1
2



Cùng với sự phát triển không ngừng về mọi mặt của xã hội, con người
đang phải đối mặt với nguy cơ xuất hiện bệnh tật ngày càng nhiều hơn. Một trong
những giải pháp hiện nay là xu hướng quay về với thiên nhiên, dùng những sản
phẩm có nguồn gốc tự nhiên hơn là tổng hợp bằng con đường nhân tạo, nhất là
hợp chất thiên nhiên từ các thực vật xung quanh chúng ta.
Trong vô số các loài thực vật đang tồn tại và phát triển, dâm bụt là một
trong những loại hoa được trồng làm cây cảnh và hàng rào khá phổ biến ở Việt
Nam. Bên cạnh ứng dụng làm hàng rào, cây cảnh, cây dâm bụt còn được biết đến
với nhiều ứng dụng chữa bệnh khác trong các bài thuốc dân gian. Theo Đông y,
lá dâm bụt có vị nhạt, nhớt, tính bình, có tác dụng làm dịu, an thần, tẩy nhẹ,
nhuận tràng, chữa viêm niêm mạc dạ dày, ruột, đại tiện ra máu, kiết lỵ, mụn nhọt,
ghẻ lở, mộng tinh, đới hạ. Hoa dâm bụt vị ngọt, tính bình có tác dụng thanh nhiệt
giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, sát trùng, chữa kinh nguyệt không đều, khó ngủ, hồi
hộp, đái đỏ. Vỏ rễ dâm bụt vị ngọt, tính bình, có tác dụng điều kinh, chống ho
tiêu viêm, chữa viêm tuyến mang tai, viêm kết mạc, viêm khí quản, viêm đường
tiết niệu, viêm cổ tử cung, bạch đới, kinh nguyệt không đều, mất kinh. Mặt khác,
theo nghiên cứu mới nhất, hoa dâm bụt có tác dụng hạn chế lượng cholesterol
trong máu và giảm nguy cơ bệnh thấp tim.
Chính bởi công dụng chữa bệnh của cây dâm bụt như trên, có rất nhiều đề
tài nghiên cứu đã tập trung xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
cây dâm bụt. Thế nhưng đa phần các đề tài đều tập trung vào hoa của cây dâm

MS), phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ liên hợp (LC–MS) nhằm phân tách và
xác định thành phần định tính và định lượng các hoạt chất chính trong các dịch
chiết.
- Phương pháp ngâm chiết mẫu.

5.1. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp những thông tin khoa học ban đầu về thành phần hóa học có
trong lá dâm bụt ở Thừa Thiên - Huế . 4

- Cung cấp những thông tin, tư liệu làm cơ sở cho việc nghiên cứu sau
này.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Giải thích một cách khoa học một số cách chữa bệnh trong dân gian bằng
cách sử dụng lá dâm bụt.
- Nhằm giúp cho việc ứng dụng lá dâm bụt ở phạm vi rộng một cách khoa
học hơn.
- Tổng hợp kiến thức về hợp chất thiên nhiên để giảng dạy bộ môn hóa
trong nhà trường được tốt hơn.

Luận văn gồm 69 trang. Trong đó:
Mở đầu: 3 trang
Tổng quan: 7 trang
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: 14 trang
Kết quả và thảo luận: 25 trang
Kết luận và kiến nghị: 2 trang
Tài liệu tham khảo: 3 trang
Phụ lục: 15 trang.
Hình 1.1. Loài Hibiscus rosa-sinensis
Malaysia)
Hình 1.2. Loài Hibiscus syriacus
) 6

Trong khu vực ôn đới, loài được trồng làm cảnh nhiều nhất có lẽ là
Hibiscus syriacus. Tại khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, Hibiscus rosa-sinensis
với nhiều giống lai có hoa sặc sỡ, là loại cây cảnh phổ biến [1, 3].
Trong chi dâm bụt có 200-220 loài đã được biết, các loài được đặt tên theo
đặc điểm riêng của chúng.
+ Phân loại theo đặc điểm của hoa:
 Hibiscus brackenridgei - dâm bụt hoa vàng, dâm bụt Hawaii
 Hibiscus hamabo - dâm bụt hoa vàng Nhật Bản
 Hibiscus tiliaceus - dâm bụt hoa vàng, hoàng cận, dâm bụt Hawaii
 Hibiscus clayi - dâm bụt Hawaii ( hoa đỏ)
 Hibiscus kokio - dâm bụt Hawaii (koki'o 'ula), dâm bụt hoa đỏ
 Hibiscus schizopetalus - dâm bụt hoa đỏ cánh nhỏ
+ Phân loại theo đặc điểm của lá
 Hibiscus dasycalyx - dâm bụt lá hẹp
 Hibiscus macrophyllus- dâm bụt lá to, đại diệp mộc cận.
 Hibiscus laevis hay Hibiscus militaris - dâm bụt lá kích
 Hibiscus acetosella - phù dung lá đỏ, phù dung châu Phi


 8 Phân loại khoa học
Giới : Thực vật ( Plantae)
Nghành : Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp : Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Bộ : Bông (Malvales)
Họ : Bông (Malvaceace)
Chi : Dâm bụt (Hibiscus L.)
Loài : Cây dâm bụt (Hibiscus rosa sinensis L.) [1,3]
Dâm bụt là loài cây thân gỗ, sống lâu năm, cây nhỏ, chiều cao trung bình
1,5- 2 m. Lá dâm bụt có hình bầu dục, nhọn đầu, tròn gốc, mép có răng to. Hoa ở
nách lá, lưỡng tính, khá lớn, 6-7 mảnh đài nhỏ (tiểu đài), hình sợi; đài hợp màu
lục dài gấp 2- 3 lần đài nhỏ; tràng 5 cánh hoa màu đỏ; nhị nhiều, tập hợp trên 1
trụ đài; bầu hình trụ hay hình nón, mùa hoa chủ yếu vào tháng 5-7.
Dâm bụt là 1 cây cảnh và cây hàng rào phổ biến nước ta và nhiều nước
nhiệt đới khác. Dâm bụt có nhiều loại:
+ Dâm bụt thường có dáng hoa cong, cánh hoa có răng cưa
+ Dâm bụt kép với hoa thẳng, nhiều cánh hoa
+ Dâm bụt xẻ hoa buông thõng, cánh hoa xe thùng và răng không đều.
+ Dâm bụt hoa nhỏ, hoa mọc rủ, cánh hoa nguyên không bao giờ nở xòe.


thành động mạch thêm vững chắc (Science of Food and Agrriculture). Đây là
nghiên cứu đầu tiên cho thấy hiệu quả kỳ diệu của hoa dâm bụt. Các nhà khoa
học còn cho biết tác dụng chữa bệnh của hoa dâm bụt được nâng cao hơn nữa
nếu kết hợp với rượu vang đỏ và chè để làm giảm lượng cholesterol và lipid 10

trong máu. Như vậy cây dâm bụt vừa là cây cảnh đẹp vừa là cây thuốc quý, là
nguồn gen quý của nước ta.

Theo nghiên cứu của Shivananda Nayak và đồng nghiệp, loài dâm bụt
Hibiscus rosa sinensis có tác dụng thúc đẩy quá trình làm lành vết thương ở
chuột. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, dịch chiết của Hibiscus rosa sinensis L với
ethanol khi được hòa vào nước uống (120 mg/kg - 1 ngày) có tác dụng làm lành
vết thương trên nhóm chuột được thí nghiệm. Quá trình làm lành vết thương
được đánh giá bằng tỉ lệ co vết thương, độ bền kéo (tensile strength), trọng lượng
các mô hạt của vết thương. Kết quả, diện tích của vết thương giảm 86% trong khi
nhóm động vật chỉ cho uống nước giảm 75% . Độ bền kéo, trọng lượng khô và
ướt của mô hạt tăng lên đáng kể. Đồng thời, dịch chiết còn có tác dụng ức chế
hoạt động của các vi sinh vật gây nhiễm trùng vết thương [20].
Theo nghiên cứu của Khan Mohammed Junaid, Ajazuddin , Vyas Amber,
Singh Manju và Singh Deependra, dịch chiết của loài dâm bụt Hibiscus rosa
sinensis có ảnh hưởng đến sự lo lắng và vận động ở chuột. Cụ thể, dịch chiết của
loài dâm bụt này với rượu và chloroform có tác dụng làm giảm đáng kể hành vi
chạy nhảy của chuột khi bị hoảng loạn. Dịch chiết với ethanol cho kết quả tốt
hơn so với dịch chiết từ chloroform. Cả hai dịch chiết đã cho thấy không có sự
gia tăng đáng kể trong tiểu tiện và đại tiện của chuột [15].

`Theo nghiên cứu của A A Osuntoki, T A Oyede và A A Otunba, dịch

thư biểu mô mũi họng [12]. Dịch chiết từ loài Hibiscus esculentus giúp cải thiện
nếp nhăn bằng cách co cơ ức chế và loại bỏ các gốc oxy tự do [11]. Dịch chiết từ
dâm bụt giàu polyphenol có khả năng tiêu diệt tám loại dòng tế bào ung thư biểu
mô, hiệu quả nhất là ung thư biểu mô dạ dày của [16]. Mặt khác, protocatechuic
( một hợp chất phenolic acid), phân lập từ hoa khô của Hibiscus sabdariffa là một
chất chống oxy hóa, ức chế hoạt động khối u và cũng có hiệu quả chống lại bệnh
bạch cầu của con người [17].
Như vậy, hoạt tính dược lý của cây dâm bụt đã được nghiên cứu nhiều.
Tuy nhiên các công trình về thành phần hóa học của cây dâm bụt hầu như vẫn
còn rất ít. 12

. 



2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là lá dâm bụt thường lấy từ huyện Hương Thủy,
tỉnh Thừa Thiên – Huế vào tháng 8 năm 2011. Cây dâm bụt được chọn lấy lá cao
khoảng 1,5 m, có nhiều lá và hoa. Lá dâm bụt có hình bầu dục, nhọn đầu, mép có
răng to, mặt lá trơn bóng, mặt trên đậm hơn mặt dưới và không bị sâu. Cuống lá
hình trụ, màu xanh lục, có nhiều lông đa bào hình sao. Hoa có màu đỏ đậm, có
nhiều nhị.
.


2.1.2. Xử lí nguyên liệu
Lá dâm bụt sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, để ráo nước, phơi khô

C, giữ ở 0 phút, sau đó tăng lên 290
o
C với tốc độ gia nhiệt 10
o
C/phút, giữ ở
nhiệt độ này trong 20 phút. Điều kiện khối phổ : nguồn ion hoá (EI), năng lượng 14

ion hoá (70eV), nhiệt độ MS source (230
o
C), nhiệt độ MS Quad (150
o
C), nhiệt
độ giao diện sắc ký khí với detector khối phổ (280
o
C), chế độ quét Fullscan (
Thời gian trễ 0-3 phút; thời gian quét: 3-50 phút, khoảng khối quét: 35-600amu).
- Các dụng cụ thủy tinh dùng trong quá tình thí nghiệm gồm có: bình tam
giác 100 mL, 250 mL, cốc thủy tinh loại 100 mL, loại 250 mL, pipet, đũa thủy
tinh, lọ đựng mẫu, giá thí nghiệm, bình đựng mức 10 mL, 10 mL, nhãn hóa chất.
2.1.3.2. Hóa chất
Các dung môi: n–hexane, ethyl acetate, methanol, nước cất
Hóa chất vô cơ: dung dịch H
2
SO
4
98%, HNO
3

bay hơi. Cần chú ý rằng trong quá trình nung sẽ mất một số nguyên tố do bay hơi
như các halogen, thủy ngân, lưu huỳnh…Cũng có thể chỉ cần đốt cháy các chất
hữu cơ trong bình kín, dưới áp suất cao hoặc khi phân hủy bằng cách nung chảy
như đối với các chất vô cơ nhưng phải thêm chất oxi hóa: HNO
3
, H
2
O
2
.
Ưu điểm: - Không tốn dung môi.
- Tốn ít thời gian hơn so với phương pháp ướt. 15

Hạn chế: - Ở nhiệt độ cao nhiều chất bay hơi, ví dụ ở 500
0
C lượng Pb, Cd bay
hơi xấp xỉ 20% dẫn đến sai số kết quả lớn.
* Xử lý theo phương pháp ướt
Cách này rất ít được dùng vì không thuận tiên, nó chỉ dùng khi không
dùng phương pháp xủ lí khô được. Ta đưa mẫu về dạng dung dịch bằng các dung
môi như: H
2
SO
4
đặc, hỗn hợp H
2
SO

C trong
thời gian từ 4 đến 6 tiếng đến khi khối lượng chén và mẫu không đổi để xác định
độ ẩm.
2.2.3. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu
Để xác định hàm lượng tro trong mẫu thực vật người ta dùng phương pháp
tro hóa mẫu [5]. 16

Trong đề tài này tôi dùng phương pháp tro hóa mẫu bằng phương pháp
khô ướt kết hợp. Mẫu xử lí sơ bộ, có thể phân hủy các chất hữu cơ bằng H
2
SO
4
,
HNO
3
… Sau đó được nung ở 500 – 550
o
C trong chén thạch anh hay platin, các
chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi.
2.2.4. Xác định hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp
thụ nguyên tử (AAS)
 Nguyên tắc phép đo AAS
Phương pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một
nguyên tố được gọi là phép đo phổ hấp thụ nguyên tử ( phép đo AAS). Cơ sở lý
thuyết của phép đo này là sự hấp thụ năng lượng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử
tự do ở trạng thái hơi (khí) khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố
ấy trong môi trường hấp thụ [7, 8].Vì thế muốn thực hiện được phép đo quang

nguyên tố cần phân tích. Chùm tia phát xạ phải có cường độ ổn định, lặp lại được
nhiều lần đo khác nhau trong cùng một điều kiện và phải điều chỉnh được để có
cường độ cần thiết cho mỗi phép đo
- Phải tạo ra được chùm tia phát xạ thuần khiết, chỉ bao gồm một số vạch
nhạy của nguyên tố cần phân tích, phổ nền của nó không đáng kể
- Phải có cường độ cao nhưng bền với thời gian.
* Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích
Bộ phận nguyên tử hóa mẫu chuyển mẫu cần phân tích từ trạng thái ban
đầu thành dạng hơi của nguyên tử tự do dưới tác dụng của nhiệt độ. Đám hơi của
các nguyên tử tự do này chính là môi trường hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp
thụ nguyên tử.
* Hệ quang và detecter
Hệ thống trang thiết bị để thu, phân li chọn lọc một số vạch thích hợp của
nguyên tố cần phân tích và ghi nhớ lại nó.
* Bộ phận xử lí kết quả
Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử cho phép điều khiển hai chế độ. Một là
điều khiển trực tiếp bằng cách xử dụng bàn phím gắn trên máy tính. Hai là điều
khiển thông qua phần mềm được cài đặt trong máy vi tính kết nối với máy AAS.
 Những ưu điểm và nhược điểm của phép đo AAS 18

* Ưu điểm
- Độ nhạy và độ chọn lọc cao. Gần 60 nguyên tố hóa học có thể xác định
bằng phương pháp này với độ nhạy từ 1.10
-4
đến 10
-5
. Phương pháp nà áp dụng

2.4.1. Phương pháp sắc ký khí (GC)
Sắc ký khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay để
tách, định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong
nghiên cứu các hợp chất hữu cơ [7, 8].
Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải được hóa hơi
để đưa vào cột sắc ký, thường hóa hơi dưới 250
0
C. Pha tĩnh có thể là chất rắn
được nhồi vào cột hay một màng film mỏng bám lên trên bề mặt chất mang trơ,
hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong của thành cột (cột mao
quản).
Sắc ký khí được dùng để chia tách các hỗn hợp của hóa chất ra các phần
riêng lẻ, mỗi phần có một giá trị riêng biệt. Trong sắc ký khí (GC) chia tách xuất
hiện khi mẫu bơm vào pha động, pha động là một khí trơ. Pha động mang hỗn
hợp mẫu đi qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là các hóa chất, hóa chất này có
độ nhạy và hấp thụ thành phần hỗn hợp trong mẫu.
Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh, mỗi hợp chất
trong hỗn hợp tương tác với một tỷ lệ khác nhau, hợp chất tương tác nhanh sẽ
thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau. Đó là đặc
trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh, hơn nữa quá trình chia tách có thể xảy ra
bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động.
Trong khi các thiết bị chạy, máy sẽ đưa ra các biểu đồ, được gọi là sắc ký
đồ. Mỗi peak trong sắc ký đồ mô tả một tín hiệu tạo nên khi chất giải hấp từ cột
sắc ký và đi vào đầu dò detector, trục hoành biểu diễn thời gian lưu và trục tung
biểu diễn cường độ của tín hiệu.
2.4.2. Phương pháp khối phổ (MS)
Khối phổ được dùng để xác định một chất hóa học dựa trên cấu trúc của
nó [7, 8]. Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có
dòng điện ion hóa (mass spectrometry). Khi đó, chúng sẽ tấn công vào các luồng,
do đó chúng bị vỡ thành những mảnh vụn, những mảnh vụn này có thể lớn hoặc

nghành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất
phức tạp như không khí, nước…Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối
phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu
vân tay). Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các
chất đã biết. Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên
cứu, có thể dựa trên cấu trúc mới tìm được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc
hóa học. Nói cách khác, nhà nghiên cứu thu được 1 dữ liệu mới và có thể đóng
góp vào thư viện cấu trúc nói trên, sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác
định chính xác loại hợp chất mới này.
Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà
nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các hợp chất hữu cơ, tách chiết và
bơm vào máy để nhận dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên cứu cũng xác định
nồng độ của mỗi thành phần hóa chất.
2.5           ký  
-MS)
2.5.1. Phương pháp sắc ký lỏng
- Pha động ở trạng thái lỏng có thể là hợp chất hữu cơ hoặc là hỗn hợp hợp
chất hữu cơ với nước.
- Pha tĩnh thường là các hạt nhỏ hoặc màng mỏng lỏng bám đều lên bề
mặt của chất mang trơ.
- Phân loại: có hai loại
+ Sắc ký lỏng áp suất thường.
+ Sắc ký lỏng áp suất cao (sắc ký lỏng cao áp ).
- Trước đây chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng áp suất thường, tuy thiết bị rẻ
nhưng hiệu suất tách thấp, rất tốn dung môi để rửa giải, nên hiện nay dùng
HPLC.
- Kỹ thuật:
23
Hình 2.4
2.6. T
2.6.1. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện theo phương pháp
pha loãng nồng độ của Hadacek F. và Greger H [14], tiến hành trên phiến vi
lượng 96 giếng theo hai bước.
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm dịch chiết và các chất có hoạt tính.
Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất và của dịch chiết có
hoạt tính.
Chất đối chứng bao gồm: Ampixilin đối với vi khuẩn [Gram (+)].
Tetraxilin đối với vi khuẩn [Gram (–)], Nystasin đối với nấm sợi.
Các chủng vi sinh vật được chọn để thử gồm các vi khuẩn [Gram (–)],
Escherichia coli (E.C.) và Pseudomonas aeruginosa (P.A.).
E.C. thuộc nhóm trực khuẩn Gram (–) thường sống ở đường ruột và gây
một số bệnh ở người như tiêu chảy, viêm ruột thừa. P.A. là trực trùng mủ xanh
thường gây mủ nhiễm trùng, có thể gây sốt, viêm mủ thận, tiêu chảy, khó điều trị.
Các chủng vi sinh vật [Gram(+)] bao gồm: Bacillus subtilis (B.S.),
Staphylococcus aureus (S.A.), Candida albicans (C.A.). 24

Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng Saboraud
dextros broth và Trypcase soya broth (TSB). Các chủng kiểm định được hoạt hóa
trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối
với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm).


50) sẽ được thử nghiệm bước 2 để
tìm giá trị SC
50
.
Giá trị SC
50
(g/ml)
Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC
50
được xác định bằng
chương trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử
mà ở đó 50 % các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa chất thử. 25

 Phương pháp thử hoạt tính peroxydaza
Nguyên liệu: Máu tươi được chống đông bằng ADC (Adenine dextrose
citrate), pha loãng 10 – 20 lần bằng nước cất. Chia thành các ống nhỏ 0,5 – 1 ml.
Dùng cho thí nghiệm cất trong tủ lạnh – 80
o
C. Khi dùng pha loãng thêm 25 – 50
lần bằng RB. H
2
O
2
(0,2N hay 2%).
Indigo: chuẩn bị dung dịch stock – 80
o