BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ MAI NHẤT NGHIÊN CỨU BỆNH VÀNG LÁ GREENING
HẠI CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM
VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP



Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
Mã số: 62.62.01.12
LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. Ngô Vĩnh Viễn
2. PGS.TS. Nguyễn Văn Viết

Hà Nội, 2014 i

LỜI CAM ĐOAN

thí nghiệm tại Trường Đại học tổng hợp Đài Loan, tham dự Hội nghị quốc tế về
bệnh Huanglongbing.
Chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong nhóm nghiên cứu về bệnh
hại cây ăn quả có múi, nơi mà tôi đã từng công tác trong nhiều năm, cũng là nơi
sinh hoạt chuyên môn của tôi đã luôn chia sẻ kinh nghiệm quý báu trong nghiên
cứu và giúp đỡ tôi trên mọi phương diện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt
Nam, Ban Đào tạo Sau đại học cùng tập thể cán bộ và quý thầy cô đã giúp đỡ
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án.
Xin ghi nhận nơi đây tình cảm yêu thương của vợ, con, cha mẹ, anh chị
em và toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã luôn hết lòng động viên tinh thần trong
suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án.
Xin chân thành cảm ơn! Lê Mai Nhất
iii MỤC LỤC

Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Dang mục các chữ viết tắt iv
Danh mục bảng v
Danh mục hình vi

MỞ ĐẦU


vi khuẩn Liberibacter asiaticus
19
1.2.4. Nghiên cứu các giải pháp quản lý bệnh vàng lá greening 20
1.2.4.1. Mối quan hệ giữa phân bón với sinh trưởng và năng suất 20
1.2.4.2. Sử dụng cây giống sạch bệnh 21
1.2.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của cây gốc ghép đến sản xuất

cây ăn quả có múi
23
1.2.4.4. Trồng xen ổi trong vườn cây ăn quả có múi 23
1.2.4.5. Biện pháp sinh học trong phòng trừ côn trùng môi giới
(Diaphorina citri Kuwayama)
24
1.2.4.6. Biện pháp hóa học trong phòng trừ côn trùng môi giới
(Diaphorina citri Kuwayama)
24
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước 26
1.3.1. Cây ăn quả có múi ở Việt Nam và thành phần sâu bệnh hại 26
1.3.2. Nghiên cứu về bệnh vàng lá greening và nguyên nhân gây bệnh 28
1.3.2.1. Lịch sử và sự phân bố của bệnh vàng lá greening 28
1.3.2.2. Triệu chứng bệnh vàng lá greening 28
1.3.2.3. Chẩn đoán và giám định bệnh vàng lá greening 30
1.3.3. Nghiên cứu về dịch tễ học của bệnh vàng lá greening 30
1.3.3.1. Nghiên cứu về sự lan truyền bệnh vàng lá greening 30
1.3.3.2. Nghiên cứu về ký chủ của rầy chổng cánh Diaphorina citri và
vi khuẩn Liberibacter asiaticus
31
1.3.4. Nghiên cứu các giải pháp quản lý bệnh vàng lá greening 33
iii


2.4.1.3. Phương pháp điều tra rầy chổng cánh (Diaphorina citri
Kuwayama) trên cây ăn quả có múi
44
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu giám định tác nhân gây bệnh

và sự lan truyền bệnh vàng lá greening
44
2.4.2.1. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh bằng hiển vi điện tử 44
2.4.2.2. Phương pháp chẩn đoán bệnh vàng lá greening

45
iii bằng sinh học phân tử
2.4.2.3. Phương pháp nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening
qua hạt giống
46
2.4.2.4. Phương pháp nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening
qua nhân giống vô tính
47
2.4.2.5. Phương pháp nghiên cứu sự lan truyền bệnh vàng lá greening
bằng môi giới rầy chổng cánh (Diaphorina citri Kuwayama)
47
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu xác định ký chủ và sự phân bố của các
chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi ở một
số tỉnh phía Bắc Việt Nam
49
2.4.3.1. Phương pháp xác định ký chủ của bệnh vàng lá greening 49
2.4.3.2. Phương pháp đánh giá mức độ nhiễm các mẫu bệnh vàng lá

60
3.1. Mức độ phổ biến và triệu chứng của bệnh vàng lá greening 60
3.1.1. Hiện trạng sử dụng giống cây ăn quả có múi tại Hà Nội và Hòa
Bình
60
3.1.2. Mức độ phổ biến của bệnh vàng lá greening tại các vùng điều tra 62
3.1.3. Mức độ nhiễm bệnh vàng lá greening trên một số chủng loại cây
có múi ở các vùng sinh thái
64
3.1.4. Mức độ nhiễm bệnh vàng lá greeining hỗn hợp với các bệnh vi
rút, viroid trên cây ăn quả có múi
66
3.1.5. Xác định nhóm triệu chứng bệnh vàng lá greening qua phân tích
bằng sinh học phân tử
68
3.1.6. Kiểm chứng khả năng nhiễm bệnh vàng lá greening trên đồng
ruộng dựa trên triệu chứng đã xác định
73
3.1.7. Cải tiến phương pháp tách chiết thô DNA trong chẩn đoán bệnh
vàng lá greening trên cây ăn quả có múi
77
3.2. Xác định tác nhân gây bệnh và sự lan truyền bệnh vàng lá greening 79
3.2.1. Xác định tác nhân gây bệnh vàng lá greening bằng hiển vi điện tử 79
3.2.2. Xác định tác nhân gây bệnh vàng lá greening bằng sinh học phân
tử
81
v vàng lá greening, (Phòng thí nghiệm trường Đại học tổng hợp Đài

2011)
97

3.18 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ cam (Citrus sinensis) bị bệnh vàng lá
greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)
100

3.19 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ quýt (Citrus reticulata) bị bệnh vàng
lá greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)
102

v 3.20 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ bưởi (Citrus grandis) bị bệnh vàng lá
greening (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2013)
103

3.21 Phản ứng của các chủng loại cây ăn quả có múi với

các nguồn mẫu thu thập từ chanh (Citrus aurantifolia) và quất
(Citrus fortunella) bị bệnh vàng lá greening (Nhà lưới Viện Bảo
vệ thực vật, 2013)
104

giống bưởi Phục Hòa (Viện Bảo vệ thực vật, 2010 - 2011)
118

3.29 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng được bổ sung

vào môi trường lỏng trong vi ghép đỉnh sinh trưởng cam Xã Đoài,
(Phòng thí nghiệm Viện Bảo vệ thực vật, 2012)
119

3.30 Kết quả thử nghiệm các kích thước đỉnh sinh trưởng khác nhau 121

v đến khả năng làm sạch bệnh sau vi ghép lần 1 (Phòng thí nghiệm
Viện Bảo vệ thực vật, 2012)
3.31 Ảnh hưởng tuổi cây vi ghép lần 1 đến tỷ lệ sống của vi ghép lần 2

(Phòng thí nghiệm Viện Bảo vệ thực vật, 2010 - 2012)
122

3.32 Kết quả cải tiến giá thể làm bầu đối với sản xuất cây giống

sạch bệnh (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2010)
127

3.33 Ảnh hưởng của thời vụ ghép đến tỷ lệ sống của cam Xã Đoài sau
ghép (Nhà lưới Viện Bảo vệ thực vật, 2011)
129


i các
giải pháp quản lý bệnh khác nhau (Nghi Lộc, Nghệ An, 10/2013)
140

3.41 Một số giải pháp trong phòng chống bệnh vàng lá greening

đạt hiệu quả ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (năm 2013)
144vi DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình
Trang

3.1 Triệu chứng lá vàng lốm đốm (A) cam Xã Đoài; (B) cam Canh 69

3.2 Triệu chứng cam Xã Đoài bị vàng lá cục bộ 70

3.3
Triệu chứng lá vàng lốm đốm, vàng cục bộ (A) Lá cam Xã Đoài;
(B) Lá Cam Canh (Blotchy)
70

3.4
Triệu chứng bệnh vàng lá greening trên Cam Xã Đoài (Vàng lá,


Xác định tác nhân gây bệnh VLG xâm nhập vào mạch dẫn bằng
hiển vi điện tử
80

3.12

Kết quả giám định bệnh vàng lá greening với các cặp mồi khác
nhau
81

3.13

Xác định sự lan truyền bệnh qua hạt giống (hạt chấp) 83

3.14

Xác định sự lan truyền bệnh qua hạt giống (hạt bưởi chua) 84

3.15

Lây nhiễm nhân tạo bệnh tristeza và chẩn đoán bệnh 86

3.16

Ảnh hưởng của thời gian nhiễm và mật độ RCC đến sự lan truyền
bệnh
89

3.17

Bài tiết và sinh sản của rầy chổng cánh 95

3.23

Ký chủ và môi giới lan truyền bệnh vàng lá greening 98

3.24

Phản ứng của các giống đến các mẫu bệnh vàng lá greening 105

3.25

Chủng I gây bệnh trên cam Xã Đoài và cam Canh; Chủng II gây
bệnh trên 4 giống (bưởi Diễn, chanh Eureka, Xã Đoài và cam
Canh)
106

3.26

Kết quả duplex-PCR trong xác định chủng gây bệnh 107

3.27

Sự phân bố của các chủng vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening trên
cây có múi
107

3.28

Cây Thanh Yên bị nhiễm chủng I và II sau 2 tháng lây bệnh 110

gốc ghép
133

3.36

Ảnh hưởng của vi khuẩn gây bệnh bệnh vàng lá greening thuộc
chủng II đến chiều cao cây gốc ghép
134

3.37

Đánh giá tính chống chịu của một số loại gốc ghép nhập nội với
bệnh vàng lá greening
136

3.38

Xử lý Streptomycine 12 giờ và 24 giờ và đối chứng 138

3.39

Hiệu quả chống tái nhiễm bệnh vàng lá greening trên vườn cam Xã
Đoài
142

1 MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài

100%, tùy thuộc vào tỷ lệ tán cây bị bệnh (Bassanezi và cs., 2005; Schwarz và
cs., 1973)[41][130], vườn cây không còn giá trị kinh tế sau trồng 7 đến 10
năm (Gottwald, 2010)[65]. Quả bị bệnh thường nhỏ hơn, nhẹ hơn và chua hơn,
độ Brix giảm, tỷ lệ nước quả và các chất hòa tan cũng giảm theo. Đồng thời,
chất lượng nước quả sau chế biến cũng bị ảnh hưởng đáng kể (Bassanezi và
cs., 2005)[41].
Các kết quả nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng vi khuẩn gây bệnh vàng lá
xuất hiện, đến nay các chủng mới, có độc tính nặng hơn đã hình thành (Hung
và cs., 2012)[95].
Ở Việt Nam, cây ăn quả có múi được trồng phổ biến khắp ba miền Bắc,
Trung và Nam. Bệnh vàng lá greening đã được ghi nhận gây hại trên cây ăn
quả có múi từ những năm 1960. Từ khi xuất hiện gây hại đến nay, bệnh vàng
lá greening đã có hai đợt cao điểm gây hại; năm 1970 bệnh đã gây hại tại hầu
hết các nông trường cam phía Bắc và năm 1990 tại hầu hết các vùng trồng
cam quýt trên cả nước (Hà Minh Trung, 2005)[30]. Mức độ thiệt hại trên bưởi
từ 17 – 25%, trên cam quýt từ 54 – 70% (Hà Minh Trung và cs., 2008; Ngô
Vĩnh Viễn và cs., 2009)[149][154]. Các tác giả cho rằng nguyên nhân do việc
sử dụng giống cây ăn quả có múi không đạt tiêu chuẩn kỹ thuật, cây giống đã
nhiễm sâu bệnh đặc biệt là bệnh vàng lá greening, tristeza và do không được
thâm canh, chăm sóc đúng kỹ thuật nên ngay từ khi trồng mới bệnh vàng lá
greening đã gây hại trầm trọng, sau vài năm cho quả cây đã bị kiệt sức và
nhanh chóng tàn lụi.
Bệnh vàng lá greening lan truyền từ các vật liệu nhân giống như cành
chiết, mắt ghép đã nhiễm bệnh và côn trùng môi giới. Những nghiên cứu
bước đầu về bệnh này ở Việt Nam đã được tiến hành, song những vấn đề về
bản chất của bệnh vẫn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ. Vì vậy, những
biện pháp phòng trừ bệnh vẫn còn ít hiệu quả. Nhằm giải quyết được các yêu
3 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tượng nghiên cứu
- Vi khuẩn Liberibacter asiaticus gây bệnh vàng lá greening trên cây có múi
và môi giới truyền bệnh rầy chổng cánh Diaphorina citri Kuwayama.
- Một số loài cây ăn quả có múi bản địa và nhập nội được trồng ở một số tỉnh
phía Bắc Việt Nam, các cây thuộc họ Rutaceae là ký chủ của vi khuẩn L.
asiaticus gây bệnh vàng lá greening trên cây có múi.

4.2. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu phương thức lan truyền bệnh, các yếu tố ảnh hưởng
tới sự phát sinh gây hại của bệnh trong điều kiện sinh thái ở các tỉnh phía Bắc.
Xác định các chủng vi khuẩn L.asiaticus gây bệnh trên cây có múi, sự phân
bố các chủng vi khuẩn. Nghiên cứu một số giải pháp có hiệu quả để phòng
chống bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi ở một số tỉnh phía Bắc.

5. Những đóng góp mới của luận án
- Cung cấp bổ sung dẫn liệu khoa học về mức độ phổ biến, triệu chứng, ký chủ
của bệnh vàng lá greening trên cây ăn quả có múi ở phía Bắc.
- Lần đầu tiên xác định được vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening thuộc chủng
I và II trên các giống cây ăn quả có múi hiện đang trồng trong sản xuất ở phía Bắc
Việt Nam.
- Đã hoàn thiện được kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng làm sạch bệnh vàng lá
greening và các bệnh vi rút khác, góp phần hoàn thiện quy trình sản xuất cây
giống sạch bệnh.
- Đánh giá tính chống chịu của một số loại gốc ghép bản địa và nhập nội với
bệnh vàng lá greening và đề xuất các giải pháp chống tái nhiễm bệnh vàng lá
greening.
5

Như vậy, việc nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh, phương pháp nhận
biết sớm cây bị bệnh, phương thức lan truyền và sự thay đổi độc tính của các
6 chủng vi khuẩn gây bệnh trên từng chủng loại cây ăn quả có múi là những vấn
đề quan trọng. Từ đó, làm cơ sở để xây dựng hệ thống các giải pháp phòng
chống tổng hợp bệnh VLG có hiệu quả kinh tế, kỹ thuật cao và bền vững.
1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
1.2.1. Nguôn gốc và phân loại cây ăn quả có múi
Là những loại cây trồng có sự phân bố rộng, nguồn gốc của các loại
cây ăn quả có múi khó có thể xác định một cách chính xác. Tuy nhiên nhiều
kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng cam quýt có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới Đông Nam châu Á. Tanaka (1979)[140] đã cho rằng các giống
thuộc chi Citrus có xuất xứ từ chân dãy núi Hymalaya phía đông Ấn Độ trải
dài qua miền Nam Trung Quốc, Nhật Bản và được chia ra làm bốn nhóm
chính theo các đặc điểm thực vật học:
Nhóm cam (orange group): gồm các loài Citrus sinensis và Citrus
aurantium
Nhóm quýt (mandarine group): gồm các loài Citrus reticulate, Citrus
unshiu, Citrus deliciosa và Citrus nobilis…
Nhóm bưởi (pummelo-grapefruit group): gồm các loài Citrus grandis
và Citrus paradise
Nhóm chanh (acid group): gồm các loài Citrus limon, Citrus jambhiri,
Citrus aurantifolia, Citrus limettoides, Citrus medica, Citrus karma và Citrus
lemonia…
1.2.2. Nghiên cứu về bệnh vàng lá greening
1.2.2.1. Triệu chứng, lịch sử phát hiện, phân bố của bệnh vàng lá
greening
Khi cây bị bệnh vàng lá greening vi khuẩn không gây hại mạch gỗ nhưng

vào khả năng chịu nhiệt độ nên vi khuẩn được chia làm dòng châu Á và châu
Phi. Vi khuẩn dòng châu Á có tên “Candidatus Liberibacter asiaticus” chịu
được nhiệt từ 27 – 32
°
C. Dòng châu Phi có tên “Candidatus Liberibacter
africanus” mẫn cảm với nhiệt độ 22 – 24
°
C. Nghiên cứu về khả năng chịu
nhiệt của dòng vi khuẩn gây bệnh ở Braxin và ở Hoa kỳ, Teixeira và cs.,
(2005c)[142], Halbert và cs., (2008)[74] đã đề nghị dòng vi khuẩn gây bệnh ở
Braxin và dòng vi khuẩn gây bệnh ở Hoa Kỳ là những dòng chịu nhiệt. Vi