Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
1
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm
Đề tài. Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất
nước mắm ngắn ngày
GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang
SVTH: Nhóm 19
Trần Quốc Huy 3005110114
Trần Thị Mỹ Lan 3005110137
Nguyễn Hoàng Linh 3005110145
Trần Thị Tiến 3005110335
Ngô Thị Minh Tuyền 3005110375
2
Nhóm: 19
Tp.Hồ Chí Minh-2014
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang

Mục lục
Nội dung trang
Lời mở đầu 4
I. Enzyme protease 5
1. Khái quát về enzyme 5
1.1 Enzyme 5
1.2 Đặc tính chung của enzym 5
1.3 Cấu tạo của enzym 5
2 Tổng quan về enzyme protease 6

2.7.2 Xử lý 47
2.7.3 Lên men 47
2.7.4 Lọc 51
2.7.5 Cô đặc chân không 52
2.7.6 Bổ sung hương 54
2.7.7 Đóng chai 56
IV Sản phẩm 58
1. Cách tăng hương vị cho nước mắm ngắn ngày 58
2. Tiêu chuẩn của nước mắm thành phẩm 58
3. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm 58
4. Một số sản phẩm nước mắm sử dụng phương pháp ngắn ngày trên thị
trường 60
Kết luận 62
Tài liệu tham khảo 63
4
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Lời mở đầu
Một trong những thành tựu to lớn của khoa học công nghệ trong thời gian gần
đây là nghiên cứu về enzyme, nó đặt trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên
trong mấy chục năm qua, và một trong những enzyme được nghiên cứu rất nhiều, đó là
enzyme protease, đây là enzyme được thu nhận từ rất nhiều nơi, từ động vật, thực vật
cho tới vi sinh vật đều là nguồn gốc của enzyme protease, và điều đặc biệt là enzyme
protease đóng vai trò vô cùng quan trọng trong cuộc sống của chúng ta và được ứng
dụng trong rất nhiều ngành nghề, một trong số đó là ứng dụng quan trọng trong công
nghệ sản xuất nước mắm ngắn ngày.
Bài báo cáo về enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày
sẽ giúp cho chúng ta hiểu rõ về enzym protease, cách thu nhận cũng như hiểu được
tầm quan trọng của enzyme protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày, để có thể
tham khảo và áp dụng thực tế một cách tốt nhất khi đi vào thực tế.

Nhóm enzym đa cấu tử :
- Gồm 2 phần:
+ Phần I: protein thuần : apoprotein hay apoenzym
6
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
+ Phần II: thành phần không phải protein : cofactor – chúng có thể gắn chặt
(prosthetic) hoặc lỏng lẻo với phần protein (coenzym)
Ngoài ra còn có một số kim loại giữ vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa
apoenzym và coenzym, tham gia vận chuyển điện tử.
2. Tổng quan về enzyme protease
2.1 . Giới thiệu.
Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các
amino acid. Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi
sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong
y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Protease là một trong những enzyme
được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực. Đặc biệt là công nghiệp thực phẩm,
protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của
con người. Hiện nay trên thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn
đang phát triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme protease.
Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease,
chủ yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ
được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây.
2.2 . Đặc điểm chung.
Ezyme protease là enzyme thủy phân các liên kết pectid (-CO-NH-) trong phân
tử protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc dittripepton.
7
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Hình 1.1: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein

giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti.
• Endo peptidase: (Dựa vào động lực học của cơ chế xúc tác) được chia thành 4 nhóm:
- Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm
hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.
Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotripsin bao
10
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao
gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine
proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
- Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein
protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài proteinase
động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase thường hoạt động ở vùng
PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
- Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin
bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin…. Các asportic
proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động
mạnh ở PH trung tính.
- Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn,
nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt
động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA.
 Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia làm các
nhóm:
- Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid 2-4.
- Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm 9-11.
- Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, … hoạt động ở
vùng pH trung tính 7-8
 Ngoài ra có thể phân làm 2 loại khác:

Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ
phomat. Renin làm biến đổi các casein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi
trường sữa có nồng độ Ca
2+
(sự đông tụ sữa chua).
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như: ở
các loài Eudothia parasitica và Mucor purillus.
b. Nguồn thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ
nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Caria papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ
dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng
của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của
protease thực vật này là trong công nghệ chế biến thịt nó làm mềm thịt và trong mục
tiêu tiêu hóa.
12
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Ngoài ra còn thu nhận ezyme Ficin tách từ dịch ép thân cây sung. Ezyme được
sử dụng để phân hủy protein tự nhiên.
Hình 1.4: mô hình phân tử enzyme papain
Hình 1.5: nguồn thu nhận ezyme Protease từ thực vật
c. Nguồn vi sinh vật
Hai nguồn nguyên liệu trên không để dùng làm nguyên liệu sản xuất công
nghiệp quy mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì dùng enzyme từ
vi sinh vật sẽ khắc phục được các hạn chế sau:
- Nguồn nguyên liệu vô hạn.
- Hệ enzyme phong phú.
- Hoạt tính mạnh.
- Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọ giống.
- Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh.

rộng 7 – 12.
Hình 1.7: Bacillus
• Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng Aspergillus oryzae, A. Terricola, A.
Fumigatus, Penicillium chysogenum, Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả ba
loại protease: acid, kiềm, trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid,
có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3.
Một số nấm mốc khác như: A. Candidatus, P. Cameberti, P. Roqueforti cũng
có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat
Hình 1.8: Nấm mốc
• Xạ khuẩn
15
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn nấm mốc.
Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao
như: Streptomyces grieus, S. Fradiae,
Hình 1.9: xạ khuẩn
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở
quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi
ích như sau:
- Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
- Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch
nhiều lần trong năm.
- Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng
sử dụng và tăng hiệu suất thu hồi).
- Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản
xuất.
Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây

Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước
tương theo phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc
này để sản xuất tương.
Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty
có nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu
xanh lợt có ít vàng.
Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi
sang màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia.
 Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae.
- Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế biến thức an
gia súc
- Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung
vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt…
- Cellulose: ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm môi
trường….
b. Vai trò của giống
Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đống vai trò quyết định đến:
Năng suất của nhà máy, chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme),
vốn đầu tư cho sản xuất, giá thành sản phẩm, có ý nghĩa to lớn trong phát triển công
nghệ vi sinh vật.
c. Yêu cầu của giống
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được
sản xuất theo qui mô công nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ
enzyme cần có những yêu cầu và mục đích nhất định. Giống vi sinh vật phải cho ra sản
18
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao.Vì trong quá
trình trao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ
thể mình trong khoảng thời gian ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất.

2
10, phospho, nitơ
hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu.
Với phương pháp này nồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm
sau khi đã tách tế bào vi sinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng
kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng
trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị,
dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mô gia đình. Nuôi cấy trong điều kiện
vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực
nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. Tuy nhiên, phương pháp bề mặt có năng
19
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không
đồng đều.
 Nuôi cấy chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với có chất chủ yếu trong đa
số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất
cacbon là đường glucoza, saccharoza. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được
vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng,
thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn của quá
trình nuôi cấy chìm một bước gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men
giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất. Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự
động hóa năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi
sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần
môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều
kiện vệ sinh vô trùng.Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên
khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không
bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn.
e. Nguyên liệu sản xuất

là tốt hơn cả. Các nguyên liệu đã
chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch
ép quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi
ngô. Khi lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa
sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.
f. Phương pháp phân lập
Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật. Ở
những nơi giàu chất hữu cơ, trong không khí, trong cơ thể động vật, thực vật….Chính
vì vậy mà vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất.
Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và điều kiện thực tế mà chọn cách phân lập phù hợp
nhất.Mỗi cách có những ưu điểm riêng .
 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt
đáng kể các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự
nhiên, được gọi là các chủng vi sinh vật hoang dại. Chúng đã quen với các điều kiện tự
nhiên, khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với điều kiện môi
trường cố định đòi hỏi các loài vi sinh vật cũng có thời gian thích nghi. Huấn luyện
chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều kiện rất cần thiết.
21
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều
kiện sản xuất. Nhờ đó sau khi phân lập các giống này không qua giai đoạn huấn luyện.
Các giống này đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những
đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.

4
0,1g
NH
4
NO
3
10g FeO
4
0,01g
KCL 0,5 Hồ tinh bột 20g pH=6,5
22
Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang
Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc mang đi bảo quản, dự
trữ. Để có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp bảo quản thích hợp.
j. Phương pháp bảo quản
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng đã
được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hoá sinh, vi sinh và cần đặc biệt lưu ý đến điều
kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra
các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra
lại các đặc tính ban đầu.
 Phương pháp cấy chuyền
Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi
trường thạch (thạch nghiêng, hợp petri…) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều
kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo
quản ở nhiệt độ lạnh 3 – 4 và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy
bào tử hoặc khuẩn lạc mà không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường
mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được).
Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên
giữ trong đất để khử trùng. Để kéo thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến một

C). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình
làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các
chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để
khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu
và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfo xide). Việc bảo quản theo
phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như: -20
0
C, -
30
0
C, -40
0
C, -70
0
C, -40
0
C và -196
0
C. Nói chung mức nhiệt cao hơn - 30
0
C cho hiệu
quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp
bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm
men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.
2.2. Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.2.1. Sơ đồ quy trình
24
Nhóm: 19
Môi trường
Asp.oryzae