§Ò tμi:

§¸nh gi¸ hiÖu qu¶ t¸ch chiÕt AND cña vi khuÈn trùc tiÕp
tõ ph©n Chñ nhiÖm ®Ò tμi: TS. NguyÔn Vò Trung

1
Đặt vấn đề

Tiêu chảy là một trong những vấn đề quan trọng về sức khỏe, đặc biệt đối
với trẻ em trên toàn thế giới. Tiêu chảy chiếm vị trí thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ
em dới 5 tuổi do mắc các bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đờng hô
hấp). Tiêu chảy còn là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dỡng, ảnh hởng
đến sự tăng trởng của trẻ. ớc tính mỗi năm có khoảng 4 -10 triệu trờng hợp
tử vong do tiêu chảy, trong đó phần lớn là trẻ dới 5 tuổi. Số trẻ em bị bệnh tiêu
chảy chiếm khoảng 22% tổng số trẻ em nằm viện [2]. Từ khi thành lập Chơng

vậy, chúng tôi tiến hành đề tài "Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN của vi
khuẩn trực tiếp từ phân" với 2 mục tiêu sau:
1. Phát triển qui trình tách chiết ADN của E. coli gây tiêu chảy trực tiếp từ
phân.
2. Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN trực tiếp từ phân.
3
CHƯƠNG I
Tổng quan
1.1. Tình hình bệnh tiêu chảy
1.1.1. Trên thế giới
Tiêu chảy có tỷ lệ mắc và tử vong đứng hàng thứ hai sau nhiễm khuẩn
đờng hô hấp cấp tính ở trẻ em. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, hằng năm, trên thế

E. coli sống ở đại tràng của ngời và nhiều động vật khác nhau. Vi khuẩn
theo phân ra ngoài và hiện diện trong đất, nớc và không khí. Tuy nhiên, một số
chủng E. coli có những yếu tố độc lực đặc biệt giúp chúng có khả năng gây các
bệnh lý khác nhau. Vào những năm 40 của thế kỉ trớc, ngời ta xác định đợc
khả năng nhiễm trùng đờng tiêu hoá, gây tiêu chảy của E. coli [2].
Dựa trên đặc điểm lâm sàng của bệnh tiêu chảy, dịch tễ học, typ huyết
thanh và sự có mặt của các yếu tố độc lực, DEC đợc chia làm 5 nhóm chính:
1.3.1. EPEC
Chủng E. coli gây bệnh đờng ruột loại này đợc phát hiện vào năm
1948 bởi Bray và Giles [28].
* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh
- EPEC gây tổn thơng mô học dạng bám và gây thoái hoá (A/E). Sự bám
của vi khuẩn vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột làm thoái hoá các vi nhung
mao, tác động gây rối loạn quá trình hấp thu nớc và điện giải.
- Cơ chế gây tiêu chảy:
+ Tác động của EPEC trên niêm mạc ruột dẫn đến đứt gãy các sợi actin
trong lõi của vi nhung mao. Các vi nhung mao của các tế bào biểu mô bị thoái
hoá, mất diềm bàn chải, gây kém hấp thu ở lòng ruột.
+ Mặt khác, khi nồng độ Ca
++
trong tế bào tăng sẽ ức chế quá trình hấp
thu ion Na
+
và kích thích quá trình bài tiết Cl
-
.
+ Sự thay đổi trong cơ chế vận chuyển của các ion trong tế bào, và do đáp
ứng với các phản ứng làm giảm khả năng vận chuyển màng, đã dẫn đến tăng
tính thấm của tế bào biểu mô ruột [28].


chứa một số các gen mxi, spa mã hoá cho những protein cần thiết cho quá trình
gây bệnh gồm Ipa A, Ipa B, Ipa C và Ipa D.

6
- Cơ chế gây bệnh: EIEC xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, làm
tiêu huỷ các hạt vùi trong không bào, nhân lên trong nguyên tơng và chúng
xâm lấn sang các tế bào biểu mô kế cận. Kết quả, tại niêm mạc đại tràng xảy ra
phản ứng viêm, gây nên các tổn thơng khu trú và có thể còn dẫn đến những tổn
thơng dạng loét.
* Bệnh cảnh lâm sàng
- Thời gian ủ bệnh ngắn từ 10 - 18 giờ (quan sát trên những ngời tình
nguyện và các vụ dịch) [28].
- Vi khuẩn xâm lấn niêm mạc ruột gây triệu chứng giống hội chứng lỵ,
phân ít thờng lẫn nhầy và máu.
- ở những bệnh nhân nhiễm chủng EIEC sinh độc tố ruột, bệnh cảnh lâm
sàng chỉ biểu hiện đơn thuần của một tiêu chảy phân nớc.
1.3.4. EHEC
* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh.
EHEC gây bệnh qua 2 cơ chế chính là: Gây tổn thơng mô bệnh học
giống EPEC và sinh độc tố ruột.
- Cơ chế sinh độc tố ruột:
+ Các chủng EHEC tiết ra các độc tố có tác dụng gây độc tế bào Vero
nên còn đợc gọi là Verotoxin. Mặt khác, nó tơng tự nh độc tố Shiga nên còn
có tên khác là Shiga-like-toxin, ký hiệu Stx.
+ Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một
ngoại độc tố, có các gen mã hoá nằm trên nhiễm sắc thể. Có hai loại Stx: Stx1
và Stx2 [29].

- Cơ chế gây bệnh:
+ Cơ chế gây tiêu chảy: Sau khi gắn vào tế bào, độc tố ruột của EHEC đi

- Phơng pháp miễn dịch (cho EHEC, EIEC, ETEC, EPEC)
- Mẫu dò ADN: Thờng sử dụng đoạn nucleotide pCVD432 trên plasmid
pAA (cho EAEC); Stx1,2 (cho EHEC), gen ial, ipaH (cho EIEC) [43].
- Kỹ thuật PCR: Thiết kế đoạn mồi nhằm khuyếch đại đoạn nucleotide
pCVD432 có chiều dài 630bp trên plasmid pAA (cho EAEC), các gen Stx1 và
Stx2, pVCD419, Hly (cho EHEC); lt, st (cho ETEC); eae, bfp (cho EPEC) [13,
22].

8
1.4. PCR trong xác định DEC
Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã đa lại một cuộc cách mạng trong việc nghiên
cứu, phân tích gen và hệ gen. Trớc đây, khó khăn lớn nhất trong việc phân tích
gen nằm ở chỗ, chúng là những đơn vị rất nhỏ, số lợng ít trong một hệ gen
phức tạp và khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có
thể tạo ra một số lợng lớn các bản sao của một đoạn ADN mong muốn [12].
Phản ứng PCR dựa trên nguyên lý tổng hợp ADN trong tế bào, trong đó
ADN đợc nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Về nguyên tắc, để bắt đầu quá
trình tổng hợp ADN, hai sợi ADN làm khuôn mẫu bị tách ra dới tác dụng của
nhiệt độ. Hai đoạn oligonucleotide từ 20-40 nucleotid gọi là mồi, sẽ gắn vào các
vị trí bổ xung trên đoạn ADN khuôn mẫu.

Sơ đồ hóa Nguyên lý kỹ thuật PCR
1. Giai đoạn biến tính. 2. Giai đoạn gắn mồi.
3. Giai đoạn kéo dài mồi. 4. Sau khi hoàn thành chu kỳ đầu tiên.

Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ đợc kéo dài về hai phía, tạo ra
đoạn ADN mới bổ xung với đoạn khuôn mẫu. Với một cặp mồi đặc hiệu, một

9
đoạn ADN nào đó sẽ đợc tổng hợp sau mỗi chu kỳ của PCR. Việc thao tác


10
phơng pháp dùng bi thuỷ tinh hoặc bi silic [8]. Đơn cử nh phơng pháp
dùng phenol và chloroform của Viện quân y Mỹ (AFRIMS) [38]. Qui trình cụ
thể cũng khá phức tạp. Hiện nay trên thị trờng có một số bộ kit thơng phẩm
nh bộ sinh phẩm QIAamp DNA Stool Mini Kit của hãng QIAGEN [34].
Trong bộ kit này để tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân, các nhà sản
xuất đã đa ra qui trình gồm có các bớc sau:
- Ly giải 200mg (hoặc 2ml) mẫu phân trong 1,4ml dung dịch ASL. Tế
bào vi khuẩn và những tế bào bệnh lý khác trong phân, đợc ly giải đồng nhất ở
70
o
C trong 5 phút (nếu cần thiết có thể tăng lên 95
0
C).
- Hấp phụ tạp chất: sử dụng 1 viên InhibitEX đợc cung cấp trong bộ kit,
để hấp phụ hết những chất ức chế phản ứng PCR.
- Thuần khiết DNA:
+ Sử dụng Proteinase K, Buffer AL, ethanol để làm biến tính protein.
+ Gắn kết ADN lên một màng silica-gel có sẵn trong ống QIAamp.
+ Rửa màng bằng dung dịch Buffer AW1, Buffer AW2 để loại bỏ
những chất không thuần khiết.
+ Sử dụng dung dịch Buffer AE để hoà tan ADN gắn trên màng.
Tuy nhiên, các phơng pháp này hoặc là quá phức tạp, hoặc quá đắt và
chỉ thực hiện đợc ở những phòng xét nghiệm đợc trang bị máy móc hiện đại.
Vì thế, một phơng pháp tách chiết ADN trực tiếp từ phân đơn giản, nhanh,
hiệu quả và ít tốn kém sẽ có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong hoàn cảnh ở Việt
Nam, là chìa khoá đối với kỹ thuật PCR xác định nhanh và trực tiếp các chủng
E. coli gây tiêu chảy cũng nh các vi khuẩn khác trực tiếp từ phân.


C
ATCC 43893
ial
EAEC 97R* Chủn
g
có đoạn
p
CVD432 trên
p
AA
E. coli
ATCC 11775 Chủn
g
khôn
g
có
g
en độc lực
Các chủng này đợc lu giữ trong Ngân hàng của Đề án Bảo tồn nguồn gen Vi
sinh vật y học.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn
- Môi trờng dùng trong nuôi cấy và phân lập vi khuẩn: Sorbitol Mac Conkey
(SMAC), Deoxycholate Citrat Agar (DCA).
- Các loại tube, đĩa petri

2.2.2. Sinh phẩm, hoá chất, và máy móc dùng trong PCR
2.2.2.1. Sinh phẩm, hóa chất
GGTCTTCAAAA
3

147
5
CCCGGTACA
G
A
GCAGGATTACAACA
3

VT1
vt1
AF461172
5
GAAGAGTCCGTGGGATTACG
3

130
5
AGCGATGCAGCTATTAATAA
3

VT2
vt2
AY143337
5
ACCGTTTTTCAGATTTT
G
A

TTCTTGGTGCTTGCGTGTCTTTT
3
367
5
TTTTGTTTGTTGTATCTTTGTAA
3
EA
pCVD
X81423
5
CTGGCGAAAGACTGTATCAT
3
630
5
CAATGTATAGAAATCCGCTGTT
3
- Đệm, nớc khử ion
- PCR master mix (Epicentre-Đức) trong đó có dung dịch đệm, dNTPs, MgCl
2
,
Taq polymerase (Invitrogen-Mỹ).
- Thạch Agarose dùng trong điện di gel của hãng BBL
- Ethidium bromide dùng để nhuộm gel.
- TAE (Tris Acetate EDTA).
- PBS (Phosphate Buffer Saline).
2.2.2.2. Dụng cụ và máy móc
- Máy điều nhiệt tự động GenAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystem,
Mỹ).
- Máy ly tâm lạnh (Beckman, Mỹ)
- Bộ điện di ngang Horizonđ58 (Gibco-BRL, Mỹ).

PCR master mix 12,5 l
Primer forward (2,5 mM) 1,5 l
Primer reverse (2,5 mM) 1,5 l
ADN khuôn mẫu 3,0 l
Tổng cộng 25,0 l
+ Cho các mẫu vào máy PCR với chu kỳ nhiệt nh sau:
. 01 chu kỳ 96
0
C/4 phút
. 30 chu kỳ: 94
0
C/30 giây, 50
0
C/30 giây, 72
0
C/30 giây
. 01 chu kỳ: 72
0
C/7phút
. Giữ ở 4
0
C.

14
+ Điện di các sản phẩm sau khi chạy PCR trên gel agarose 1,2% với dung
dịch đệm là TAE [12].
Các mẫu thực nghiệm đợc điện di song song cùng với chứng âm và dơng.
Luôn có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc.
+ Nhuộm ADN và đọc kết quả
. Bản gel sau khi điện di đợc ngâm trong dung dịch Ethidium Bromide


15
2.3.3. Phát triển qui trình tách chiết ADN của DEC trực tiếp từ phân
2.3.3.1. Phát triển qui trình
- Đầu tiên, qui trình đợc thực hiện với chủng chuẩn EAEC, do đây là loại
E. coli gây tiêu chảy gặp với tỷ lệ cao nhất trong số 5 loại E. coli gây tiêu chảy
có thể gặp trong bệnh phẩm.
Dựa vào một số nghiên cứu trớc đây [23, 26, 44] chúng tôi dự kiến qui trình
nh sau:
- Ly tâm với tốc độ thấp để loại bỏ các chất có kích thớc lớn trong phân.
- Ly tâm với tốc độ cao hơn để lấy vi khuẩn và loại bỏ các chất hoà tan trong
phân.
- Đun huyền dịch vi khuẩn để giải phóng ADN.
- Ly tâm lấy nớc nổi chứa ADN làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.
Các bớc thực hiện của qui trình:

+ Bớc 1: 200 mg phân đợc hoà vào huyền dịch vi khuẩn có độ đục
Macfarland bằng 4 (tơng đơng với nồng độ 10
9
vi khuẩn/ml).
+ Bớc 2: Ly tâm huyền dịch phân ở bớc 1 với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5
phút. Lấy nớc nổi.
+ Bớc 3: Nớc nổi từ bớc 2 đợc tiếp tục ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút
trong 10 phút. Lấy nớc nổi.
+ Bớc 4: Nớc nổi từ bớc 3 tiếp tục đợc ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút
trong 10 phút. Lấy cặn.
+ Bớc 5: Hoà cặn sau khi thu đợc vào 300 l nớc cất, trộn đều, đun cách
thuỷ 100
0
C trong 20 phút.

Nồng độ ADN trong mẫu đợc tính theo công thức:
C= A
260
x 50 (
g/ml)

Trong đó: C: nồng độ ADN cần xác định.
A
260
: giá trị mật độ quang ở bớc sóng 260nm.
50: hệ số đo OD của ADN sợi đôi.
Độ sạch của ADN đợc đánh giá thông qua tỷ số OD
260
/OD
280
.
ADN đợc coi là sạch nếu tỷ số này nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 [34].
+ Đánh giá dựa vào một số tiêu chuẩn sau:
1. Phản ứng PCR cho kết quả tốt nhất (+++).
2. Nồng độ ADN cao hơn 100 g/ml.
Theo một số tác giả [12, 25, 41] lợng ADN khuôn mẫu dùng cho một
phản ứng PCR khoảng 100-500 ng đối với đoạn ADN mẫu từ nhiễm sắc thể.
Trong nghiên cứu này, một số đoạn gen cần phát hiện của DEC nằm cả ở

17
plasmid và nhiễm sắc thể. Chúng tôi lấy giá trị trung bình khoảng 300 ng. Theo
qui trình của Epicentre (lợng ADN khuôn mẫu là 3l/phản ứng), thì nồng độ
ADN khuôn mẫu cần tối thiểu là 100 ng/l tơng đơng với 100 g/ml.
3. Độ tinh sạch của ADN đạt từ 1,8-2,0.
Qui trình sau khi đã hoàn thiện sẽ đợc dùng để

0
C/7 phút
+ Giữ ở 4
0
C.
+ Thực hiện phản ứng PCR đa mồi với nồng độ DNA khuôn mẫu thay đổi
Trong nghiên cứu của mình, Nguyễn Vũ Trung và cộng sự đã tối u hoá
hệ thống PCR đa mồi xác định E. coli gây tiêu chảy, sử dụng ADN tách từ
khuẩn lạc [30]. Điểm khác nhau cơ bản giữa qui trình xác định DEC trong
nghiên cứu của chúng tôi so với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Trung, là ADN
đợc sử dụng cho phản ứng PCR. Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng ADN tách
chiết trực tiếp từ phân.

18
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN phụ thuộc vào phơng pháp tách chiết.
Chính vì vậy trong nghiên cứu này, tối u hoá hệ thống PCR đa mồi thực chất là
tối u hoá nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng PCR.
Để tối u hoá nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng PCR chúng tôi tiến hành
nh sau:
- Pha lần lợt các chủng chuẩn E. coli gây tiêu chảy EAEC, EHEC, HIEC,
EPEC, và ETEC vào 1 ml nớc cất để có độ đục Macfarland 4 (tơng đơng với
10
9
vi khuẩn/ml).
- Trộn 1 ml từng huyền dịch trên với 200 mg phân đã đợc xác định không có
E. coli gây tiêu chảy
- Tách chiết ADN theo qui trình đã hoàn thiện (Phần 2.3.3.2).
- Mỗi thử nghiệm cho một chủng đợc lặp lại 10 lần.
- Dung dịch ADN tách chiết từ các chủng DEC, đợc định lợng bằng quang phổ
kế. Tính nồng độ ADN trung bình ban đầu sau khi tách chiết.

2 EHEC ATCC 43890
E. coli
3 EHEC ATCC 43889
E. coli
4 EPEC ATCC 43887
E
. coli
5 EIEC ATCC 43893
E. coli
6 EAEC 97R
E. coli
7
E. coli ATCC 11775 E. coli
Nhận xét Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy:
7 chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu đã đợc kiểm tra và đúng với tên
trong lý lịch chủng của Đề án Lu giữ Nguồn gen Vi sinh Y học.
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra các chủng E. coli gây tiêu chảy bằng kỹ thuật
PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho từng chủng

STT
E
. coli
gây tiêu chảy
Tên chủng
kiểm tra
Cặp mồi sử dụng Kết quả
kiểm tra
Primer
Gen
đích

eaeA
376

+
bfpA
bfpA
367
4 EIEC ATCC 43893
SHIG
ial
320
+
5 EAEC 97R
EA
pCVD
630
+
6
E. coli
ATCC 11775
Với từn
g
cặ
p
mồi trên
- 20
Nhận xét

STT Mẫu phân Kết quả PCR với 8 cặp mồi đặc hiệu cho DEC
1 1 Âm tính
2 2 Âm tính
3 3 Âm tính
4 4
Â
m tính
5 5 Âm tính
6 6 Âm tính
7 7 Âm tính
8 8
Â
m tính
9 9 Âm tính
10 10 Âm tính
Nhận xét Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, PCR kiểm tra 10 mẫu phân cho kết quả
âm tính, các mẫu phân này không có DEC.
3.3. Kết quả phát triển và hoàn thiện qui trình tách chiết ADN của DEC
trực tiếp từ phân
3.3.1. Tối u lợng nớc cất để hoà tan 200 mg phân
- 200 mg mẫu phân đã chuẩn bị cho vào các tube nhựa chứa 1, 2, 3, 4 và 5 ml
nớc cất. Lắc trên máy lắc đến khi phân đợc hoà tan thành một huyền dịch.

21
- Lặp lại thử nghiệm 10 lần. Kết quả thử nghiệm nh sau:
Bảng 3.4. Kết quả tối u hoá lợng nớc cất để hoà tan 200 mg phân
Lần
thử nghiệm
Lợng nớc cất hoà tan 200 mg phân và kết quả hoà tan phân
1ml 2ml 3ml 4ml 5ml

phân

2
3
4
5
6
7
8
9
10
Nhận xét Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy:
Lợng nớc cất tối thiểu phải là 3ml mới đủ để hoà tan hết 200 mg phân.
3.3.2. Phát triển qui trình
- Sử dụng chủng EAEC 97R, cấy trên môi trờng SMAC, lấy khuẩn lạc hoà với
nớc cất tạo huyền dịch vi khuẩn có độ đục Macfarland bằng 4 (nồng độ vi
khuẩn tơng đơng với 10
9
vi khuẩn /ml) để bắt đầu thực hiện qui trình ly tâm.
- Theo thiết kế ban đầu: Nh mô tả trong phần 2.3.3.1
Bảng 3.5. Kết quả PCR dùng ADN tách chiết theo thiết kế ban đầu
(sử dụng cặp mồi EA)
1000 v/p
trong 10 phút
3000 v/p
trong 10 phút
12000 v/p
trong 10 phút
Kết quả
PCR đơn mồi

4 lần
-
5 lần
- 3 lần
1 lần

1 lần
-
2 lần
-
3 lần
-
4 lần
-
5 lần
-
1 lần
-

22

4 lần
2 lần
1 lần
-
3 lần
-

9
vi khuẩn /ml), và 2ml nớc cất, trộn đều
trên máy lắc.
- Bớc 2: Ly tâm huyền dịch phân ở bớc 1 với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10
phút cho lắng các thành phần có kích thớc lớn. Lấy nớc nổi.
- Bớc 3: Nớc nổi từ bớc 2 đợc ly tâm tiếp với tốc độ 2000 vòng/phút trong
10 phút để lắng các thành phần có kích cỡ trung bình. Lấy nớc nổi.
- Bớc 4: Nớc nổi từ bớc 3 đợc ly tâm tiếp với tốc độ 4000 vòng/phút trong
10 phút để lắng vi khuẩn. Loại bỏ nớc nổi và lấy cặn.
- Bớc 5: Cho thêm vào cặn 500 l nớc cất, lắc đều trên máy lắc. Ly tâm với
tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ nớc nổi
- Bớc 6: Cho 300 l nớc cất vào cặn thu đợc ở bớc 5. Đun sôi cách thuỷ
100
0
C trong 20 phút.
- Bớc 7: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ cặn.
Nớc nổi chứa ADN dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.

23
3.3.3. Hoàn thiện qui trình
Để hoàn thiện qui trình ly tâm và tách chiết ADN trực tiếp từ phân của
EAEC, chúng tôi tiến hành lặp lại 1 4 lần các bớc 2, 3, 5 của qui trình trên.
Cụ thể là 84 lần tách chiết ADN trực tiếp từ phân theo sơ đồ 1, gồm:
- 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 1000 vòng trong 10 phút.
- 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 2000 vòng trong 10 phút.
- 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 4000 vòng trong 10 phút.
Sau đó lặp lại thử nghiệm 3 lần để lấy kết quả trung bình.
Mục đích là lựa chọn qui trình hoàn thiện đạt các tiêu chuẩn sau: phản
ứng PCR cho kết quả tốt nhất (+++); nồng độ ADN cao hơn 100 g/ml, độ tinh
sạch của ADN đạt từ 1,8-2,0 và tốn ít thời gian nhất.

1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm