường chứa từ 20 đến 24% protein và 3 đến 5% chất xơ. Hạt đậu đã già thậm chí
còn chứa nhiều protein hơn (30–42%) [1]. Ngoài việc cung cấp một nguồn protein quan trọng
cho con người, một số loại đậu, đỗ chứa nhiều các acid amin rất quan trọng như lysin và
tryptophan. Acid amin là một thành phần quan trọng trong cấu tại nên protein, tham gia nhiều
chức năng quan trọng như cấu tạo tế bào, phục hồi mô, cấu tạo nên các kháng thể chống lại vi
khuẩn và virus, cấu tạo enzym và hệ thống hormon. Acid amin tạo nên ARN (acid ribo nucleic),
ADN (acid deoxy nucleic) vận chuyển oxy đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ.
Acid amin được cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm giàu protein. Có 22 acid amin quan trọng đối
với cơ thể
, trong đó có 9 acid amin thiết yếu, là các acid amin cơ thể không tự tổng hợp được
gồm histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan và valin. Sự
thiếu hụt acid amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết, dị ứng [30].
Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lượng chất đạm có trong thức ăn

một số tác dụng phụ nhưng chưa có nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng bất lợi trên người. Một
số nghiên cứu quan sát thấy nguy cơ tăng hội chứng bệnh tự miễn tuyến yên ở trẻ nhỏ khi dùng
bột dinh dưỡng bổ sung đậu tương và có liên quan đến sự ức chế hệ thống men peroxidase tuyến
yên do isoflavon [33, 34, 35]. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu kỹ lưỡng nào về tác dụng lâu dài
của phytoestrogen kể cả tác dụng có lợi và tác dụng bất lợi. Nghiên cứu năm 2001 của Julie và
cộng sự [32] khi bổ sung 40mg/ngày trên nam giới tình nguyện khỏe mạnh (lượng isoflavon ăn
vào tương đương như ở nhiều nước châu Á) cho thấy không có ảnh hưởng đối v
ới hormon gonadotrophin hoặc hormon sinh dục nam. Nghiên cứu này cũng không loại trừ khả năng khi bổ
sung phytoestrogen liều cao và trong thời gian dài có thể ảnh hưởng đến sức khỏe sinh sản ở
nam giới.
Thành phần và hàm lượng các isoflavon trong thực phẩm đã được nghiên cứu và công bố từ
nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới [7,8,9,10,11]. Nhiều cơ sở dữ liệu về các isoflavon
hiện nay đã được công bố [7,10]. Để phân tích thành phần các phytoestrogen nói chung và các
isoflavon nói riêng, nhiều phương pháp
đã được phát triển và được chuẩn hóa tại các phòng thí
nghiệm trên thế giới. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược được ứng dụng rộng rãi
nhất trong phân tích các isoflavon. Cột sắc ký thường dùng nhất là cột C18 với pha động gồm
acetonitril và acid acetic hoặc acid phosphoric. Detector thường dùng trong phân tích các
isoflavon là detector UV hoặc photodiode array (PDA) ở bước sóng 249nm và 260nm. Ngoài ra
detector điện hóa cũng được ứng dụng trong một số nghiên cứu cho thấy có độ nhạy và chọn lọc
cao vớ
i các isoflavon. Gần đây, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đã được sử dụng trong phân
tích đồng thời các hợp chất daidzein và genistein trong thực phẩm cũng như các mẫu phẩm sinh
hóa. Phương pháp sắc ký khí khối phổ thường được áp dụng để xác định lượng vết các isoflavon
với độ nhạy cao và rất đặc hiệu. Các phương pháp phân tích isoflavon và phytoestrogen trong
thực phẩm hiện vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằ
m cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ các nghiên

thiết trong giai đoạn hiện nay. Để thực hiện những nghiên cứ
u này, cần thiết phải xây dựng các
cơ sở dữ liệu đối với các hoạt chất sinh học trong tự nhiên như các carotenoids, sterols,
flavonoid, isoflavonoid
Trong chế độ ăn của người châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, các thực phẩm từ đậu
tương chiếm một vị trí quan trọng. Theo kết quả Tổng điều tra dinh dưỡng năm 2000 của Viện
Dinh dưỡng, mức tiêu thụ thực phẩm nhóm đậu, đỗ đã tă
ng lên đáng kể trong năm 2000, với khoảng 6 g/người/ ngày so với 2,8g/người/ngày trong năm 1990. Đậu phụ, loại thực phẩm giàu
đạm thực vật thông dụng ở Việt Nam cũng có mức tiêu thụ tăng lên đến 13,4 g/người/ngày trong
năm 2000 so với 6,8g/người/ngày trong năm 1990 [31].
Tuy nhiên, việc phân tích các thành phần có hoạt tính sinh học trong thực phẩm Việt Nam
còn hạn chế, chủ yếu mới có số liệu của một số loại carotenoid trong rau, quả. Số liệu phân tích
các acid amin trong thực ph
ẩm Việt Nam còn thiếu, đặc biệt đối với một số acid amin quan trọng
như lysin. Những nghiên cứu, phân tích về thành phần dinh dưỡng và đặc biệt các thành phần có
hoạt tính sinh học trong thực phẩm nhóm đậu, đỗ và các sản phẩm chế biến ở nước ta còn chưa
đầy đủ. Nhằm bổ sung và hoàn thiện số liệu của Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam và cung
cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh d
ưỡng, việc xác định thành phần một các acid amin quan
trọng như lysin, methionin và số chất hóa thực vật như genistein và daidzein là rất cần thiết.
Vì vậy, đề tài này được thực hiện nhằm bước đầu xác định hàm lượng một số isoflavon và
acid amin trong thực phẩm nhóm đậu, đỗ và sản phẩm chế biến, phục vụ cho công tác nghiên
cứu chế độ ăn trong phòng và điều trị bệnh.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chung:
Phân tích hàm lượng genistein, daidzein và 17 acid amin quan trọng trong đậu
tương và hai loại sản phẩm chế biến nhằm bước đầu cung cấp số liệu cho Bảng thành phần thực

g/ml tương ứng. Dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng bằng methanol đến
nồng độ 1,2
µ
g/ml và 0,8
µ
g/ml tương ứng. Các dung dịch chu
ẩn được bảo quản ở 0
o
C.
Chuẩn hỗn hợp (17 acid amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mmol/
µ
l cho tất cả các acid amin và 1,25 mmol/
µ
l đối với cystin trong HCl 20 mmol để được dung dịch chuẩn làm việc có
chứa 100 pmol/
µ
l đối với 17 acid amin và 50 pmol/
µ
l đối với cystein. Dung dịch chuẩn làm việc
được bảo quản trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu -20
0
C dùng được trong vòng 1
tháng. Các chuẩn đơn được hoà tan trong nước và bảo quản trong môi trường acid với các điều
kiện tương tự như chuẩn hỗn hợp.
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Hệ thống sắc ký được sử dụng là của hãng Waters (Mỹ), gồm bơm dung môi 2690 có bộ phận
bơm mẫu tự động, detector PDA 2996, detector huỳnh quang 2475, phần mềm Empower. Cột

2
/ (A x
µ
)
2

trong đó: N là cỡ mẫu
A là độ chính xác của kết quả phân tích (có giá trị 0,1 hoặc 0,05)

µ
là giá trị trung bình (kết quả phân tích) của quần thể, thu được từ các nghiên
cứu trước đây
SD độ lệch chuẩn của giá trị trung bình
t là giá trị thu được từ bảng thống kê chuẩn (bảng Student), với
α
là giới hạn tin
cậy (95% hoặc 99%)
Tính toán cỡ mẫu cụ thể dựa theo bảng sau (đối v
ới đậu nành):
Thông số (đậu nành)
Daidzein (mg/100g) Genistein (mg/100g)
µ
20,16 67,47
SD 3,03 13,40
t (
α
=0,05) 2,069 2,069
Độ chính xác 0,1 (0,05) 0,1 (0,05)
Cỡ mẫu yêu cầu với độ chính xác 0,1 10 17


C trong 23 giờ
↓

Để nguội, đuổi hết HCl dư
↓

Định mức bằng HCl 20 mmol
↓

Tạo dẫn xuất
↓

Xác định trên HPLC bằng detector huỳnh quang

Tạo dẫn xuất
Hút 0,5 ml mẫu pha trong HCl 20mM vào lọ 1,5ml có nắp, thêm 70
µ
l borate để tạo môi trường
dẫn xuất có pH = 8,2 - 9,7, lắc trên máy lắc ống nghiệm, thêm 20
µ
l AQC (3mg/ml trong
acetonitril), lắc đều bằng tay khoảng 1 phút. Đậy kín, ủ ở 55
o
C trong 10 phút (mẫu sau dẫn xuất
ổn định ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 tuần). 4.1.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
-
LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu

5 Histidin
0,013 0,042
7 Arginin
0,053 0,174
8 Threonin
0,053 0,176
9 Alanin
0,061 0,200
10 Prolin
0,090 0,298
11 Cystein
0,026 0,085
12 Tyrosin
0,015 0,051
13 Valin
0,009 0,029
14 Methionin
0,043 0,142
15 Lysin
0,181 0,598
16 Isoleucin
0,089 0,295
17 Leucin
0,008 0,026
18 Phenylalanin
0,008 0,026
4.1.3. Khoảng tuyến tính
Để tiến hành xác định khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích, chúng tôi pha một
dãy chuẩn có nồng độ từ 0,1 đến 100
µ
Độ lệch chuẩn tương đối được tính theo công thức: RSD = s*100/X
TB
Bảng 2: Kết quả về độ lặp lại hàm lượng trong mẫu hạt đậu
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6
N x
TB
S RSD
Các acid amin
g/ 100g
g/ 100g (%)
Acid aspartic 4,444 4,435 4,511 4,421 4,431 4,507 6 4,453 0,040 0,91
Serin 1,615 1,627 1,634 1,594 1,605 1,629 6 1,613 0,016 1,01
Acid glutamic 8,97 8,952 9,105 8,82 8,943 9,078 6 8,988 0,104 1,15
Glycin 2,406 2,431 2,442 2,382 2,399 2,435 6 2,411 0,024 1,01
Histidin 1,879 1,875 1,907 1,816 1,873 1,901 6 1,882 0,033 1,76
Arginin 4,01 4,051 4,073 3,969 3,997 4,058 6 4,018 0,042 1,03
Threonin 2,062 2,058 2,093 2,041 2,056 2,087 6 2,066 0,020 0,96
Alanin 2,564 2,559 2,603 2,539 2,557 2,595 6 2,569 0,024 0,95
Prolin 2,77 2,765 2,812 2,742 2,762 2,803 6 2,776 0,027 0,96
Cystein 0,172 0,171 0,174 0,173 0,169 0,174 6 0,172 0,002 1,13
Tyrosin 1,702 1,699 1,728 1,685 1,697 1,723 6 1,706 0,016 0,97
Valin 2,108 2,104 2,146 2,087 2,152 2,134 6 2,112 0,028 1,33
Methionin 0,902 0,9 0,915 0,893 0,899 0,913 6 0,904 0,009 0,95
Lysin 1,849 1,845 1,877 1,781 1,843 1,903 6 1,853 0,041 2,22
Isoleucin 2,002 1,998 2,032 1,982 1,996 2,026 6 2,006 0,019 0,95
Leucin 3,582 3,575 3,636 3,547 3,572 3,625 6 3,59 0,034 0,95
Phenylalanin 3,468 3,461 3,52 3,433 3,457 3,509 6 3,475 0,033 0,96


0,09
0,55
Acid glutamic 16,46 16,52 16,60 16,66 16,53 16,54 6 16,55
0,07
0,42
Glycin 17,76 17,35 17,91 17,95 17,65 17,77 6 17,73
0,22
1,22
Histidin 18,41 18,49 18,58 18,64 18,59 18,58 6 18,55
0,08
0,45
Arginin 21,26 21,29 21,31 21,33 21,27 21,32 6 21,30
0,03
0,13
Threonin 21,42 21,50 21,48 21,53 21,53 21,47 6 21,49
0,04
0,19
Alanin 22,07 22,10 22,13 22,14 22,18 22,12 6 22,12
0,04
0,17
Prolin 23,37 23,40 23,42 23,42 23,39 23,41 6 23,40
0,02
0,08
Cystein 26,42 26,13 26,16 26,45 26,13 26,16 6 26,24
0,15
0,57
Tyrosin 26,76 26,80 26,82 26,80 26,75 26,78 6 26,79
0,03
0,10
Valin 27,90 27,93 27,96 27,95 27,94 27,95 6 27,94

0,371
0,370 0,367 0,367 0,369 0,375 6 0,370 0,003 0,80
Acid glutamic
1,071
1,069 1,087 1,102 1,068 1,084 6 1,080 0,014 1,25
Glycin
0,379
0,379 0,385 0,376 0,368 0,384 6 0,379 0,006 1,62
Histidin
0,435
0,434 0,454 0,431 0,434 0,440 6 0,438 0,008 1,93
Arginin
1,514
1,511 1,505 1,499 1,509 1,532 6 1,512 0,011 0,74
Threonin
0,612
0,611 0,621 0,606 0,610 0,619 6 0,613 0,006 0,95
Alanin
0,162
0,161 0,164 0,157 0,161 0,164 6 0,162 0,003 1,61
Prolin
0,235
0,234 0,238 0,221 0,234 0,237 6 0,233 0,006 2,71
Cystein
0,068
0,068 0,069 0,066 0,068 0,069 6 0,068 0,001 1,41
Tyrosin
0,601
0,600 0,610 0,589 0,599 0,608 6 0,601 0,008 1,25
Valin

0,20
1,27
Acid glutamic 16,35 16,42 16,30 16,45 15,94 16,07 6 16,26
0,21
1,26
Glycin 17,22 17,30 17,17 17,32 16,80 16,94 6 17,13
0,21
1,21
Histidin 18,41 18,49 18,34 18,44 17,95 18,08 6 18,28 0,22 1,20
Arginin 21,30 21,31 21,28 21,30 21,15 21,18 6 21,25
0,07
0,32
Threonin 21,48 21,49 21,46 21,50 21,33 21,14 6 21,40
0,14
0,67
Alanin 22,13 22,13 22,10 22,13 21,98 22,02 6 22,08
0,07
0,31
Prolin 23,43 23,41 23,40 23,45 23,29 23,34 6 23,39
0,06
0,26
Cystein 26,14 26,10 26,11 26,16 25,99 26,04 6 26,09
0,06
0,24
Tyrosin 26,80 26,75 26,77 26,80 26,32 26,69 6 26,69
0,19
0,70
Valin 27,94 27,90 27,91 27,97 27,79 27,85 6 27,89
0,06
0,23

Acid glutamic
1,228
1,226 1,247 1,226 1,225 1,243 6 1,232 0,010 0,79
Glycin
0,540
0,539 0,548 0,554 0,538 0,546 6 0,544 0,006 1,18
Histidin
0,528
0,527 0,535 0,532 0,526 0,534 6 0,530 0,004 0,77
Arginin
1,916
1,912 1,944 1,996 1,910 1,939 6 1,936 0,033 1,70
Threonin
0,701
0,699 0,711 0,679 0,699 0,709 6 0,700 0,011 1,61
Alanin
0,287
0,287 0,292 0,274 0,286 0,291 6 0,286 0,006 2,15
Prolin
0,409
0,408 0,415 0,405 0,417 0,414 6 0,411 0,005 1,19
Cystein
0,051
0,051 0,052 0,050 0,061 0,051 6 0,053 0,004 7,59
Tyrosin
1,032
1,030 1,048 1,022 1,129 1,044 6 1,051 0,039 3,76
Valin
0,329
0,328 0,334 0,326 0,338 0,333 6 0,331 0,004 1,35

0,07
0,44
Acid glutamic 16,11 16,27 16,24 16,27 16,26 16,12 6 16,21
0,08
0,46
Glycin 16,99 17,12 17,10 17,14 17,12 17,09 6 17,09
0,05
0,31
Histidin 18,13 18,28 18,26 18,32 18,28 18,19 6 18,24
0,07
0,39
Arginin 21,20 21,24 21,25 21,26 21,23 21,18 6 21,23
0,03
0,15
Threonin 21,42 21,42 21,43 21,44 21,42 21,43 6 21,43
0,01
0,04
Alanin 22,03 22,06 22,07 22,09 22,06 22,12 6 22,07
0,03
0,14
Prolin 23,34 23,36 23,37 23,39 23,37 23,34 6 23,36
0,02
0,08
Cystein 26,06 26,07 26,08 26,10 26,07 26,04 6 26,07
0,02
0,07
Tyrosin 26,70 26,75 26,76 26,76 26,75 26,69 6 26,73
0,03
0,12
Valin 27,87 27,89 27,91 27,91 27,89 27,78 6 27,87

g) biết trước (thêm vào).
M
2
: acid amin (
µ
g) xác định được.
Dựa vào đường chuẩn làm song song với mẫu thực chúng tôi thu được kết quả của mẫu
thêm chuẩn và đem so với giá trị cho vào, mỗi nồng độ làm 3 mẫu và lấy kết quả trung bình. Ta
có kết quả ở bảng 8,9,10 với các nền mẫu là hạt đậu, đậu phụ, sữa đậu nành. Bảng 8: Kết quả độ thu hồi với nền mẫu hạt đậu
Các thông số
Các acid amin
Hm lng trong mu
(mg/100g) n = 3
Hm lng chun thờm
vo (mg/100g)
Hm lng tỡm thy
(mg/100g) n = 3
thu hi
(%)
Acid aspartic
3,096
0,022
3,117
95,5
Serin
1,538
0,018

1,947
93,6
Prolin
2,257
0,019
2,276
98,2
Cystein
0,186
0,010
0,196
92,1
Tyrosin
1,892
0,030
1,922
97,3
Valin
1,771
0,019
1,790
98,2
Methionin
0,902
0,025
0,927
99,1
Lysin
0,967
0,024

Arginin 1,333 0,029 1,362 98,3
Threonin 0,559 0,020 0,578 96,7
Alanin 0,158 0,015 0,173 98,2
Prolin 0,233 0,019 0,252 99,1
Cystein 0,059 0,010 0,068 95,3
Tyrosin 0,553 0,030 0,582 97,6
Valin 0,198 0,019 0,217 98,2
Methionin 0,102 0,025 0,126 99,1
Lysin 0,373 0,024 0,397 99,2
Isoleucin 0,205 0,022 0,227 99,0
Leucin 0,342 0,022 0,364 99,1
Phenylalanin 0,677 0,028 0,705 98,9
B¶ng 10: KÕt qu¶ ®é thu håi víi nÒn mÉu s÷a ®Ëu nµnh
C¸c th«ng sè
C¸c acid amin
Hµm l−îng trong mÉu
(mg/100ml) n = 3
Hµm l−îng chuÈn thªm
vµo (mg/100ml)
Hµm l−îng cuèi
(mg/100ml) n = 3
§é thu håi
(%)
Acid aspartic 0,052
0,022 0,072
93,4
Serin 0,064

0,019 0,053
95,3
Methionin 0,026 0,025 0,050 95,4
Lysin 0,085
0,024 0,108
96,7
Isoleucin 0,035
0,022 0,056
97,2
Leucin 0,062
0,022 0,083
98,1
Phenylalanin 0,139
0,028 0,166
97,8

Qua kết quả trên hiệu suất thu hồi của cả 3 loại nền đều trên 90% trong khoảng tuyến tính. Độ
thu hồi với nền mẫu là đậu phụ cao hơn so với nền mẫu là hạt đỗ tương và thấp nhất là trên nền
mẫu sữa đậu nành. Do đó có thể kết luận, phương pháp này cho phép xác định hàm lượng các
acid amin có độ thu hồi đều trong khoảng 92 - 99%.
4.2. Khảo sát và chuẩn hóa phương pháp phân tích daidzein và genistein
4.2.1. Lựa chọn cột tách và điều kiện sắc ký
Đề tài đã khảo sát một số pha động trong phân tách isoflavon và sử dụng các cột sắc ký hiện có,
bao gồm cột Novapak (150mm x 3,9 mm, 5
µ
m, Waters, Mỹ), cột Symmetry C18 (150mm x 3,9
mm, 5
µ
m, Waters, Mỹ), cột Luna (2) C18 (250mm x 3,9 mm, 5
µ

được thể hiện ở hình 2.
4.2.2. Điều kiện chiết xuất isoflavon
Để lựa chọn được điều kiện chiết xuất isoflavon phù hợp, một số phương pháp trên thế giới đã
được áp dụng và khảo sát tại phòng thí nghiệm. Dịch chiết và dịch làm sạch các isoflavon được
phân tích trên sắc ký lỏng để xác định khả năng chiết xuất dựa vào sự có mặt của các pic
isoflavon đối chiếu với tài liệu đã công bố. Các quy trình chiết xuất đã khảo sát bao gồm:

Quy trình 1: Áp dụng theo Hutabarat và cộng sự [15]
1 g bột đậu xay mịn(hoặc 25 ml sữa đậu nành) /bình cầu 100 ml
↓

Thêm 10ml HCl 2M + 40ml ethanol 96% + 0,02g BHT
↓

Lắc đều, siêu âm 20 phút
↓

Đun hồi lưu ở 80
o
C trong 1 giờ
↓

Để nguội, định mức vừa đủ 50ml bằng ethanol 96%
↓

Lọc, bơm vào HPLC



Bơm vào HPLC

Quy trình 3: Theo Murphy và cộng sự [19]
1 g mẫu
↓

Thêm 10 ml acetonitril, 2 ml HCl 0,1M và 5 ml nước cất
↓

Khuấy hoặc lắc qua đêm ở nhiệt độ phòng
↓

Chuyển vào ống ly tâm, ly tâm 3000 vòng/ phút
↓

Hút lấy dịch chiết trong vào ống nghiệm sạch
↓

Thổi khô dịch chiết bằng khí nitơ
↓

Hòa tan bằng methanol 50% và định mức 100ml
↓

Lọc qua màng PTFE 0,45
µ
m
↓


Gradient như
Bảng 11
. Detector PDA ở 260 nm.
Hình 4: Sắc đồ các isoflavon thu được theo quy trình 2. Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút.
Gradient như
Bảng 11
. Detector PDA ở 260 nm. Hình 5: Sắc đồ các isoflavon thu được theo quy trình 3. Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút.
Gradient như
Bảng 11
. Detector PDA ở 260 nm.
4.2.3. Độ lặp lại của phương pháp
Để xác định độ lặp lại, một mẫu được chọn và phân tích lặp lại 5 lần. Tính toán kết quả trung
bình và hệ số biến sai (CV), thể hiện ở bảng 12. Phương pháp phân tích có độ biến thiên đối với
daidzein là 11,6 % và đối với genistein là 8,6%.
Bảng 12: Kết quả khảo sát độ lặp lại trong phân tích daidzein và genistein

Mẫu Daidzein (mg/100g) Genistein (mg/100g)
1 5,5 6,4
2 4,7 6,0
3 6,2 5,9
4 5,1 6,5
5 4,9 5,2
Trung bình
5,1 6,0

µ
g/ml đến 120
µ
g/ml và genistein nồng độ từ
0,8
µ
g/ml đến 80
µ
g/ml.
4.2.5. Độ thu hồi của phương pháp
Độ thu hồi được xác định bằng cách nạp chuẩn có nồng độ thích hợp vào ba loại mẫu. Chọn từ
các mẫu đậu tương, đậu phụ và sữa đậu nành mỗi loại một mẫu đã phân tích (đã biết hàm lượng
trung bình) để nạp chuẩn, tiến hành 3 lần song song. Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp daidzein
120
µ
g/ml và genistein 80
µ
g/ml để nạp vào mẫu. Phân tích các mẫu nạp chuẩn và tính toán hệ
số thu hồ
i, kết quả thu được thể hiện ở bảng 13 và 14. Sắc đồ mẫu sữa đậu nành không nạp
chuẩn và mẫu sữa nạp chuẩn được thể hiện ở hình 7 và 8.
Bảng 13. Kết quả khảo sát độ thu hồi đối với daidzein
Tên mẫu
HL daidzein
ban đầu (
µ
g/g)
Lượng chuẩn
nạp vào (
µ

g/g)
Lượng chuẩn
nạp vào (
µ
g/g)
HL genisstein
tìm thấy (
µ
g/g)
Hệ số thu
hồi (%)
TB
238,4 160 423,6 110,6 110,6
238,4 160 430,0 113,3
Đậu tương: nạp 1 ml
chuẩn vào 0,5g mẫu
238,4 160 412,7 106,0
56,1 40 106,3 118,2 112,1
56,1 40 102,5 111,4
Đậu phụ: nạp 0,5 ml
chuẩn vào 1 g mẫu
56,1 40 102,9 112,1
9,7 8 18,4 107,2 107,2
9,7 8 18,1 104,1
Sữa đậu nành: nạp 0,1
ml chuẩn vào 1ml mẫu
9,7 8 19,3 116,5
Kết quả trên cho thấy độ thu hồi đối với daidzein trong đậu tương và sản phẩm là 103,7% đến
111,6%, còn đối với genistein là từ 107,2% đến 112,1%. Theo nghiên cứu của Jose và CS [16],
hệ số thu hồi cao hơn 100% có thể là do trong quá trình phân tích, một phần isoflavon ở dạng

20
àl
Nhiệt độ buồng chứa mẫu 30
O
C
Detector
Huỳnh quang,

Ex
=250 nm;

Em
=395 nm

-
Chng trỡnh dung mụi:
Thi gian (phỳt) Tc dũng (ml/phỳt) m borat (%) Acetonitril (%) H
2
O (%)
0,5 1,0 99 1 0
18,0 1,0 95 5 0
19,0 1,0 91 9 0
29,5 1,0 83 17 0
33,0 1,0 0 60 40
36,0 1,0 100 0 0
65,0 1,0 0 60 40
100,0
1,0 0 60 40
4.3.2. iu kin phõn tớch daidzein v genistein
T cỏc kt qu kho sỏt thu c, ti a ra quy trỡnh v cỏc iu kin phõn tớch

2,84 1,58 6,58 2,09 1,97 3,98 2,05 1,78 2,20 0,16 1,99 1,70 0,89 0,91 1,62 2,82 2,78
Đậu tương, chợ Hàng Da
2,80 1,55 6,49 2,06 1,94 3,93 2,02 1,76 2,17 0,16 1,96 1,67 0,88 0,89 1,60 2,78 3,73
Đậu Hải Dương, chợ Thái Hà
2,39 1,55 6,21 1,69 1,88 2,62 1,78 1,39 1,76 0,19 1,85 1,51 0,71 1,02 1,47 2,47 2,86
Đậu mơ Hưng Yên, chợ Thái Hà
2,47 1,60 6,43 1,75 1,53 2,71 1,84 1,44 1,82 0,09 1,40 1,56 0,73 1,06 1,52 2,56 2,96
Đậu Hà Bắc, chợ Thái Hà
2,33 1,51 6,05 1,65 1,44 2,55 1,74 1,36 1,72 0,09 1,32 1,47 0,69 0,99 1,43 2,41 2,79
Đậu Đông Anh, chợ Lê Quý Đôn
2,35 1,82 6,57 1,67 1,33 3,26 2,46 1,38 2,05 0,11 2,12 1,63 0,59 1,63 1,57 2,59 2,65
Đậu Hưng Yên, chợ Lê Quý Đôn
2,88 1,23 6,05 2,05 1,63 3,99 3,01 1,69 1,51 0,13 2,60 2,00 0,72 0,95 1,92 2,17 2,25
Đậu tương, chợ Lê Quý Đôn
2,87 2,22 6,01 2,04 1,62 3,98 2,89 1,68 2,50 0,13 2,59 1,99 0,72 1,99 1,91 2,16 2,23
Đậu mơ Hà Bắc, chợ Hôm
2,74 2,12 7,65 1,94 1,55 3,80 2,86 1,61 2,39 0,13 2,47 1,90 0,69 1,90 1,83 2,02 2,09
Đậu tương, chợ Hôm (1)
3,10 1,54 6,59 2,20 2,03 4,21 2,03 1,93 2,26 0,19 1,89 1,77 0,90 0,97 1,65 2,94 2,76
Đậu tương chợ Hôm (2)
3,19 1,59 6,79 2,27 2,09 4,34 2,09 1,99 2,33 0,20 1,95 1,82 0,93 1,00 1,70 2,03 3,87
Đậu Bắc Ninh, chợ Ô chợ Dừa
2,12 2,16 6,03 1,83 1,78 3,77 2,01 1,07 1,63 0,10 2,74 1,44 0,71 0,73 1,34 2,31 3,51
Đậu tương, chợ Ngô Sĩ Liên (1)
2,86 2,92 6,14 2,47 2,40 4,09 2,71 1,44 2,20 0,14 2,70 1,94 0,96 0,99 1,81 2,12 2,74
Đậu tương, chợ Ngô Sĩ Liên (2)
2,22 2,26 6,30 1,91 1,86 3,94 2,10 1,12 1,70 0,10 2,86 1,50 0,74 0,76 1,40 2,41 3,07
Đậu tương (USA) [7]
4,59 2,12 7,01 1,68 0,98 2,83 1,59 1,71 2,13 0,59 1,38 1,82 0,49 2,43 1,77 2,97 1,90


Đậu phụ Thái Hà 2
0,30 0,36 1,09 0,37 0,41 1,39 0,59 0,17 0,24 0,06 0,57 0,21 0,10 0,39 0,22 0,36 0,71
Đậu phụ Thái Hà 3
0,29 0,37 1,12 0,38 0,42 1,43 0,60 0,17 0,25 0,06 0,59 0,22 0,11 0,40 0,23 0,37 0,73
Đậu phụ Hàng Da 1
0,40 0,47 1,40 0,47 0,53 1,87 0,77 0,22 0,32 0,10 0,65 0,27 0,11 0,56 0,29 0,47 0,95
Đậu phụ Hàng Da 2
0,37 0,44 1,31 0,44 0,50 1,75 0,72 0,21 0,30 0,09 0,61 0,25 0,10 0,52 0,27 0,44 0,89
Đậu phụ Hàng Da 3
0,38 0,45 1,33 0,45 0,50 1,78 0,73 0,21 0,30 0,10 0,62 0,26 0,10 0,53 0,28 0,45 0,99
Đậu Phu (USA) [7]
1,74 0,74 2,72 0,62 0,46 1,05 0,64 0,65 0,85 0,22 0,53 0,79 0,20 1,03 0,78 1,12 0,76
Bảng 17. Hàm lượng trung bình các acid amin trong mẫu sữa đậu nành
Hàm lượng các acid amin trong sữa đậu nành (mg/l)
Tên mẫu
Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe
Sữa đậu nành Văn Chương 1
0,43 0,51 1,23 0,54 0,53 1,92 0,70 0,29 0,41 0,05 1,03 0,33 0,22 0,68 0,32 0,57 1,17
Sữa đậu nành Văn Chương 2
0,42 0,49 1,19 0,52 0,51 1,86 0,68 0,28 0,40 0,05 1,00 0,32 0,21 0,66 0,31 0,55 1,13
Sữa đậu nành Văn Chương 3
0,39 0,46 1,11 0,49 0,48 1,73 0,63 0,26 0,37 0,05 0,93 0,30 0,20 0,61 0,29 0,51 1,05
Sữa đậu nành Nguyễn Cao 1
0,52 0,64 1,57 0,66 0,69 2,00 0,77 0,28 0,46 0,08 1,21 0,34 0,26 0,85 0,35 0,62 1,39
Sữa đậu nành Nguyễn Cao 2
0,42 0,49 1,19 0,52 0,51 1,86 0,68 0,28 0,40 0,05 1,00 0,32 0,21 0,66 0,31 0,55 1,13
Sữa đậu nành Nguyễn Cao 3


Kt qu ti Bng 15 cho thy, trong thnh phn ca ht u tng cú cỏc acid amin cn thit cho c th. Trong 7 ch c tin hnh
thu thp mu, phõn tớch v ly giỏ tr trung bỡnh cho thy tng hm lng 18 acid amin nm trong khong 33 40%. Trong ú ngoi acid
glutamic cú t l cao nht mt s acid amin khụng thay th cng cú hm lng khỏ cao nh phenylalanin, leucin, isoleucin, threonin, valin v
lysin. Kt qu hm lng tng 17 acid amin trong ht u tng theo Bng thnh phn ca USA l 37,99%.
Kt qu ti Bng 16 cho thy, trong thnh phn ca u ph cú cỏc acid amin cn thit cho c th. Trong 6 ch c tin hnh thu
thp mu, phõn tớch v ly giỏ tr trung bỡnh cho thy tng hm lng 18 acid amin nm trong khong 7 10%. Trong ú ngoi acid glutamic
cú t l cao nht mt s acid amin khụng thay th cng cú hm lng khỏ cao nh phenylalanin, leucin, isoleucin, tyrosin v lysin. c bit
u ph mua ch m (u m) cho thy cú hm lng tng acid amin l cao nht so vi u cỏc ch khỏc 10,6%. Kt qu hm lng tng
17 acid amin trong u ph theo Bng thnh phn ca USA l 14,9%.
Kt qu ti Bng 17 cho thy, trong thnh sa u nnh cú cỏc acid amin cn thit cho c th. Trong 8 ch c tin hnh thu thp
mu, phõn tớch v ly giỏ tr trung bỡnh cho thy tng hm lng 18 acid amin nm trong khong 11 18mg/lit. Trong ú ngoi acid glutamic
cú t l cao nht mt s acid amin khụng thay th cng cú hm lng khỏ cao nh arginin, phenylalanin, leucin, tyrosin, threonin v lysin.
Kt qu hm lng tng 17 acid amin trong sa u nnh theo Bng thnh phn ca USA l 3,65%. Cú s khỏc bit ln v nng tng 17
acid amin so vi bng thnh phn ca M cú th l do s khỏc nhau v m c ca loi sa u nnh do quy trỡnh sn xut khỏc nhau.
Hình 9. Sắc đồ các acid amin trong hạt đậu tơng. Ct AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x 3,9àm). Tc dũng 1ml/phỳt, nhit ct 35
o
C,
chng trỡnh dung mụi nh mc 4.3.1. Detector hunh quang,
Ex
=250 nm;
Em
=395 nm