QUY TRÌNH TẠO DÒNG GEN SERINE PROTEASE THỦY PHÂN
FIBRIN Ở ESCHERICHIA COLI SỬ DỤNG BỘ KIT TA CLONING
I. GIỚI THIỆU
1. Fibrin
Fibrin đóng cục là một trong những nguyên nhân của bệnh tim mạch, gây tắc nghẽn
mạch máu cản trở lưu thông máu. Hiện nay một số nước trên thế giới như Trung Quốc,
Nhật Bản đã chiết xuất và tinh sạch được lumbrokinase từ một số loài giun có khả năng
thủy phân được fibrin, làm tan các cục máu đông. Có thể sinh tổng hợp enzyme này
bằng phương thức tái tổ hợp: tạo dòng đoạn gen mã hóa cho enzyme lumbrokinase (852
bp AF304199.1) ở E. coli.
2. Enzyme lumbrokinase của giun đỏ (Lumbricus rubellus)
Enzyme lumbrokinase của giun đỏ Lumbricus rubellus (red earthworm - loài giun đất
có màu huyết dụ) là một enzyme thủy phân fibrin. Đoạn DNA mã hóa gen lumbrokinase
được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào trình tự gen mã hóa
lumbrokinase trên GenBank với mã số AF304199 có kích thước 852 bp được tạo dòng với
vector pGEM-T.
Một số nhà nghiên cứu Việt Nam đã khai thác lumbrokinase và sử dụng enzyme này từ
nguồn nguyên liệu tự nhiên để làm cơ sở cho việc nghiên cứu biểu hiện cũng như sản xuất
lumbrokinase. Chúng tôi tiến hành tạo dòng gen mã hóa lumbrokinase từ giun đỏ
(Lumbricus rubellus).
3. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)
Vi khuẩn E. coli là vi khuẩn Gram (-), hình que, dài khoảng 2-3 mcg, đường kính
0.5mcg. E. coli hiếu khí, kị khí tùy tiện thường gặp trong đường ruột, phát triển dễ dàng
trong các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ tối ưu là 37
0
C. E. coli có 1 NST nằm
trong thể nhân, là một chuỗi ADN trần với khoảng 4.10
6
cặp base.
E. coli được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực tạo dòng gene cũng như trong các lĩnh vực
ứng dụng khác do có nhiều ưu điểm:

Bước 3: Sau khi nối DNA, vector chứa DNA sẽ được biến nạp vào tế bào E. coli và
tiến hành trải khuẩn lạc, quan sát chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng bởi gen LacZ trên
vector.
Bước 4: Chọn khuẩn lạc trắng để tách chiết DNA và điện di, kiểm tra kết quả tạo
dòng serine protease gen.
Bước 5: Kiểm tra các tế bào đã chọn bằng cách dùng enzyme cắt giới hạn, phân tích
trình tự.
2
Test Kết Quả Biến Nạp
Tách Chiết DNA Tổng Số
PCR Khuếch Đại DNA
Insert DNA  Vector
Biến Nạp DNA  E.coli
NZY5α Cell
Figure 1: Quy trình chuẩn bị DNA và vector cho biến nạp sử dụng T-Vector
2. Quy trình tạo dòng serine protease gen từ DNA Lumbricus rubellus
a. Tách chiết thu DNA đưa vào vector
 Loại bỏ protein với phenol chloroform:
- Giun sau khi rửa sạch, được ngâm trong nước cất 5 - 6 lần, mỗi lần 2 giờ để thải
hết chất bẩn. Một gam L. rubelluswas nghiền và khoảng 20 giây trong 10 ml đệm
guanidinium thiocyanate (GITC) làm biến tính protein.
- Thêm vào 0,5 ml 10% sarkosyl (sarkosyl được sử dụng để ngăn chặn sự khởi
đầu phiên mã DNA, Sigma, St Louis, Mỹ). Hỗn hợp được trộn tiếp với 1,0 ml natri
acetate 3M (pH 7.0), 10ml dung dịch phenol và 2 ml chloroform / isoamyl alcohol (v/v
là 24/1) và sau đó ly tâm trong 20 phút ở 4
o
C và 10.000 ×g. Cặn sau ly tâm chứa
protein sẽ bị loại bỏ.
- Bổ sung thêm RNase, protease loại bỏ các RNA và protein còn sót.
 Kết tủa và tách chiết DNA với isopropanol và ethanol:

gắn DNA mang 2 đầu A, rất thuận tiện
và thời gian ligation ngắn.
Figure 2 : pGEM-T vector (Promega)
• Nhân đoạn DNA serine protease gen bằng phản ứng PCR
- Chu trình nhiệt phản ứng: 95˚C/5’; 40× (95˚C/30”, 55˚C/1’, 72˚C/1’);
72˚C/10’; 4˚C/∞.
- Sử dung enzyme cắt giới hạn SmaI và AluI cắt giới hạn tạo đầu bằng đặc hiệu.
- Gắn nucleotide A vào đầu 3’ của DNA đích: DNA được ủ với Taq và ATP
trong 30 phút để gắn thêm Adenin vào đầu 3’.
bổ
sung
 Kết quả thiết kế mồi từ phần mềm Primer3 ( />OLIGO start len tm gc% any_th 3'_th hairpin seq
L_PRIMER 1 20 58.26 50.00 0.00 0.00 0.00
 ATGTTACTTCTCGCCCTTGC
4
R_PRIMER 820 20 58.21 61.11 0.47 0.00 0.00
 CAGTTTGGGATCCGACGC
PRODUCT SIZE: 820, pair any_th compl: 0.00, pair 3'_th compl: 0.00
- Đầu 5’ của mồi được gắn thêm linker để tạo vị trí cắt giới hạn cho enzyme SmaI
và AluI:
Vị trí cắt của SmaI 5’….CCC ↓ GGG…3’
3’…GGG ↓ CCC…5’
LEFT PRIMER: 5’- CCCGGG - ATGTTACTTCTCGCCCTTGC -3’
Vị trí cắt của AluI 5’…AG ↓ CT….3’
3’…TC ↓ GA…5’
RIGHT PRIMER: 5’-TCGA- CAGTTTGGGATCCGACGC-3’
- Như vậy đoạn DNA sau PCR có chứa vị trí cắt giới hạn của SmaI và AluI, có
chiều dài 830, bao gồm cả 10 base là 2 vị trí này trên DNA khuếch đại.
• Trình tự đoạn gen mã hóa lumbrokinase protein (lk-6) và vị trí mồi PCR:
>Gi|23345190|gb|AF304199.1|Lumbricus rubellus lumbrokinase protein (lk-6) gene,

High
concentration PCR
Low
concentration PCR
pGEM-T (50 ng) 1 ul 1 ul
PCR product 2 ul (= 100 ng) 8 ul (= 100 ng)
ligation buffer 5 ul (2X) 1.2 ul (10 X)
T4 DNA ligase 1 ul 1 ul
H2O 1 ul 0.8 ul
Total 10 ul 12 l
d. Biến nạp vector tái tổ hợp mang sản phẩm PCR vào tế bào khả biến E.
coli
- Hỗn hợp phản ứng gắn của các sản phẩm PCR và vector pGEM-T (Promega)
được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42
o
C
trong 45 giây và làm lạnh nhanh trong đá 3 phút.
- Sau đó tế bào khả biến được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường chọn lọc LB +
1,5% agar + Km (50 g/ml) + 1 M IPTG + X-gal (20 g/ml) ở 37
o
C qua đêm.
- Chọn khuẩn lạc đơn màu trắng để nuôi cấy lắc trên môi trường LB lỏng
+ Km (50 g/ml) ở 37
o
C, 220 vòng/phút trong khoảng 15 giờ, thu sinh khối tế bào
để tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp.
e. Kiểm tra khả năng tạo biến nạp
Để khẳng định tổ hợp được tách ra có phải là plasmid tái tổ hợp mang gen,
plasmid tái tổ hợp thu được được cắt bằng enzyme giới hạn BfaI rồi đem điện di.
- Enzyme BfaI cắt plasmid ở hai vị trí một trên DNA ngoại lai và một trên vector

thủy phân fibrin của enzyme tách từ một số loài giun đất Việt Nam, Những vấn đề
nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị Khoa học
toàn quốc lần thứ hai trong nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học,
Huế, 25-27/7/2003, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, (2003), 531-533.
[9]. Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phan Thị Ánh
Hồng, Chiết tách và tinh sạch enzyme thủy phân fibrin từ trùn quế Perionyx
excavatus, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV Hóa sinh và Sinh học phân tử
7
phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Hà nội 15-17/10/2008,
Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, (2008a), 661-665.
[10]. Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phan Thị Ánh
Hồng, Khảo sát đặc điểm các serine-protease từ trùn quế Perionyx excavatus, Hội
nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ Nông,
Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Hà Nội 15-17/10/2008, Nxb. Khoa học và
Kỹ thuật Hà Nội, (2008b), 123-127.
[11]. Wang F, Wang C, Li M, Gui L, Zhang J and Chang W, Purification,
charaterization and crystallization, 2003.
[12]. Cho IH, Choi ES, Lim GH, Lee HH, Molecular cloning, sequencing, and
expression of a fibrinolytic serine-protease gene from the earthworm Lumbricus
rubellus, J.Biochem Mol Biol, 37 (5), (2004b), 574-581.
[13]. Ge T, Sun ZJ, Fu SH and Liang GD, Cloning of thrombolytic enzyme
(lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris,
Protein Expression and Purification 42, (2005), 20-28.
[14]. Liu J, Wang X, Xu L, Zhang J, Liang D, Chang W, cDNA cloning and
expression of earthworm fibrinolytic enzyme component A, Chinese Science
Bulletin, Vol.48 No.1, (2003), 68-71.
[15]. Sambrook and Russell, Molecular Cloning a laboratory manual, CSHL Press,
Vol 1, 2, 3, 2001.
8