ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LÂM THỤY ANH THƯ ĐỀ TÀI
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA BA PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
TẾ BÀO ỐI VÀ QUY CÁCH SỬ DỤNG DEMECOLCINE KHI
TẠO TIÊU BẢN NHIỄM SẮC THỂ THAI Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM - hướng Sinh lý động vật
Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS TRẦN THỊ DÂN

i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AF (amniotic fluid specific): đặc trưng của dịch ối
AFP: alpha-fetoprotein
bFGF(basic fibroblast growth factor): nhân tố cơ bản phát triển nguyên bào sợi
DMSO: dimethyl sulphoxide
DVME medium: môi trường Dulbecco-Vogt modified Eagle's
E (epithelioid): dạng biểu mô
F (fibroblastic): dạng nguyên bào sợi
F12: môi trường Ham's F12
FBS (Fetal bovine serum): huyết thanh phôi bò
FISH (Flourescence in situ hybridization): kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang
FSH (human follicle-stimulating hormone ): hóc-môn kích thích nang trứng
GH (growth hormon): hóc-môn sinh trưởng
hCG (human chorionic gonadotropin): kích dục tố màng đệm người
LH (human luteinizing hormone): hóc-môn hoàng thể hoá
mFISH (multi-color flourescence in situ hybridization): kỹ thuật lai tại chỗ phát
huỳnh quang nhiều màu
NST: nhiễm sắc thể
PBS: phosphate buffered saline solution
SD (Standard Deviation): độ lệch chuẩn
SF medium (serum-free medium): môi trường không huyết thanh
α MEM: α -modified

minimum essential medium

23
233338

41

42
44
46

68
6869
70

2. Hình

Hình 2.1: Hình minh họa thủ thuật chọc ối dưới sự hỗ trợ của siêu âm
Hình 2.2: Hình minh họa việc nuôi cấy tế bào thu nhận từ dịch ối
Hình 2.3: NST hiện băng tạo bởi các kỹ thuật nhuộm khác nhau
Hình 4.1: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có nhiều tế bào
đang phân chia (100x)
Hình 4.2: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ dày mức độ
trung bình (100x)
Hình 4.3: Cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ che phủ
mức độ dày (100x)
Hình 4.4 (a), (b): Các cụm tế bào ối nuôi cấy bằng phương pháp 1 có độ
che phủ mức độ rất dày (100x)
Hình 4.5: Một số mẫu thu hoạch của phương pháp 2 và phương pháp 3
Hình 4.6: Các tế bào ở giai đoạn khác nhau trong quá trình phân bào
(200x)
Hình 4.7: Các tế bào có bộ NST ở trạng thái khác nhau (200x)


48
6263
6566iv
Hình 4.10: Bộ NST có độ bung mức +++ (A) và NST đồ tương ứng (B)
(200x) 66

3.
Bi
ể
u đ
ồ

53
57

60

70
MỤC LỤC

Phụ lục bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng, hình và biểu đồ
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tế bào ối người
379
1114

16

31 32

58

7273
7475

2

Xét nghiệm bằng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang cho kết quả nhanh hơn,
chỉ mất khoảng 5 ngày – 1 tuần, tuy nhiên xét nghiệm này rất đắt tiền và chỉ khảo
sát được bất thường về số luợng của cặp NST số 13, 18, 21 và cặp NST giới tính.
Khuynh hướng xét nghiệm sàng lọc trước sinh hiện nay ở nước ta đang nghiêng về
kỹ thuật nhuộm băng khảo sát NST đồ. Kỹ thuật này cho phép khảo sát cả đột biến
số lượng và cấu trúc bộ NST của thai nhi với chi phí rẻ hơn khoảng 10-20%. Tuy
nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là mất thời gian khá lâu để có được kết quả,
khoảng 2 – 2,5 tuần. Bên cạnh đó việc tiến hành kỹ thuật này đến nay vẫn chưa cho
kết quả ổn định, tỷ lệ nuôi cấy thành công và thời gian nuôi cấy tế bào chịu ảnh
hưởng bởi nhiều yếu tố như tuổi thai, tình trạng lẫn máu mẹ, phương pháp nuôi cấy
tế bào ối…Phương pháp nuôi cấy tế bào ối bằng bình cấy flask được dùng phổ biến
hiện nay có thời gian nuôi cấy dài và tiêu hao hóa chất hơn và khi tạo tiêu bản NST
chưa cho nhiều cụm NST so với các phương pháp nuôi cấy in situ.
Nhằm chọn ra phương pháp nuôi cấy tế bào ối vừa hiệu quả vừa tiết kiệm, đồng
thời xem xét kỹ thuật tối ưu thu hoạch tiêu bản NST chất lượng tốt khi dùng
demecolcine xử lý mẫu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá hiệu quả của ba
phương pháp nuôi cấy tế bào ối và quy cách sử dụng demecolcine khi tạo tiêu
bản NST thai”.
1.2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
(1) Lựa chọn phương pháp nuôi cấy tế bào ối hiệu quả
(2) Xác định liều lượng demecolcine và thời gian xử lý mẫu với chất này để
tạo tiêu bản NST tốt. 3
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TẾ BÀO ỐI NGƯỜI

4
người hCG, hóc-môn tuyến giáp, insulin, glucagons, testosterone, progesterone,
estradiol, và cortisone [13]. Lượng dịch ối hiện diện đủ để tiến hành chọc ối bắt
đầu vào tuần 14 của thai kỳ, hầu hết việc chọc ối được thực hiện giữa tuần 14 – 20
của thai kỳ. Lơ lửng trong dịch ối là các tế bào của thai, chúng có thể phát triển
trong nuôi cấy để phân tích NST, phân tích sinh hóa và sinh học phân tử [7].
2.1.2 Tế bào ối người
Năm 1966, Steele và Breg chứng minh được trong dịch ối người có chứa các tế
bào sống, có khả năng sinh sản phát triển khi nuôi cấy đủ để làm tiêu bản NST [42]
mặc dù các tế bào ối đã được đề nghị dùng để chẩn đoán phái tính và ngăn ngừa các
bệnh lý di truyền liên kết với giới tính từ 1960. Trong các năm sau đó, tế bào ối
được nuôi cấy để khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể thai nhi cũng như chẩn
đoán một số các bệnh biến dưỡng di truyền ở thai nhi [21], [29], [31], [44], [48].
Dịch ối người chứa lượng tế bào thay đổi tùy theo thai kỳ, trung bình chỉ 20% tế
bào tồn tại trong dịch ối ở thai 14-18 tuần [37]. Tổng số lượng và tỷ lệ các tế bào
quan sát được cũng khác nhau giữa các thai phụ khác nhau có cùng thời gian thai
kỳ. Số tế bào ở dịch ối ở 3 tháng giữa thai kỳ khoảng 10 – 1000 tế bào/µl. Mức dao
động còn lớn hơn khi xét các thai có các biểu hiện bệnh lý [23]. Mặt khác, số lượng
tế bào của thai hiện diện trong dịch ối tăng theo tuổi thai, nhưng thai kỳ tăng cũng
làm tăng lượng tế bào không có khả năng phát triển. Những mẫu lấy ở thai 12 tuần
có thể có ít tế bào nhận được sau khi ly tâm, nhưng lượng lớn trong số chúng có khả
năng phát triển. Dù những mẫu dịch ối 20 tuần sau ly tâm có thể cho nhiều cặn tế
bào, nhưng đa số chúng là tế bào chết [39]. Các tế bào ối người khác nhau về nguồn
gốc, hình dạng, kích thước, tỷ lệ nhân/tế bào chất, đặc điểm tế bào chất, thuộc tính
bề mặt tế bào và đặc điểm sinh hoá [15]. Một loạt các nghiên cứu được thực hiện từ
những năm 1980 phát hiện trong dịch ối người có các tế bào của cả 3 lớp mầm -
ngoại bì, trung bì và nội bì - tùy theo tuổi thai và tình trạng bệnh lý của thai. Tuy

5
nhiên nguồn gốc phôi thai của từng loại tế bào trong dịch ối vẫn chưa được biết rõ

6
không đều, thỉnh thoảng có 2 nhân hay có tỷ lệ nhân/tế bào chất cao, và dạng
nguyên bào sợi [10].
Chỉ lượng nhỏ tế bào trong dịch ối có khả năng phát triển và sinh sản trong điều
kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm cho mục đích chẩn đoán, mặt khác có thể
nhiều tế bào ối đặc biệt vẫn sống nhưng không sinh sản hay hình thành cụm do chu
kỳ tế bào đã ngừng, hoặc ở trạng thái biệt hóa hay do tế bào quá già. Vì lý do đó,
thời gian sau này, Kaviani và đồng sự (2001) khi phân loại các tế bào nuôi cấy từ
dịch ối đã xét đến các khía cạnh bao gồm kiểu hình, tiêu chuẩn sinh hóa và đặc
điểm phát triển, họ đã phân loại các tế bào ối phát triển được và hình thành cụm
trong điều kiện nuôi cấy thông thường thành 3 nhóm chính [23]: tế bào dạng biểu
mô (epitheloid - loại E), tế bào đặc trưng của dịch ối (amniotic fluid specific - loại
AF) và tế bào dạng nguyên bào sợi (fibroblastic - loại F). Tế bào loại AF và E xuất
hiện ngay từ khi bắt đầu nuôi cấy. Tế bào loại AF vẫn tiếp tục tồn tại trong suốt quá
trình nuôi trong khi loại E giảm đáng kể. Tế bào loại F không hình thành cụm trong
mỗi mẫu ối, chúng thường xuất hiện trễ hơn trong quá trình nuôi cấy. Mặc dù người
ta tin rằng vẫn còn nhiều điều chưa biết về nguồn gốc của 3 loại tế bào, tế bào loại E
được cho rằng có nguồn gốc từ da và nước tiểu của thai, tế bào AF từ màng thai và
lá nuôi phôi, còn tế bào loại F từ mô sợi liên kết và nguyên bào sợi của da. Tế bào
AF sản xuất estrogen, hCG và progesterone. Điều này gợi ra giả thiết là các tế bào
này có nguồn gốc từ mô lá nuôi phôi. Dựa vào việc không sản xuất hóc-môn, các tế
bào F được coi là có nguồn gốc từ trung mô [47]. Tế bào biểu mô ối cấu thành lớp
trong của màng ối, và được hình thành từ nguyên bào ối vào ngày thứ 8 sau thụ
tinh, chúng từ lâu được cho rằng không để lộ rõ tiềm năng biệt hóa thành các loại cơ
quan khác nhau, bao gồm tim, gan và não. Đáng chú ý, tế bào biểu mô ối được
chứng minh biểu hiện chỉ thị của tế bào nguồn gốc thần kinh và tế bào thần kinh
đệm [35].
Tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ dịch ối đã được phân lập từ dịch ối thu
vào 3 tháng giữa thai kỳ nhờ quy trình nuôi cấy 2 giai đoạn do nhóm tác giả Tsai


- Đặc biệt, vào năm 1948, Sanford và cộng sự cho rằng các tế bào đơn có thể phát
triển trong môi trường dịch nuôi; và Eagle (1955) khẳng định hỗn hợp các axit
amin, vitamin, các co-factor, carbonhydrat, muối và bổ sung thêm huyết thanh có
thể dùng nuôi cấy tế bào, thay thế các dịch chiết mô phức tạp, điều này đã mở ra
thời kỳ mới trong nuôi cấy tế bào in vitro [7].
Các điều kiện khi nuôi cấy tế bào in vitro:
- Môi trường nuôi với các thành phần hóa học xác định: nhiều công thức môi
trường nuôi khác nhau được phát triển cho phù hợp với nhu cầu các loại tế bào khác
nhau. Các môi trường nuôi thường bao gồm các chất như carbohydrat, axit amin,
vitamin, hóc-môn, các nhân tố tăng trưởng, các nguyên tố vi lượng, muối với nồng
độ đẳng trương và hệ đệm để ổn định pH. Đa số môi trường nuôi cấy tế bào động
vật đều cần bổ sung huyết thanh. Huyết thanh cũng chứa các nhân tố bám dính ở
dạng hòa tan như fibronectin, vì thế ngoài tác dụng bổ sung thêm chất dinh dưỡng,
cung cấp các nguyên tố vi lượng, cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng, huyết
thanh còn có tác dụng giúp các tế bào nhanh chóng bám vào bề mặt nuôi.
- Điều kiện nuôi cấy: thông thường các tế bào động vật phát triển tốt nhất ở
nhiệt độ ấm (36-39
0
C). Mặt khác, môi trường cần được thông khí liên tục đủ đáp
ứng nhu cầu chuyển hóa thông thường của tế bào hiếu khí, đặc biệt là tỷ lệ của O
2
,
CO
2
, N
2
cần được phối trộn để tạo ra các phân áp khí thích hợp cho từng loại tế bào.
Nồng độ CO
2
trong tủ cấy thường là 5%.

- Đặc điểm môi trường nuôi cấy: mỗi loại môi trường có hàm lượng các chất
dinh dưỡng khác nhau do đó làm ảnh hưởng đến thời gian và hiệu quả nuôi cấy.
- Sự có mặt các nhân tố sinh trưởng, ví dụ như transferrin, selenium, insulin,
triiodothyronine, glucagon, nhân tố phát triển nguyên bào sợi, hydrocortisone,
testosterone, estradiol, progesterone. Mỗi nhân tố sinh trưởng kích thích sự phát
triển 20-76%, với sự kết hợp từ 2-10 yếu tố, sự phát triển có thể tăng lên 48-213%.

10
2.3.2. Giới thiệu một số phương pháp nuôi cấy tế bào ối
Có 2 phương pháp nuôi cấy tế bào ối chính, đó là nuôi cấy bằng bình cấy flask
và nuôi cấy in situ. Trong đó nuôi cấy in situ gồm phương pháp nuôi cấy trên lá
kính đặt trong đĩa cấy (đĩa petri) hoặc nuôi cấy trên slide flask (flaskette).
Nuôi cấy tế bào ối trên bình cấy flask là phương pháp được thực hiện sớm nhất,
tuy nhiên phương pháp này cần thời gian nuôi cấy dài (trước đây thời gian nuôi cấy
là 2-3 tuần) và lượng môi trường sử dụng lớn (4-5ml). Nhu cầu thực hiện nuôi cấy
tế bào ối nhanh chóng cho mục đích chẩn đoán dẫn đến kết quả ra đời các bình cấy
và môi trường nuôi cấy mới [49].
Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên slide flask (flaskette) được ứng dụng
rộng rãi trong đầu những năm 1980 [13], [57]. Với dụng cụ nuôi cấy mới, quy trình
nuôi cấy và thu hoạch cũng có thay đổi, thể hiện ưu điểm của phương pháp này,
trong đó rõ nhất ở việc giảm thể tích môi trường sử dụng (khoảng 2ml) và rút ngắn
thời gian xử lý thu hoạch mẫu tạo tiêu bản NST. Khi thu hoạch tại chỗ, lượng cụm
NST kỳ giữa bị mất đi sẽ giảm đáng kể so với thu hoạch tế bào huyền phù, do đó số
cụm NST có được để khảo sát số lượng và cấu trúc NST tăng lên. Cùng với sự phát
triển các môi trường nuôi cấy mới, slide flask góp phần rút ngắn thời gian nuôi cấy
từ 2-3 tuần xuống còn từ 1 tuần đến 10 ngày [49]. Tuy nhiên giá thành slide flask
cao hơn nhiều so với bình cấy thông thường nên thời gian sau đó, các nhà nghiên
cứu tiếp tục tìm kiếm các dụng cụ nuôi cấy mới rẻ tiền và có nhiều ưu điểm hơn,
phục vụ cho các mục đích nuôi cấy khác nhau.
Phương pháp nuôi cấy tế bào ối in situ trên giá thể lá kính trong đĩa petri được

hành vi hay phân loại bệnh bạch cầu, u bạch huyết và các loại u bướu để chẩn đoán
chính xác, xác định cách điều trị.

12
Quá trình tạo NST đồ bắt đầu bằng giai đoạn nuôi cấy các tế bào mẫu xét
nghiệm; các tế bào từ mẫu máu, tuỷ xương, dịch ối hay khối u được nuôi cấy
khoảng 4-7 ngày. Sau khi tế bào phát triển và nhân lên, phân chia tế bào bị làm
ngưng lại bằng cách thêm colchicine, chất làm phá hủy thoi phân bào. Tế bào sau
đó được xử lý tiếp tục với dung dịch nhược trương làm cho nhân phồng lên và tế
bào vỡ ra. Nhân sau đó được xử lý với chất cố định, thường là dung dịch carnoy (3
methanol: 1 acid acetic), nhỏ lên phiến kính và xử lý với các thuốc nhuộm giúp phát
hiện các đặc điểm cấu trúc của NST.
2.4.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng tiêu bản NST tạo NST đồ
Chất lượng tiêu bản NST tạo NST đồ được đánh giá dựa trên các chỉ tiêu bao
gồm số cụm NST kỳ giữa và chất lượng cụm NST kỳ giữa. Trong đó, chất lượng
cụm NST được đánh giá dựa trên độ sạch (mức độ còn sót lại của tế bào chất và
màng trong cụm NST), và độ bung của cụm NST.
Hliscs và cộng sự (1997) khẳng định quá trình bung của NST là quá trình diễn ra
chậm làm duỗi căng NST [19]. Quá trình bung bao gồm sự phồng lên đáng kể do
nước gây ra ở tế bào nguyên phân trong khi chất cố định bay hơi khỏi bề mặt phiến
kính [16]. Mức độ bung của NST tế bào ối nuôi cấy thứ cấp hay nuôi cấy sơ cấp in
situ đều phụ thuộc nhiều yếu tố, trong số đó thời gian bay hơi của chất cố định được
coi là quan trọng nhất. Thời gian bay hơi phụ thuộc thành phần của chất cố định, độ
ẩm tương đối, sức gió và nhiệt độ xung quanh (Spurbeck và cộng sự, 1996) [41], 2
yếu tố cuối có thể được điều khiển bởi việc sử dụng phòng đặc biệt điều chỉnh tiểu
khí hậu [27] hay phòng thu hoạch NST (chromosome harvest chamber). Trong đó,
khi thu hoạch in situ, nhiệt độ xung quanh không ảnh hưởng chất lượng cụm NST
(Raddatz, 2005). Tuy nhiên các yếu tố nói trên chỉ tác động một cách giới hạn.
Trong giới hạn cho phép, các điều kiện này không phải yếu tố quyết định [54].
2.4.2. Kỹ thuật hiện băng (Banding techniques)

trong rượu, chloroform và DMSO đến 10mg/ml. Demecolcine có tác dụng ngăn cản
trùng hợp vi ống bằng cách liên kết với tubulin ở cực dương [52], gây giải trùng
hợp vi ống, ức chế nguyên phân gây đồng bộ hóa các tế bào ở kỳ giữa, ngăn cản sự
tách tâm động trong phân bào, ức chế sự di cư tế bào, hỗ trợ khoét nhân noãn trong
kỹ thuật chuyển nhân tạo dòng phôi vô tính và kích thích sự phát triển của phôi sau
chuyển nhân. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cũng cho thấy xử lý với demecolcine
làm tăng tỷ lệ bất thường NST trong phân bào [36].
2.5.2. Cơ chế tác dụng
Demecolcine tác động lên sự phân bố “phức hợp thúc đẩy kỳ sau” (Anaphase-
Promoting Complex – APC) là phức hợp protein gồm nhiều tiểu phần quan trọng
cho điều hòa chu kỳ tế bào, thông qua đó tác động làm ngưng tế bào ở pha S hay G,

Demecolcine (N-Deacetyl-N-methylcolchicine C
21
H
25
NO
5
) [56]

15
ngăn cản sự tách tâm động (Castro và cộng sự, 2005 [12], Chau và cộng sự, 1989
[14], Peters, 2002 [34]).
Demecolcine là gây giải trùng hợp vi ống bằng 2 cơ chế phân biệt. Vi ống có
cấu trúc phân cực với cực dương và cực âm, thường cực âm được giữ chặt với tâm
động trong tế bào động vật [45]. Demecolcine ngăn cản trùng hợp vi ống bằng cách
liên kết với tubulin ở cực dương [52].Với nồng độ rất thấp nó liên kết với tubulin ở
cực dương và không cho phép cộng thêm các nguyên sợi, ngăn chặn động học vi
ống [22], [25], do đó liên quan đến khả năng demecolcine ức chế sự trùng hợp các
nhị hợp tubulin, ức chế sự tạo thoi vô sắc mà không gây một tác động đáng kể nào

hoạt hóa bất thường của các phần bề mặt tế bào, ức chế di cư tế bào. Demecolcine
cũng tác động mạnh đến sự tổng hợp DNA trong tế bào khi nuôi cấy mật độ dày
[17].
Một vài nghiên cứu cho thấy khả năng đáp ứng với demecolcine khác nhau giữa
tế bào thường và tế bào khối u. Chỉ số phân bào trong nuôi cấy dòng tế bào khối u
người bắt đầu tăng ngay khi thêm thuốc, nhưng với dòng tế bào bình thường, chỉ số
phân bào không tăng trong 2-3 giờ sau khi thêm colcemid [28]. .
2.6. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ỐI NGƯỜI
TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
2.6.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, việc chọc ối được thực hiện từ những năm 1930 để phục vụ chẩn
đoán các bất thường di truyền của thai nhi. Các nghiên cứu nuôi cấy tế bào ối cho
chẩn đoán trước sinh phát triển mạnh vào nửa cuối thế kỷ XX.
Năm 1966, Steele và Breg chứng minh nước ối ở người có chứa một số tế bào
còn sống, các tế bào này nếu cấy sẽ có khả năng sinh sản, phát triển với lượng đủ để
làm tiêu bản nhiễm sắc thể. Những năm sau đó, tế bào nước ối được lấy để cấy và
khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể thai nhi và chẩn đoán một số các bệnh biến
dưỡng di truyền ở thai nhi [9].

17
Năm 1983, Tabor, Lind và các cộng sự (Đan Mạch) đăng bài báo về một loại
phương tiện nuôi cấy tế bào ối mới, gọi là flaskette, giúp thu hoạch và chuẩn bị tiêu
bản NST nhanh hơn so với nuôi bằng bình cấy thông thường [57].
Zheng và cộng sự (2002) khi tìm kiếm phương pháp nuôi cấy làm tăng tỷ lệ
thành công khi nuôi cấy tế bào ối đã tiến hành khảo sát việc nuôi cấy trên in situ
flask. Kết quả nhận được tỷ lệ thành công là 100%, khả năng phân tích NST đồ tốt
[51].
Raddatz và các cộng sự (2005) đã báo cáo một chuỗi nghiên cứu về các yếu tố
đến quá trình nuôi cấy và thu hoạch in situ tế bào ối và gai nhau, bao gồm đánh giá
tác động của thể tích dịch ối, loại môi trường lên thời gian và số cụm tế bào trong