Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
Mục lục
I. Tổng quan:
1. Giới thiệu chung về enzyme rennin:
• Cấu trúc phân tử
• Đặc tính và khả năng thủy phân của rennin
• Sự họat hóa prorennin thành rennin
• Các yếu tố ảnh hưởng đến họat tính của enzyme rennin
• Bảo quản rennin
2. Dạ dày bê:
• Cấu trúc dạ dày
• Sự tiêu hóa thức ăn trong dạ dày
• Mối liên hệ của dạ dày bê và rennin
II. Phương pháp thu nhận rennin:
Quy trình:
1. Giai đọan 1: Thu nhận dung dịch rennet
2. Giai đọan2: thu nhận rennin từ dịch chiết
III. Các phương pháp phân tích chất lượng chế phẩm enzyme
− Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford
− Xác định hoạt lực đông tụ sữa của enzyme
− Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến
IV. Ứng dụng:
Trong công nghiệp sản xuất phomat.
Tài liệu tham khảo:
− Nguyễn Đức Lựợng – công nghệ enzyme- NXBĐHQG
− Ðồng Thị Thanh Thu , Sinh hóa ứng dụng, Nhà XB ÐHQG -TPHCM( 2002 )
− Bài giảng cn protein – enzyme- www.ebook.edu.vn/
− Các hình ảnh trên google
− METHOD FOR THE PURIFICATION OF CALF RENNET- Inventor:
Sethuraman Subramanian, Elkhart,ind – Oct 16/1985 –
http://www.freepatentsonline.com/4666843.html?query=calf+rennet&stemming=on

• Đặc tính:
Rennin tinh khiết có đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện pI=4.5. Rennin
thấm chọn lọc qua màng tế bào nhưng không thấm qua màng tế bào ở môi trường
kiềm.
Nhóm 10 – 07SH1D
2
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
• Đặc hiệu thủy phân:
Rennin chỉ thủy phân liên kết peptide và không làm ảnh hưởng đến liên kết
ester và amin. Rennin đặc hiệu có tác dụng mạnh lên các liên kết được tạo nên bởi
tyrosine và phenyl alanine (tạo mùi vị đặc trưng cho phomai)
Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc
tính thủy phân casein của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH. Ở pH 6.8 rennin phân
cắt trung bình 1/33 còn ở pH= 2.3 thì phân cắt 1/8 số liên kết peptide trong phân tử
casein.
d. Sự họat hóa prorennin thành rennin:
Rennin có trong màng nhày dạ dày ở dạng tiền enzyme là prorennin, gồm 2
phân đọan là prorennin A và B.
Prorennin là một chuỗi protein đơn chứa 3 cầu nối disulfite, nó được giữ lại
trong phân tử rennin hỗ trợ cho hoạt động của enzyme.
Prorennin ổn định ở pH = 5.3 – 9, dạng thô hòan tòan ổn định ở pH = 8.
Prorennin ở môi trường có ure 6M thì nhanh chóng bị phân hủy và có thể trở
thành dạng họat động.
 Quá trình họat hóa prorennin:
Sự họat hóa prorennin thành rennin xảy ra ở pH <5, xảy ra rất mạnh ở pH <3.
Trong quá trình họat hóa prorennin, 10-15% protein được tách ra dưới dạng peptide.
Họat động của prorennin bao gồm sự phân tách chuỗi peptide từ đầu cuối N của
prorennin, với sự giảm trọng lượng phân tử từ 36.000 còn 31.000, đầu N của phân tử
prorennin là alanine, còn của phân tử rennin họat động là glycine.
Khác với quá trình họat hóa pepsinogen, quá trình họat hóa prorennin không phải

Ở pH = 7 có sự tự phân
hủy và hoạt tính thủy phân
Nhóm 10 – 07SH1D
3
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
của rennin ở pH này rất thấp. Họat tính bị giảm khi pH >6 kèm theo sự xuất hiện
protein kết tủa trong dung dịch ở nhiệt độ cao.
Rennin bị mất họat tính nếu để lâu trong môi trường kiềm yếu pH = 9 , bị bất họat
nhanh chóng trong môi trường acid mạnh.
f. Bảo quản rennin:
Rennin tinh khiết được bảo quản ở 15
o
C. Dịch rennet được bảo quản ở nồng
độ muối cao 14-20% và có thể thêm Na-benzoate và propylene-glycol để bảo quản.
2. Dạ dày bê:
a. Cấu trúc dạ dày:
-Dạ dày là một đọan phình ra
của ống tiêu hóa có tác dụng:
chứa đựng thức ăn, nhào trộn
thức ăn để thấm qua dịch vị.
Thức ăn sẽ chịu sự tiêu hóa
của các enzyme tiêu hóa chứa
trong dịch vị, chuẩn bị giai
đoạn chính của việc tiêu hóa ở
ruột non.
-Hệ dạ dày kép gồm 4 túi: trong đó 3 túi trước (dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách)
gọi chung là dạ dày trước, không có tuyến tiêu hóa riêng, có chức năng tích trữ,
nhào trộn và chuyển hóa thức ăn. Túi thứ 4 gọi là dạ múi khế tương tự dạ dày đơn,
có hệ thống tuyến tiêu hóa phát triển mạnh.
 Các tuyến chính của dạ dày:

Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ
nồng độ Ca
2+
. Ca kết tủa ở dạ dày, phần nhũ thanh còn lại của sữa chuyển xuống ruột
non để tiêu hóa. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng
đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepsin (trong trường hợp thu chế
phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepsin) thì
khả năng đông tụ sữa kém đi.
II. Phương pháp thu nhận:
 Hóa chất:
− Muối NaCl, HCl sử dụng để kết tủa thu enzyme, nên hóa chất phải tinh khiết,
khô, không lẫn tạp chất, nhất là kim lọai nặng vì gây tủa và bất họat enzyme.
− Na-benzoate: chất bảo quản.
 Thiết bị: máy điều nhiệt, máy ly tâm, máy quang phổ kế, máy nghiền đồng hóa,
máy đo pH, cân Mettler K7, cân Prolabo.
 Nguyên liệu:
Nguyên liệu thu rennin là ngăn thứ tư dạ dày bê non (dạ múi khế) dưới 5 tháng tuổi.
 Quy trình: gồm 2 giai đọan: thu nhận dung dịch rennet (có chứa rennin) và thu
nhận rennin.
1. Giai đọan 1: Thu nhận dung dịch rennet*Giải thích quy trình:
 Xử lý sơ bộ:
Tách mỡ, rửa sơ: Lấy phần múi khế của bao tử bê và lộn ngược một cách nhẹ tay
để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, cân trọng lượng. Rửa nhẹ bằng nước lạnh,
không nên rửa quá kỹ sẽ làm mất enzyme, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%.
 Xay nhuyễn:
Nhóm 10 – 07SH1D
5

− Thêm HCl 6M chỉnh lại pH của dung dịch về 4 sẽ cho họat tính enzyme cao, khả
năng hòa tan tốt.
 Lọc: Vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc bằng vải màn và vải nhiều lớp
ta thu được dịch rennet chứa rennin họat động và tiền rennin bất họat.
− Dung dịch rennet thu nhận có màu hổ phách nhạt đến màu nâu đậm hoặc bột
màu trắng đến nâu nhạt, được bảo quản ở nồng độ muối cao 14-20% và thêm chất
bảo quản như sodium benzoate, propylene glycol.
2. Giai đọan2: thu nhận rennin từ dịch chiết
*Giải thích quy trình:
Nhóm 10 – 07SH1D
5000 vòng/phút
45 phút
6
Natribenzoate
Propylene glycol
Dịch rennet
Khuấy
Kết tủa
NaCl 22-
23%, Gelatin
Ly tâm thu tủa
Tinh sạch
Sấy khô
Rennin tinh
khiết
Rennin thô
Sấy khô
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
 Khuấy:
Dịch rennet được khuấy đều, bổ sung thêm chất bảo quản Natri bezoat 1% và

o
C. Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô.
Hiệu số trọng lượng túi ban đầu và sau khi thẩm tích là lượng NaCl đã thẩm tích qua
màng.
+Phuơng pháp 2: phương pháp sắc kí DEAE sephadex G-50
− Nguyên tắc:
Khi cho một dung dịch chứa nhiều chất có phân tử lượng khác nhau chạy qua cột
chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích
thước và trọng lượng khác nhau. Những chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lọt vào bên
trong lỗ gel do đó sẽ di chuyển chậm qua cột. Các chất có phân tử lượng lớn hơn sẽ di
chuyển bên ngoài hạt gel nên sẽ chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột trước. Sau
đó, chất có phân tử lượng nhỏ sẽ lần lượt đi ra theo mức độ phân tử lượng của chúng.
Kết quả là tách được các chất có phân tử lượng khác nhau thành các phân đoạn theo
trình tự các phân đọan có trọng lượng phân tử lớn ra truớc, các phân đọan có trọng
lượng phân tử nhỏ ra sau.
− Thực hiện:
 Hòa tan tủa trở lại bằng 50ml dung dịch đệm citrate 0.025M, pH 5.1 ta
được dung dịch A. Hút 5ml dung dịch A thêm vào dung dịch đệm citrate
0.025M, pH 5.1 (để qua đêm).
Nhóm 10 – 07SH1D
7
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
 Sau đó đem ly tâm 15000 vòng/phút trong 50 phút bỏ cặn. Phần dịch thu
được cho qua cột DEAE sephadex G-50 (từ 1-5% thể tích cột) và được cân
bằng bởi dung dịch đệm citrate 0.025M
 Sau đó enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0-18%.
 Thu mẫu qua cột: Protein được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của
muối NaCl từ 0-18% với tốc độ chảy 30ml/h.Ta thu được 15phân đọan và
2 peak A, B. Hiệu suất về họat tính enzyme: pepsin 20% và chymosin 72%.
Xác định hoạt tính thủy phân(proteolytic activity) của enzyme bằng cách ủ

(%) C
Proteolytic
activity (P)
(OD
280nm/ml)
C/P
Stock
rennet
33.2 11.1 3.0
Peak A 22.4 2.0 11.2
Peak B 3.7 - -
8
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
o Giai đoạn 3 – sấy bậc 2 : giai đoạn này có nhiệt độ cao hơn giai đoạn sấy bậc
1 để giúp cho nguyên liệu giữ nguyên các tính chất
hóa lý. Giai đoạn này áp suất chân không tiếp tục
thúc đẩy quá trình thăng hoa.
 Tính chất của sản phẩm sấy đông khô:
Nếu sấy ở nhiệt độ thường dễ làm enzyme bị hư hỏng,
mất đi tính chất ban đầu thì phương pháp này giúp cho
enzyme giữ nguyên liệu được tính chất hóa lý và có thể bảo
quản trong thời gian dài.
Sau khi sấy đông khô, enzyme thu được có dạng mảnh, màu trắng hoặc phớt hồng.
Xác định hiệu suất thu hồi enzym sau quá trình sấy đông khô:
enzymesausay
ngandaday
m
H
m
=

P
a V
−
−
=
P: hàm lượng protein của mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein (mg/mL)
OD: hiệu suất mật độ quang của mẩu enzyme đo được ở λ = 605nm (A)
F: độ pha loãng mẫu enzyme.
V
PU
: thể tích mẫu enzyme đem xác định hàm lượng protein.
Nhóm 10 – 07SH1D
9
×
×
s
E
V
E F
T V
=
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
Xác định hàm lượng protein tổng trong mẫu enzyme:
3
× × ×10
mau
t enzyme
mau
V
P P m

: thể tích dung dịch sữa (mL)
V
E
: thể tích dung dịch enzyme sử dụng (mL)
T: thời gian đông tụ sữa (phút)
F: độ pha loãng dịch enzyme
Tổng hoạt lực đông tụ sữa
3
× × ×10
mau
t enzyme
mau
V
E E m
m
−
=
(UI)
E
t
: tổng hoạt lực đông tụ sữa (UI)
V
mau
: thể tích mẫu dịch enzyme (mL)
m
mau
: khối lượng enzyme pha ra dạng dịch (mg)
m
enzyme
: khối lượng enzyme thu được sau khi sấy đông khô (g)

Đơn vị họat độ protease: là lượng enzyme trong 1phút ở 30
o
C phân giải được 1
lượng protein tương đương với 1 µmol tyrosin.
Hoạt lực proteolytic cuả enzyme trong 1 mL
sin
µ ×
tyro PU
mol V
H
t
=
(UI/mL)
V
PU
: thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng
t: thời gian thủy phân (phút)
Tổng hoạt lực proteolytic của mẫu enzyme
3
× × ×10
mau
t enzyme
mau
V
H H m
m
−
=
(UI)
H

Nhóm 10 – 07SH1D
11
t
R
t
H
H
P
=
Cn protein - enzyme Thu nhận enzyme rennin từ dạ dày bê
Nhóm 10 – 07SH1D
12