BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM NGUYỄN TRƯƠNG BẢO TRÂN
CHỌN GIỐNG VI KHUẨN VÀ KHẢO SÁT
MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ACETIC
ĐỂ LÀM GIẤM TRÁI CÂY Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã Số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRỊNH THỊ HỒNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2007
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong các loại thực phẩm lên men thì giấm ăn là loại gia vị, thực phẩm
phổ biến và phần lớn các gia đình Việt Nam đều sử dụng. Giấm sử dụng trong
che biến thực phẩm hàng ngày, bảo quản thực phẩm, làm gia vị chế biến thực
phẩm. Ngoài ra, giấm được dùng như bài thuốc chữa nấc cục, buồn nôn, tàn
nhang, lở loét, các vết cắn của chó, bò cạp, rết hay côn trùng.
Ở Việt Nam, q
uá trình “lên men” acetic rất quen thuộc với nhân dân
thông qua việc nuôi giấm trong gia đình. Giấm được tạo ra bằng phương pháp
lên men dân gian từ các nguyên liệu như chuối, dứa, nước dừa, rượu ngũ cốc,
rượu trái cây. Nước ta có rất nhiều loại trái cây, có thể sử dụng các loại trái
cây này để làm giấm.
Do đó, đề tài “Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên
men acetic để làm giấm trái cây” rất có ý nghĩa đối với sản xuất và đời sống.
2. Mục đíc
h của đề tài nghiên cứu
Tìm điều kien để vi khuẩn sinh acetic acid sinh trưởng mạnh.
Tìm biện pháp tối ưu để tăng hiệu suất lên men acetic trong thời gian
ngắn, tạo ra những sản phẩm giấm trái cây thơm ngon và có giá trị dinh
dưỡng cao. 3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu tài liệu nhằm
xây dựng tổng luận nghiên cứu:
Thu thập tài liệu, nghiên cứu, phân tích, tổng hợp những tài liệu về
- Giấm cồn “Spirit vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua,
dung dịch cồn nguyên chất được pha loãng, có bổ sung các muối vô cơ và
chất dinh dưỡng.
- Giấm vang “Wine vinegar” : là sản phẩm của quá trình lên men chua
dịch rượu vang nho. - Giấm gạo “Rice vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch
bột gạo đã được chuyển hoá thành đường rồi thành rượu.
- Giấm mạch nha “Malt vinegar” là sản phẩm của quá trình lên men chua
dịch tinh bột đã được chuyển hoá thành malt.
- Ngoài ra giấm còn được làm từ các loại nước trái cây khác : nước ép
thơm, nước ép trái điều, nước dừa. Từ rượu vang các loại: vang dứa, vang
sơri, vang mít…
1.1.3. Thành phần của giấm ăn [28], [42].
Bên cạnh acetic acid và e
thanol, giấm còn chứa các sản phẩm thứ cấp,
có vai trò quan trọng trong việc tạo mùi vị… Những thành phần này có nguồn
gốc từ nguyên liệu hay được bổ sung trong khi lên men, tạo thành do vi khuẩn
Acetic hoặc do mối tương tác giữa các sản phẩm tạo thành. Trong giấm còn
có những hợp chất không giải thích được nguồn gốc.
Trong giấm chứa nhiều amino acid (ví dụ giấm cồn có 18 loại amino acid),
nguồn gốc amino acid được tạo ra chủ yếu từ sự tự phâ
n của vi khuẩn
Acetic.
Các hợp chất bay hơi: Trong giấm có chứa nhiều hợp chất bay hơi khác
nhau như ethylacetate, aldehyt, ethylformate…
1.1.4. Nguyên liệu sử dụng để làm giấm [12], [24]
Ethanol là nguyên liệu trực tiếp để lên men tạo acid acetic. Ngòai ra còn
dùng dung dịch chứa đường như: mật rỉ đường, mật ong, các loại trái cây có
Châu Mỹ- Braxin hay Paragoay, do đó thích hợp nhiệt độ cao và độ ẩm cao.
Dứa là loại cây không kén đất vì chúng c
ó thể sinh trưởng trên các vùng gò
đồi, dốc (20 độ trở xuống), nghèo dinh dưỡng như đất phèn ở Đồng bằng
Sông Cửu Long, đất đá vôi, đất vàng đỏ ở ở các tỉnh miền Bắc. Sau 1-2 năm
trong dứa có thể cho năng suất 10-12 tấn/ha, thậm chí là 30-35 tấn/ha.
Hàm lượng đường trong dứa trung bình từ 8-12%, có nơi trồng giống tốt
và chăm sóc tốt tỷ lệ đường đạt đến 15-16% (trong đó 66% đường dưới dạng
saccaroz v
à 34% dưới dạng fructoz và glucoz ).
Dứa có độ acid khoảng 0,6% (trong đó có tới 87% acid citric).
Hàm lượng chất tro chiếm 0,4-0,6% trọng lượng (chủ yếu là kali, magie
và canxi).
Trong dứa có chứa nhiều vitamin C : 24-28mg/100g.
Trong dứa có enzym Bromelin có tác dụng tiêu hoá rất tốt.
Dứa cung cấp năng lượng đáng kể cho cơ thể con người: 1kg trái dứa cho
400-420 calo hoặc 150ml nước dứa cung cấp 100-150 calo.
Bảng 1.1 : Thành phần dinh dưỡng của dứa
Thành phần Hàm lượng
Nước (%) 54,3
Protein(%) 0,5
Acid hữu cơ (g%) 0,6
Glucid (g%) 3,9
Tro (g% ) 0,2
Muối khoáng (mg%)
Ca
P
Thiamin (B
1
) g
160-450
Riboflavin (B
2
) g
3-60
Acid panthothenic 0,5-1,4 Pyridoxin (B
6
) mg 0,16-0,5
Nicotinamit (PP) mg 0,68-2,6
Acid p-amiobenzoic g
15-92
1.1.6. Các tác nhân gây hại giấm [18], [20], [24], [28].
Giấm dễ bị hỏng trong thời gian bảo quản do nhiều nguyên nhân
Giấm chưa đạt chất lượng dễ bị oxy hóa quá mức tạo thành CO
2
và
H
2
O làm giấm bị giảm độ chua và vẩn đục.
Các vi sinh vật làm hư giấm như nấm men thuộc giống Candida.
Các sinh vật làm hư giấm như: lươn giấm, ruồi giấm, bọ giấm…
Lươn giấm có tên là Anguila aceti, là loại sâu phổ biến trong
sản xuất giấm. Nó có dạng giống giun tròn, có thể nhìn thấy
1.1.7. Các tiêu chuẩn về thực phẩm của giấm ăn. [26], [28], [42]
Giấm ăn là loại thực phẩm không độc đối với người và không có vi
sinh vật gây bệnh. Một mẫu giấm phải đạt các tiêu chuẩn sau:
Trạng thái cảm
quan tốt: giấm trong suốt hoặc hơi đục (nếu
nguyên liệu là tinh bột), màu trắng trong (giấm rượu, nước
dừa…) hoặc có màu vàng nhạt đến nâu (giấm bia, rượu vang, rỉ
đường, trái cây…). Mùi vị chua dịu, có thể có mùi của nguyên
liệu như rượu, bia, rỉ đường…Nếu giấm có nhiều mùi vị của
nguyên liệu thì sự lên men chưa đạt, giấm chóng hỏng.
Không có lươn giấm.
Không chứa acid vô cơ tự do.
Không có kim
loại nặng.
Không chứa phẩm màu.
Không chứa chất sát trùng.
Không chứa hơn 2% ethanol.
1.1.8. Bảo quản giấm ăn. [28], [42] Giấm thu được sau khi lên men gọi là giấm tươi, giấm có ít hoặc nhiều
vẩn đục do chứa vi khuẩn acetic và các chất phân hủy từ nguyên liệu ban đầu
nên cần được xử lý trước khi tiêu thụ.
Phương pháp thanh trùng Pasteur
Các loại giấm sản xuất từ rượu vang, dịch ép trái cây thường tạo tủa ở đáy
chai sau 1 thời gian bảo quản. Người ta thanh trùng bằng cách đun sôi ở 75
o
-
80
o
Trong gia đình, có thể bảo quản những lọ giấm bằng cách cho cào vài tép
tỏi hoặc 1 ít m
uối ăn. Bảo quản giấm ở điều kiện thóang mát, tránh ánh sáng mặt trời và nhiệt độ
cao. Giấm đã qua lọc bảo quản được lâu hơn.
1.2. Vi khuẩn lên men sinh Acid Acetic.
1.2.1. Đặc điểm chung. [13], [30], [37], [42], [47],[50]
Vi khuẩn sinh acetic acid là những vi sinh vật Gram âm, hiếu khí bắt
buộc, có hình que và rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng sử dụng oxygen làm
chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Vi khuẩn sinh acetic acid
thường hiện diện trong những m
ôi trường có đường, alcohol hay các môi
trường acid hoá như trái cây, các loài hoa hoặc các sản phẩm lên men rượu
Khả năng oxy hoá ethanol tạo thành acetic acid và tiết ra môi trường được
xem là đặc điểm chung của vi khuẩn sinh acetic acid. Vi khuẩn Acetic di động
nhờ 1-8 tiêm mao ở cực hay chu mao, hoặc không di động. Không hình thành
nội bào tử.
Đặc điểm hình thái [13]
Các đặc điểm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng
khuẩn lạc, trạng thái Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước tế bào.
Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi
trên tế bào cũng có vai trò trong việc
định danh vi khuẩn sinh acid acetic.
Đặc điểm sinh thái . [13], [39]
Đặc điểm phân bố của vi khuẩn sinh acid acetic thường gắn liền với
nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu
và ở các nơi sản xuất giấm.
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa. [13], [30], [34], [38], 40], [41],[42], [48],
- Sản xuất giấm.
- Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học: Đặc tính oxy hoá không
hoàn toàn nhiều loại nguồn carbon khác nhau của giống Gluconobacter đặc
biệt có ý nghĩa trong công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp. Ví dụ:
G.oxydans có vai trò rất quan trọng ở giai đoạn chuyển hoá D-sorbitol thành
L-sorbose trong nghành công nghiệp sản xuất vitamin C; G.oxydans còn được
sử dụng trong sản xuất dihyroxyacetone (DHA) nhờ quá trình chuyển hoá
glycerol.
- Sản xuất một số loại nước giải khát lên m
en truyền thống. Ví dụ: sản
xuất rượu Kombucha, 1 loại nước giải khát có vị hơi chua và sủi bọt được ưa
thích ở Nhật Bản, Trung Quốc, An Độ và một số nước Châu Au, là quá trình lên men trà đen đã bổ sung đường bởi tổ hợp nấm men cùng 3 giống
Acetobacter, Gluconobacter và Gluconacetobacter .
-Sản xuất cellulose vi khuẩn.
1.2.3. Phân loại. [13]
Vi khuẩn sinh acetic acid được phân loại trong họ Acetobacteraceae
thuộc phân lớp
-Proteobacteria. Theo International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology (IJSEM)- Tạp chí Quốc Tế về Phân loại và
Tiến hóa của Vi sinh vật, cho đến nay họ Acetobacteraceae có 10 giống gồm:
Acetobacter Beijerinck 1898, Gluconobacter Asai 1935, Acidomonas
Urakami và cộng sự 1989, Gluconacetobacter Yamada và cộng sự 1998,
Asaia Yamada và cộng sự 2000, Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002,
Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004, Swaminathania Loganathan và Nair
2004, Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006, và Granulibacter Greenberg và
cộng sự 2006
với chỉ 1 loài là Acidomonas methanolica. Giống này được công nhận với các
đặc điểm Gram âm, tế bào hình que, ưa acid và đặc biệt là có khả năng dinh
dưỡng methyl tùy ý.
1.2.3.4. Gluconacetobacter Yamada và cộng sự- 1998
Thuật ngữ “ Gluconoacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ
phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984)
nhận thấy thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào sinh vi khuẩn sinh
acetic acid khác nhau. Các chủng có Q-10 là thành phần ubiquinone chính
được phân loại trong giống phụ Gluconoacetobacter, trong khi Q-9 là thành
phần ubi
quinone chính trong màng tế bào Acetobacter. Sau đó, giống phụ
Gluconoacetobacter được đưa lên thành giống thứ tư trong họ
Acetobacteraceae dựa vào mối quan hệ phát sinh loài khi phân tích một phần
trình tự mã hoá 16S rRNA.
1.2.3.5. Giống Asaia Yamada và cộng sự-2000
Giống Asaia được giới thiệu là giống thứ năm trong họ
Acetobacteraceae bởi Yamada và cộng sự (2000). Các loài Asaia có những
đặc điểm
khá khác biệt so với các giống đã biết; Không sinh acetic acid hoặc
tạo thành 1 lượng rất ít từ nguồn cơ chất ethanol và hầu như bị kìm hãm phát triển trong môi trường có chứa acid acetic với nồng độ 0,35%. Hầu như tất cả
các chủng Asaia được phân lập từ các loài hoa ở vùng nhiệt đới và phát triển
tốt trong môi trường có nguồn cơ chất là đường.
1.2.3.6. Giống Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002
Giống mới Kozakia được phát hiện khi Lisdiyanti (2002) khảo sát 1
cụm phát sinh loài mới trên cây phát sinh loài của vùng trình tự 16S đối với
các chủng vi khuẩn sinh acetic acid phân lập tại Indonesia.
học hay sinh học lên men. Lên men acetic thực chất là quá trình oxy hóa
không hoàn toàn ethanol thành acid acetic dưới tá
c dụng của vi khuẩn.
Louis Pasteur là người khám phá ra cơ chế của quá trình lên men acetic
vào năm 1802.
Phương trình tổng quát:
CH
3
CH
2
OH + O
2
CH
3
COOH +H
2
O + 117kcal
Thực chất trải qua các giai đọan sau:
2CH
3
CH
2
OH + O
2
CH
3
CHO +2H
2
O
ethanol Acetaldehyt
D-Manit D-Fructose.
D-Glucose acid gluconic D-5-ketogluconic.
Lactic acid pyruvic acid.
1.3.2 . Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lên men.[12]
1.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid.
Trong quá trình lên men acetic, nồng độ acid ảnh hưởng rất quan
trọng đến sự lên men.
Nếu nồng độ acid acetic đạt 8% sẽ ức chế họat động của vi khuẩn và
nếu nồng độ đạt acid acetic từ 12-14% sẽ ức chế hoàn toàn vi khuẩn.
1.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ rượu.
Nồng độ rượu trong m
ôi trường lên men là 6-7% thể tích hoặc 9-
14% đối với lọai vi khuẩn khác. Nếu trong môi trường không có rượu thì vi
khuẩn tiếp tục oxy hóa acid acetic để thu nhận năng lượng dùng trong sự
sống. Vì thế đây là 1 quá trình có hại.
Việc sử dụng acid acetic bởi vi khuẩn dấm gọi là sự quá oxy hóa và
acid acetic bị mất đi theo phản ứng:
CH
3
COOH + 2O
2
=2CO
2
+2H
2
O
Trong sản xuất người ta thường giữ lại độ rượu trong môi trường là
0,3-0,5%.
Sự quá oxy hóa phụ thuộc vào độ acid của môi trường. Đối với những
(NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
PO
4,
KH
2
PO
4
, MgSO
4
, CaHPO
4
, FeCl
3
…tùy theo nhu cầu
cụ thể của từng loài. Ngòai ra trong môi trường dung dịch còn được bổ sung
thêm vitamin và chất kích thích sinh trưởng: pepton, cao nấm men, cao thịt,
sữa…Theo nghiên cứu của 1 số tác giả Nhật Bản trong môi trường dung dịch
còn được bổ sung sake, myglycerin, lactic acid …
1.3.3. Các phương pháp lên men [12], [20]
1.3.3.1. Phương pháp chậm
Nguyên lý
-Cho chất lượng giấm thơm ngon.
-Thiết bị sản xuất không phức tạp, phù hợp với các cơ sở sản xuất nhỏ ở
các địa phương.
Nhược điểm
- Thời gian lên men dài. - Năng suất thấp.
- Nồng độ acid thấp.
- Mặt bằng sản xuất phải lớn.
- Khó cơ khí hóa, tự động hóa.
- Hiện nay chỉ còn 1 vài nước chậm phát triển còn sử dụng như biện
pháp duy nhất để sản xuất giấm trong đó có Việt Nam.
1.3.3.2. Phương pháp nhanh
Nguyên lý
Phương pháp nhanh còn được gọi là phương pháp Đức. Phương pháp
này được tìm ra vào năm 1823, do Schiizenbachi, cho phép thời gian lên men
giảm xuống đáng kể.
Nguyên tắc của phương pháp này là tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa
vi khuẩn Acetobacter với không khí để oxy hóa rượu. Bề mặt lớn được tạo ra
khi sử dụng vật liệu xốp (thường dùng vỏ bào, lõi ngô xếp trong thiết bị dạng
thap, trụ, nón cụt…), tháp lên men thông thường làm bằng gỗ, thường có
chiều cao gấp đôi đường kính 2,5 – 6m x 1,2 -3m
. Vi khuẩn acetic được bám
trên vat liệu xốp (vật liệu mang). Những vật liệu này có bề mặt tiếp xúc riêng
lớn ,thể tích tự do lớn, khối lượng riêng bé, độ bền cơ học cao, rẻ tiền, dễ
kiếm, phải có đủ độ nhám, độ xốp để màng vi sinh vật có thể bám lên đó,
Sự giảm hệ số nhiệt độ làm
giảm sự thông khí cho thiết bị và họat động oxy
hóa của vi khuẩn. Điều đó dẫn đến sự giảm nhiệt độ trong thiết bị và giảm độ
thông khí, dẫn đến sự đình chỉ hòan tòan quá trình sản xuất khi nhiệt độ môi
trường quá cao( t
o
> 30
o
C ). Vấn đề kiểm tra nhiệt độ tự động trong thiết bị
được giải quyết bằng cách làm lạnh dịch lên men trước khi bơm tuần hòan trở
lại thiết bị tới nhiệt độ 26-28
o
C. Nồng độ oxy được kiểm tra bằng
Oxygemeter, nồng độ oxy trong khí thải được bảo đảm lớn hơn 12%. Có thể coi phương pháp sản xuất acid acetic theo phương pháp công
nghiệp của Đức là ứng dụng đầu tiên về phương pháp cố định tế bào vi sinh
vật vào công nghiệp lên men.
Ưu điểm
- Thời gian lên men ngắn hơn so với phương pháp chậm khá nhiều, chỉ
trong 5-6 ngày.
-Giấm thu được có nồng độ cao .
Nhược điểm
-Hiệu suất kinh tế chưa cao do thiết bị khá phức tạp, điều chỉnh thiết bị
thông gió khó và cần phải nghiên cứu kỹ hơn.
-Hiệu suất của quá trình lên men không cao vì rượu và acid là chất dễ
bay hơi ( lượng thất thóat tới 2-6%). Có thể khắc phục bằng cách đặt 1 thiết bị
tự động. Tùy loại nguyên liệu sử dụng và lượng rượu etylic cho vào, quá
trình lên men có thể kéo dài 40-96 giờ với hiệu suất 90-95%.
Mặc dù có những ưu điểm rất lớn nhưng mãi cho đến gần đây nó mới
được sử dụng rộng rãi trong đời sống, nguyên nhân kìm hãm là do nhu cầu
phức tạp của thiết bị, tính ổn định không cao, quan trọng nhất là yêu cầu
nghiêm
ngặt của việc cung cấp oxy liên tục. Những công trình ngiên cứu từ
năm 1949 đã chỉ ra rằng các vi khuẩn Acetobacter khi ở trạng thái lơ lửng
trong môi trường gồm dấm, cồn, nước sẽ trở nên nhạy cảm với việc cung cấp
oxy ở những giai đọan ngắn nhất, đặc biệt khi nồng độ acid acetic đã khá cao.
Ví dụ: nồng độ tổng l
à 5%, khi ngừng cung cấp oxy trong khỏang 120 giây sẽ
làm chết 1/3 số vi khuẩn có mặt trong môi trường lên men, nếu nồng độ tổng
là 12% thì chỉ cần ngắt oxy trong 10-12 giây đã đủ làm chết 1/3 tổng số vi
khuẩn.
Ưu điểm
- Thời gian lên men nhanh.
- Thiết bị nhỏ hơn, gọn hơn, năng suất cao hơn.
- Hiệu suất cao( 90-95%). - Có khả năng tự động hóa cao.
- Tổng sản lượng dấm sản xuất theo phương pháp đến năm 1981 là767
triệu lít năm (giấm10%), trong đó chủ yếu là nước Mỹ, Nhật Bản, Pháp, Tây
Đức và 1 số nước khác. Ở Việt Nam đã tiên hành lên men dấm và acid acetic
theo phương pháp chậm,đang nghiên cứu các phương pháp lên men nhanh và
chìm.
Nhược điểm
và chìm.
Nhược điểm
-Thiết bị yêu cầu phức tạp, cồng kềnh.
-Giống vi khuẩn phải phù hợp cả 2 phương pháp.
1.3.3.5. Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật
1.3.3.5.1. Định nghĩa tế bào cố định
Tế bào cố định là tế bào có sự chuyển động trong không gian bị giới
hạn, sự giới hạn của tế bào có được bằng đưa nó vào 1 phase cách ly với
phase dung dịch tự do. Phase chứa tế bào thường không tan trong nước, l
à
polymer cao phân tử ưa nước.
1.3.3.5.2. Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt
chất mang
Phương pháp này dự trên sự liên kết giữa chất xúc tác sinh học và
chất mang không tan trong nước.
a.Phương pháp liên
kết cộng hóa trị
Đây là phương pháp sử dụng để cố định enzyme và không được sử dụng
rộng rãi đối với tế bào vi sinh vật, vì tác nhân cần thiết đe tạo liên kết cộng
hóa trị có thể gây độc đến tế bào và gây khó khăn cho việc cố định.
Chất mang thường được sử dụng trong phương pháp này là polypeptide,
polysaccharide, dẫn xuất cellulose như DEAE-cellulose, DEAE-saphadex….,
agarrose, các polyme tổng hợp.
Phương pháp tiến hành
Copyright: Tài liệu đại học ©