ĐẶC TÍNH MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN GÂY BỆNH
Trong phòng thí nghiệm y tế, để phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh cần phải sử
dụng đến nhiều loại môi trường nuôi cấy và hoá chất thích hợp cho một số thử nghiệm, đặc biệt
là thử nghiệm sinh hoá. Bên cạnh đó, việc đánh giá chất lượng pha chế môi trường đúng quy
cách cũng là một trong những khâu quan trọng trong công tác xét nghiệm vi khuẩn.
Cho đến nay, có nhiều loại môi trường khác nhau được dùng cho phân lập và định danh
vi khuẩn, và thường được xếp thành 3 loại chủ yếu là: môi trường nuôi cấy cơ bản, môi trường
tăng sinh vi khuẩn (có giầu chất dinh dưỡng) và môi trường nuôi cấy chọn lọc. Mỗi loại môi
trường sẽ được sử dụng với những mục đích khác nhau trong nuôi cấy, phân lập và định danh vi
sinh vật có trong mẫu xét nghiệm của bệnh nhân.
1. MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÔNG THƯỜNG
1.1. Môi trường Chocolate agar
Môi trường thạch chocolate là môi trường giầu dinh dưỡng và thường được dùng cho vi
khuẩn
Haemophilus, S.pneumoniae
và các loài vi khuẩn khó phát triển khác. Đây là môi trường
thạch máu cừu, khi thêm máu cừu vào môi trường cơ bản trong điều kiện nhiệt độ đủ để giải
phóng tế bào hồng cầu và nicotinamid - adenin dinucleotid (NAD). Môi trường đổ đĩa được bảo
quản ở 4
0
C. Đĩa môi trường đã cấy bệnh phẩm được ủ ấm ở nhiệt độ 35
0
C trong khí trường có
5% CO2, thời gian 18 – 24 giờ, quan sát sự phát triển của vi khuẩn.
1.2. Môi trường Simmons citrate
Môi trường thạch Cimmons citrate được sử dụng cho các trực khuẩn đường ruột gram
âm khác nhau. Giống như nguyên lý sử dụng môi trường acetat của vi khuẩn, để phân biệt các
loại vi khuẩn người ta dựa vào sự khác biệt do khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon
duy nhất của chủng phân lập. Môi trường có pH khoảng 6,9. Ống môi trường sau khi cấy huyền
dịch vi khuẩn lên mặt nghiêng, để tủ ấm 35
o

- Kiềm (màu đỏ) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng môi trường, khi đó cho thấy vi
sinh vật không thể lên men đường glucose và đường lactose. Các sản phẩm sinh ra
không phải là sản phẩm acid.
Nếu sinh hơi, có hơi ở phần gốc của ống môi trường, môi trường bị chia cắt hoặc đẩy
môi trường lên khỏi đáy ống. Nếu thấy màu đen ở phần gốc ống, vi sinh vật đã sinh ra hydrogen
sulfid gas từ thiosulfid. Phản ứng được đọc sau khi nuôi cấy từ 18 – 24 giờ, nếu môi trường được
đọc quá sớm, vi sinh vật chỉ có thể lên men đường glucose. Nếu đọc qua muộn, các chất gây
men lactose có thể dùng hết lactose và bắt đầu dị hoá pepton, phần nghiêng của môi trường trở
lại màu đỏ.
1.5. Môi trường MacConkey Agar
Thạch MacConkey là môi trường chọn lọc cho các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột và
các trực khuẩn gram âm khác có trong một quần thể hỗn tạp và phân biệt chúng có lên men lactose
hay không lên men lactose. Muối mật và tinh thể màu tím ức chế hầu hết các vi sinh vật gram
dương nhưng cho phép các trực khuẩn gram âm mọc được. Đường lactose như một nguồn cung
cấp carbohydrat duy nhất. Trực khuẩn gram âm, nếu lên men lactose sẽ sinh ra khuẩn lạc màu
hồng hoặc đỏ. Ngược lại, nếu không lên men lactose thì khuẩn lạc không có màu hoặc khuẩn lạc có
màu trong.
Sau khi đã cấy vi khuẩn lên đĩa môi phân lập, đặt vào tủ ấm 35
0
C, thời gian từ 18 – 24
giờ. Vi khuẩn có thể lên men lactose mạnh hoặc yếu, sau 24 giờ nuôi cấy sinh ra những khuẩn
lạc có màu hoặc xuất hiện màu hồng nhẹ sau 24 – 48 giờ. Không nuôi cấy kéo dài quá 48 giờ,
như thế có thể làm đảo lộn kết quả.
Thạch MacConkey Sorbitol, có chứa các thành phần giống như thạch MacConkey thông
thường khác nhưng có thêm D-sorbitol. Môi trường này được dùng cho phân lập E.coli O157:H7.
1.6. Môi trường Mueller-Hinton Agar
Môi trường thạch Mueller-Hinton Agar là môi trường trong, dùng cho thử nghiệm tính
nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh. Môi trường cũng thường được dùng để thử nghiệm sự
thuỷ phân tinh bột. Thạch Mueller-Hinton có chứa hỗn dịch động vật, casamino acid và tinh bột
giúp cho hầu hết các vi sinh vật phát triển. Hơn nữa, có thể cho thêm máu cừu vào công thức cơ

Pseudomonas, Acinetobacter spp
.
Môi trường có chứa một lượng nhỏ pepton để ngăn cản sự tạo thành sản phẩm kiềm, vì
các sản phẩm này có thể trung hoà một lượng nhỏ sản phẩm acid qua quá trình oxy hoá. Lượng
lớn carbonhydrat trong môi trường đã làm tăng số lượng acid mà nó có thể tạo thành. Môi trường
cũng có lượng nhỏ thạch để tạo cho môi trường không rắn cũng không lỏng, tạo điều kiện cho
phép acid tạo thành trên bề mặt và khuếch tán qua môi trường. Màu xanh bromthymol như chỉ thị
màu pH để phát hiện acid.
1.9. Môi trường thử nghiệm tính di động
Mục đích của môi trường thử tính di động là để xác định một vi khuẩn có thể di động
được hay không. Đây là thử nghiệm đặc biệt dùng cho định danh các thành viên của họ vi khuẩn
đường ruột, thường cho 2 loại
Shigella
và
Klebsiella
luôn không di động, và các loài Yersinia chắc
chắn di động ở nhiệt độ phòng nhưng không di động ở 35
0
C.
Các vi khuẩn không di động là do không có lông roi, chỉ phát triển ở trong đường cấy và
xung quanh môi trường trong. Các vi sinh vật di động, đã sử dụng lông roi để di chuyển ra ngoài
của đường cấy và xuất hiện mờ khói trong môi trường. Lượng thạch trong môi trường thấp làm
cho môi trường không lỏng, không cứng để cho phép phát hiện di động tốt nhất.
Dùng đầu que cấy chọc thẳng vào môi trường, thận trong di chuyển đầu que cấy trên 1
đường, không chọc que cấy xuông tận đáy tupe. Ủ môi trường nuôi cấy ở 35
0
C. Bản chất lông roi
là protein, do vậy không tạo thành tốt ở nhiệt độ cao, một số nhà sinh vật học thích ủ ở nhiệt độ
từ 18 – 20
0

và
V. alginolyticus
sinh ra các khuẩn lạc màu vàng, vì chúng lên men đường sucrose,
ngược lại
V. parahaemolyticus
và
V.vulniticus
luôn sinh ra khuẩn lạc màu xanh do thiếu lên men
sucrose. Vi sinh vật Vibrio không sinh ra hydrogen sulfid.
Khi dùng thạch TCBS, chúng ta nên dùng chất nuôi cấy đặc, những loài Vibrio dễ chết
đột ngột và môi trường này có để ngăn chặn được điều đó. Mẫu xét nghiệm tươi là tốt nhất, vì vi
sinh vật này nhạy cảm với điều kiện khô, ánh sáng và pH acid. Nếu xử lý chậm thì nên sử dụng
môi trường Cary-Blair để vận chuyển bệnh phẩm tốt hơn là môi trường vận chuyển có đệm
glycerol. Đĩa môi trường nuôi cấy nên ủ ở nhiệt độ 35
0
C, thời gian từ 18 – 24 giờ, dài nhất là 48
giờ. Không lấy khuẩn lạc ở môi trường TCBS để làm thử nghiệm oxydase.
1.12. Môi trường Esculin Agar
Môi trường thạch esculin là môi trường phân biệt khả năng thủy phân esculin của vi
khuẩn. Những sản phẩm thuỷ phân từ phản ứng esculin với muối sắt có trong môi trường gây ra
kết tủa các thành phần iron, và sản phẩm của sự kết tủa đó làm đổi màu của môi trường từ màu
xám tới màu đen. Cấy vi khuẩn lên phần nghiêng của môi trường, ủ ở 35
0
C trong điều kiện hiếu
khí và quan sát sự phát triển, môi trường có màu đen cho thấy có sự thủy phân esculin.
1.13. Môi trường Methyl Red-Voges-Proskauer (MR-VP)
Môi trường canh thang MRVP dùng cho các thử nghiệm đỏ methyl và Voges-Proskauer.
Quy trình này dùng để phân biệt các thành viên thuộc họ
Enterobacteriaceae
(họ vi khuẩn

khuẩn
Staphylococcus aureus
có khả năng lên men đường mannitol, sinh ra sản phẩm acid làm
pH của môi trường giảm, phenol từ màu đỏ chuyển sang màu vàng, khuẩn lạc điển hình của
Staphylococcus aureus
xuất hiện màu vàng. Những loài
Staphylococcus
và
Micrococcus
khác
thường không lên men đường mannitol, do đó sinh ra khuẩn lạc màu hơi đỏ.
Sau khi cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường, ủ ấm 35
0
C trong khí trường không có CO2, thời
gian 24 – 48 giờ. Một số chủng
Staphylococcus aureus
có thể lên men đường mannitol chậm, do
vậy không nên loại bỏ môi trường đã nuôi cấy trong vòng 48 giờ. Các chủng nghĩ đến là
S.aureus
cần được làm thêm các thử nghiệm như coagulase hoặc bằng một thường quy chuẩn
khác.
1.16. Môi trường Selenite F
Canh thang Selenite F là môi trường tăng sinh cho số ít thành viên của
Salmonella
và một
vài chủng
Shigella
từ phân và mẫu xét nghiệm chứa số lượng lớn vi sinh vật ô hợp. Môi trường có
Selenite natri đã ức chế rất nhiều trực khuẩn gram âm và cầu khuẩn đường ruột (
Enterococci

Canh thang Peptone-Yeast Extract-Glucose là môi trường được dùng cho nuôi cấy vi
khuẩn. Có thể dùng thường quy ghi sắc ký lỏng để phát hiện các sản phẩm chuyển hoá cuối
cùng trong canh cấy PYG phân lập vi khuẩn kỵ khí. Canh thang PYG có chưa một số chất dinh
dưỡng và thành phần bổ sung để kích thích vi khuẩn kỵ khí phát triển. Thành phần dinh dưỡng
gồm vitamin K (cho sinh sắc tố
Prevotella
và
Porphyromonas
), cao men, hemin và glucose. Chất
Resazurin đáp ứng như chất chỉ thị vi khuẩn kỵ khí. Khi môi trường xuất hiện màu hồng nghĩa là
có hiện diện của oxy.
1.19. Môi trường Lowenstein-Jensen (LJ)
Môi trường Lowenstein-Jensen được dùng để nuôi cấy
Mycobacterium
spp. Trong môi
trường hầu hết có chứa thành phần có thể ức chế sự phát triển của
Mycobacteria
. Bột khoai tây,
trứng và glycerol có trong môi trường LJ có tác dụng giúp khử độc môi trường này, đồng thời
cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn này phát triển. Môi trường LJ đảm bảo tốt trong 1 tháng
nếu vặn chặt nắp, để nơi khô ráo và nhiệt độ từ 4 – 6
0
C. Môi trường LJ cũng phải được giữ ở nơi
tối, vì xanh malachite rất nhạy với ánh sáng. Bệnh phẩm đã được nuôi cấy lên môi trường, ủ ấm
trong khí trường CO2 (5 – 10%), từ 6 – 10 tuần. Một điều quan trọng là phải nới lỏng nắp để cho
thay đổi không khí bên trong.
2. CÁC THỬ NGHIỆM TRÊN MÔI TRƯỜNG THÔNG THƯỜNG
Môi trường nuôi cấy có thể được chuẩn bị từ những thành phần riêng hoặc chuẩn bị từ
môi trường dưới dạng bột khô đã được thương mại hoá. Ngày nay, môi trường dạng bột khô
được thương mại hoá đã trở lên phổ biến tại các phòng thí nghiệm vi khuẩn lâm sàng. Một số

crystal violet
24h
E.coli
Khuẩn lạc có màu đỏ
P.mirabilis
Khuẩn lạc không màu
E.faecalis
Không phát triển
Methyl red/Voges-
Proskauer
48h
E.coli
(+)/(-)
K.pneumoniae
(-)/(+)
Mueller-Hinton
Agar
24h
E.coli
ATCC 25922 Độ lớn của vòng vô khuẩn
P.aeruginosa
ATCC 27853 Độ lớn của vòng vô khuẩn
Peptone water
(indole)
24h
E.coli
(+)
K.pneumoniae
(-)
Thạch Simmons

S. aureus
+ Tạo thành vón cục sau 4 gìơ
Indole
E. coli
+ Vòng màu đỏ trên bề mặt
E. aerogenes
– Vòng màu vàng trên bề mặt
Methyl red
E. coli
+ Lập tức có màu đỏ
E aerogenes
– Không đổi màu
Oxidase
P.aeruginosa
+ Màu tím trong vòng 20 giây
E. coli
– Không màu trong vòng 20 giây
Voges
E. aerogenes
+ Màu đỏ
Proskauer
E. coli
– Không đổi màu
Đĩa kháng sinh Bacitracin
Streptococcus group A
+ Có vòng ức chế
E. faecalis
– Có vòng ức chế
Đĩa kháng sinh Optochin
S. pneumoniae