Sự tinh chế và đặc điểm của
Sự tinh chế và đặc điểm của
serin protease từ khuẩn
serin protease từ khuẩn
Bacillus Laterosporus AK1
Bacillus Laterosporus AK1
kiềm,
kiềm,
chịu nhiệt
chịu nhiệt
Tóm tắt.
Tóm tắt.
Một loại protease kiềm , chịu nhiệt , ngoại bào phân lập từ Bacillus
Một loại protease kiềm , chịu nhiệt , ngoại bào phân lập từ Bacillus
Laterosporus _ AK1 được làm sạch bởi phương pháp lọc gel G – 200 và những
Laterosporus _ AK1 được làm sạch bởi phương pháp lọc gel G – 200 và những
kĩ thuật của phép sắc ký trao đổi ion cenlulo DEAE.
kĩ thuật của phép sắc ký trao đổi ion cenlulo DEAE.
Chế phẩm protease thể hiện độ hoạt động tương đối lớn 100% trong chất
Chế phẩm protease thể hiện độ hoạt động tương đối lớn 100% trong chất
nền cozein và xuất hiện như một vạch đơn dựa vào kĩ thuật điện di với phân tử

khuẩn que Bacillus kiềm và trung tính thoe phương pháp tổ hợp trung gian.
Tuy nhiên có một vài báo cáo dựa trên sản phẩm của protease có tính kiềm bởi
khuẩn que Bacillus trong phương pháp nhân tạo.
Protease của vi khuẩn tiêu biểu cho một trong những lớp lớn nhất của những enzym
công nghiệp, khoản 40% tổng enzym bán ra trên thế giới . Vi khuẩn thể hiện tốt nhất
nguồn gốc của enzym bởi những nét đắc trưng của nó.

Ví dụ:
Ví dụ:

Sự rộng lớn hay tính đa dạng của hóa sinh, phát triển nhanh ,yêu cầu về không
Sự rộng lớn hay tính đa dạng của hóa sinh, phát triển nhanh ,yêu cầu về không
gian nuôi cấy hạn chế. Như là sự không ràng buộc nơi enzym có thể di truyền
gian nuôi cấy hạn chế. Như là sự không ràng buộc nơi enzym có thể di truyền
nguồn gốc để sinh sản ra enzym mới cho những ứng dụng khác nhau.
nguồn gốc để sinh sản ra enzym mới cho những ứng dụng khác nhau.
Mặc dù, sự khác nhau của sự phân giải protein và những vi khuẩn đã biết nhưng
chỉ một vài trong chúng cung cấp độ họat động (lớn) với những thành công trong
thương mại. Bacillus được khai thác một cách rộng lớn phục vụ cho sự sản xuất
protease.
Protease kiềm đựơc ứng dụng rộng rãi trong một vài ngành công nghiệp như là
thuốc làm sạch áo quần trong tiệm giặc ủi, sự thu hồi hoặc hòa tan protein, sự làm
mềm thịt, trong công nghiệp đồ da và các cơ sở tổng hợp nhân tạo.

Nói chung, protease kiềm là tế bào ngoài tự nhiên và tham gia vào quá trình lên
Nói chung, protease kiềm là tế bào ngoài tự nhiên và tham gia vào quá trình lên
men bởi vi sinh vật. Như vậy việc đơn giản quá trình sử lý của enzym được so sánh với


Vật liệu và phương pháp.
Vật liệu và phương pháp.
Sephadex G – 200, DEAE là những chất ức chế enzym xenluloza và protease
Sephadex G – 200, DEAE là những chất ức chế enzym xenluloza và protease
được mua từ sigma của Mĩ và là phân tử đánh dấu cho sự phân tích điện di đạt
được mua từ sigma của Mĩ và là phân tử đánh dấu cho sự phân tích điện di đạt
được từ Genei Banglore, India. Tất cả các hóa chất khác cần thiết trong những
được từ Genei Banglore, India. Tất cả các hóa chất khác cần thiết trong những
bước phân lập.
bước phân lập.
Sự phân lập Bacillus Laterosporus – AK1.

Những mẫu đất thu thập được từ sự phân hủy chất hữu cơ tại Ariyalur, Tamiler Nadu,
ẤnĐộ ,được pha loãng trong dung dịch muối vô trùng. Những mẫu đã pha loãng được
đặt ở trong môi trường thạch sữa bao gồm: dung dịch protein 0.1% dung dịch Nacl
0.5%, ván sữa 10% và thạch sữa 2.0%. Những đĩa đó được ủ ở nhệt độ 600
o
C trong
vòng 24h.
Khi sữa đã thủy phân hoàn toàn thì bổ sung thêm enzym protease đã được xác
định là sản phẩm của cơ thể sinh vật. Dựa vào vùng phát quang, một dòng vi khuẩn sẽ
được chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.Dòng vi khuẩn phân giải protein là một bào
tử có dạng Gram dương được xác định như loài B .laterosporus và nó có cấu trúc như B.
laterosporus- AK1( Holt và cộng sự 1994.).
Sản xuất enzyme
Sản xuất enzyme

2.
2.
H
H
2
2
O 0.05% với PH = 9 và duy trì ở nhiệt độ 37
O 0.05% với PH = 9 và duy trì ở nhiệt độ 37
0
0
C trong
C trong
48h trong tủ định ôn (120rpm). Sau khi hoàn thành quá trình lên men toàn bộ men
48h trong tủ định ôn (120rpm). Sau khi hoàn thành quá trình lên men toàn bộ men
cho li tâm ở 1000g tại 4
cho li tâm ở 1000g tại 4
0
0
C và dịch nỗi lên trên bề mặt được thu lại và sử dụng như
C và dịch nỗi lên trên bề mặt được thu lại và sử dụng như
một nguồn enzym.
một nguồn enzym.
Sự phân tích enzyme và xác định protein.
Sự hoạt động của enzym protease kiềm được xác định bằng phương pháp
củaTruchia và công sự (1986). Mỗi lần hoạt động của enzym protease được định nghĩa
bằng một lượng enzym cần thiết để phân giải một μ mol tryrosine trong 30 phút ở nhiệt
độ 45
0
C. Hoạt động đặc biệt này được mô tả bằng những đơn vị/mg protein. Số lượng
protein của mẫu được xác định bằng phương pháp nhuộm liên kết của Brad –for (1976)

Mẫu enzym đã cô đặc được đưa lên một cột phản ứng trao đổi ion của xenluloza.
DEAE (2.5cm x 22cm),được cân bằng với 50 M Tris HCl, độ PH = 9 và được làm sạch cùng
với cùng một bộ đệm.
.
Tinh chế enzyme

Phương pháp điện di chất Gel SDS –
Phương pháp điện di chất Gel SDS –
polyacrylamide.
polyacrylamide.
Theo phương pháp của laemmh (1970) SDS – PAGE được thực hiện trên một
Theo phương pháp của laemmh (1970) SDS – PAGE được thực hiện trên một
tấm Gel đặc quánh chứa 8% (W/v) polyacrylamide. Theo phương pháp của Davis
tấm Gel đặc quánh chứa 8% (W/v) polyacrylamide. Theo phương pháp của Davis
(1964), PAGE tự nhiên được thực hiện trong chất Gel đặc quánh chứa 8% (W/v)
(1964), PAGE tự nhiên được thực hiện trong chất Gel đặc quánh chứa 8% (W/v)
polyacrylamide với bộ đệm Tris/Glyxin, độ Ph = 8.3.
polyacrylamide với bộ đệm Tris/Glyxin, độ Ph = 8.3.
Theo mô tả của Heusen và Dowdle (1980): protein được phát hiện có màu bạc
việc nghiên cứu Gel genlatin được thực hiện trong một tấm Gel đặc quánh polyacrylamide
chứa SDS và genlatin (0.1%) như một chất được trùng hợp hóa (như sự mô tả của Heusen
và Dowdle). Sau khi điện di chất Gel đặc quánh sẽ được làm trong Triton X – 100 (2.5%
v/v) trong 1 giờ ở nhiệt độ 40C để loại SDS và được ủ trong 0.05M bộ đệm Tris – HCl, độ
Ph = 9 trong 5 giờ ở nhiệt độ 50
0
C. Sau đó chúng được nhuộm màu xanh Coomass rực rỡ.
Nhóm những phần hoạt động được quan sát như một vùng genlatin không
màu,trong suốt nỗi bật trên nền màu xanh.
Enzyme được tách rửa như một đường thẳng tuyến tính của 0 – 0.5M NaCl trong
cùng một bộ đệm. Mỗi phần 3ml được tập hợp lại với tốc độ chảy 30ml/h bằng cách

cấy trong môi trường có cùng dung dịch đệm,trong 30 phút, ở các nhiệt độ khác
nhau (40-100
nhau (40-100
o
o
C).
C).
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme.
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme.Ảnh hưởng của ph đến hoạt tính của enzyme protease được xác dịnh bằng
Ảnh hưởng của ph đến hoạt tính của enzyme protease được xác dịnh bằng
phương pháp nuôi cấy enzyme tại 40 trong 30 phút tại các giá trị ph khác nhau.
phương pháp nuôi cấy enzyme tại 40 trong 30 phút tại các giá trị ph khác nhau.
để làm môi trường nuôi cấy người ta sử dụng các hệ đệm (nồng độ 0.05)
để làm môi trường nuôi cấy người ta sử dụng các hệ đệm (nồng độ 0.05)
sau:phosphate (ph 5.0-7.0),Tri-Hcl (ph 8.0-10.0) và glycine-NaOH (ph 11-12).
sau:phosphate (ph 5.0-7.0),Tri-Hcl (ph 8.0-10.0) và glycine-NaOH (ph 11-12).hoạt động của enzyme được duy trì ổn định khi nuôi cấy trong 30 phút,trong các
hoạt động của enzyme được duy trì ổn định khi nuôi cấy trong 30 phút,trong các
dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau (5.0-12.0) tại 40
dung dịch đệm có giá trị pH khác nhau (5.0-12.0) tại 40
o
o
C .
C .


khác nhau như: phenyl methyl sulphonyl flouride (PMSF),ethylene diamine tetra
khác nhau như: phenyl methyl sulphonyl flouride (PMSF),ethylene diamine tetra
acetic acid (EDTA), 2-mercaptoethanol và idoacetate được xác định bằng phương
acetic acid (EDTA), 2-mercaptoethanol và idoacetate được xác định bằng phương
pháp nuôi cấy enzyme trong 30 phút ở 40
pháp nuôi cấy enzyme trong 30 phút ở 40
o
o
C trước khi thêm chất nền.Hoạt động
C trước khi thêm chất nền.Hoạt động
liên quan được xác định dưới điều kiện chuẩn của thí nghiệm.
liên quan được xác định dưới điều kiện chuẩn của thí nghiệm.
Tính chất đặc trưng của chất nền.
Hoạt tính của protease với chất nền protein khác như: casein, Azocasein, BSA,
Egg albumin và Galatin được phân tích bởi sự pha trộn 10µg Của enzyme và 200µl của
phép phân tích hệ đệm có chứa chất nền (2mg /ml) . Phản ứng của hỗn hợp được xảy ra
ở 40oC trong 30 phút dưới điều kiện chuẩn của phép phân tích.

Độ bền của chất tẩy rửa.
Độ bền của chất tẩy rửa.Chất tẩy rửa được pha loãng đến nồng độ 8mg/ml phù hợp với điều kiện tẩy
Chất tẩy rửa được pha loãng đến nồng độ 8mg/ml phù hợp với điều kiện tẩy
rửa của Phadtare và cộng sự (1993). Sự tương thích của protease được kiểm tra
rửa của Phadtare và cộng sự (1993). Sự tương thích của protease được kiểm tra
với các chất tẩy rửa trong nghành thương mại đó là: ariel, Surf Excel, Tide và
với các chất tẩy rửa trong nghành thương mại đó là: ariel, Surf Excel, Tide và
Hekô .Chế phẩm protease có nồng độ 0,04mg/ ml được ủ ở 60
Hekô .Chế phẩm protease có nồng độ 0,04mg/ ml được ủ ở 60

trong 15 phút và được rửa bằng nước sạch một cách kĩ lưỡng với nước cất và
trong 15 phút và được rửa bằng nước sạch một cách kĩ lưỡng với nước cất và
được sấy khô . Xem xét kĩ bằng mắt những mẫu khác nhau đã làm.
được sấy khô . Xem xét kĩ bằng mắt những mẫu khác nhau đã làm.
Những kết quả và thảo luận.
Những kết quả và thảo luận.
Khuẩn que Laterosporus –AK1 cho thấy sự phát
Khuẩn que Laterosporus –AK1 cho thấy sự phát
triển cực đại và sự sản xuất enzyme lớn nhất
triển cực đại và sự sản xuất enzyme lớn nhất trong 36 giờ . Khi cho vào môi trường
trong 36 giờ . Khi cho vào môi trường
trung gian ở nhiệt độ phòng . Vi khuẩn này
trung gian ở nhiệt độ phòng . Vi khuẩn này
có mặt trong khu vực thuỷ phân trong
có mặt trong khu vực thuỷ phân trong
.môi trường trung gian thạch sữa.
.môi trường trung gian thạch sữa.
Sự tinh chế protease ngoại bào
Sự tinh chế protease ngoại bào
của B. Laterosporus- AK1.
của B. Laterosporus- AK1.
Tóm tắt các bước tinh chế tiếp theo
Tóm tắt các bước tinh chế tiếp theo
của protease kiềm

Bảng 1
Bảng 1
. Tóm tắt qúa trình tinh chế của protease kiềm từ B. Laterosporus-
. Tóm tắt qúa trình tinh chế của protease kiềm từ B. Laterosporus-
AK1.
AK1.
Sno các bước tổng độ tổng số hoạt động tinhchế Kết quả
Sno các bước tổng độ tổng số hoạt động tinhchế Kết quảhoạt động đặc trưng
hoạt động đặc trưng tinh chế tuyệt đối (U) protein(mg) (U/mg protein) fold được
tinh chế tuyệt đối (U) protein(mg) (U/mg protein) fold được
đạt
đạt
1.Nuôi cấy bề mặt 32400 452 71,6 1 100
1.Nuôi cấy bề mặt 32400 452 71,6 1 100
2.Kết tủa axeton 24230 120 201,9 2,8 74,7
2.Kết tủa axeton 24230 120 201,9 2,8 74,7
3. Sephadex 200 17840 32 557,6 7,7 55,0
3. Sephadex 200 17840 32 557,6 7,7 55,0
4. DEAE cellulose 11145 14 796,0 11,1 34,3
4. DEAE cellulose 11145 14 796,0 11,1 34,3
Xấp xỉ 11,1 folds của sự tinh chế được thực hiện từ sự nuôi cấy vi khuẩn

SDS- PAGE và việc nghiên cứu của chế phẩm proteaseVạch1: chế phẩm protease
Vạch1: chế phẩm proteaseVạch 2: phân tử khối chuẩn .
Vạch 2: phân tử khối chuẩn .Vạch 3:nghiên cứu hoạt tính chế phẩmenzyme
Vạch 3:nghiên cứu hoạt tính chế phẩmenzyme

Tính chất đặc trưng của chế phẩm
Tính chất đặc trưng của chế phẩm
enzyme
enzyme
Nhiệt độ tối thích và độ bền:
Nhiệt độ tối thích và độ bền:Protease thể hiện độ hoạt động cực đại ở 75
Protease thể hiện độ hoạt động cực đại ở 75
o
o
C
C
C, nhưng nhanh chóng
C, nhưng nhanh chóng
giảm ở nhiệt độ cao hơn, độ bền này cao hơn một ít
giảm ở nhiệt độ cao hơn, độ bền này cao hơn một ítso với protease kiềm tính. TheoKahayashi nhiệt độ (
so với protease kiềm tính. TheoKahayashi nhiệt độ (
o
o
C)
C)
và cộng sự : một protease kiềm tính từ
và cộng sự : một protease kiềm tính từ Fig3
Fig3Ảnh
Ảnhhưởng của nhiệt
hưởng của nhiệtđộ khác nhau
độ khác nhau

cực đại là pH=9
Một và báo cáo chỉ ra rằng pH tối thích cho,
Một và báo cáo chỉ ra rằng pH tối thích cho,
protease thu dược từ Xanthononas maltophila
protease thu dược từ Xanthononas maltophilavibrio metscnikovii
vibrio metscnikoviilà10,0 – 10,5, protease tương đối bền trong khoảng
là10,0 – 10,5, protease tương đối bền trong khoảngpH :7,0- 12,0.Enzyme thô thể hiện độ hoạt động
pH :7,0- 12,0.Enzyme thô thể hiện độ hoạt độngtương đối giống với chế phẩm enzyme độ pH
tương đối giống với chế phẩm enzyme độ pH
khi nhìn ở khía cạnh pH
khi nhìn ở khía cạnh pH

Fig 4:
Fig 4:
Ảnh hưởng của pH khác

Ion kim loại nồng độ tỉ lệ hoạt
động
độngvà chất ức chế của enzyme
và chất ức chế của enzyme
của nhóm ngoại và về bảnchất
của nhóm ngoại và về bảnchất
của trung tâm hoạt động . Trong những chất ức chế
của trung tâm hoạt động . Trong những chất ức chế
khác nhau thì iodoacetate gây
khác nhau thì iodoacetate gâyức chế mạnh nhất đến độ hoạt động của enzyme.
ức chế mạnh nhất đến độ hoạt động của enzyme.
Kế đến là 2-mercaptoethanol và EDTA (bảng 2).
Kế đến là 2-mercaptoethanol và EDTA (bảng 2).
Tuy nhiên PMSM cũng gây ức chế hoàn toàn .
Tuy nhiên PMSM cũng gây ức chế hoàn toàn .
Sự hoạt động của enzyme, nó đặc trưng cho hệ
Sự hoạt động của enzyme, nó đặc trưng cho hệ
Enzyme- cơ chất Serin protease. Điều này đã được
Enzyme- cơ chất Serin protease. Điều này đã được
nhận xét bởi Adinrayana và Ellaiah(2003) , North (1982),
nhận xét bởi Adinrayana và Ellaiah(2003) , North (1982),
Uchida và cộng sự (2004).
Uchida và cộng sự (2004).
Sự thuỷ phân của chất nền protein

rửa thương mại khác nhau được kiểm nghiệm .Sự bổ sung của enzyme trong chất tẩy rửa
Wheel đã cải thiện khả năng làm sạch vết đỏ máu (fig6) .

Những báo cáo ban đầu được làm trên sự bổ sung của enzyme với chất tẩy Wheelcó
Những báo cáo ban đầu được làm trên sự bổ sung của enzyme với chất tẩy Wheelcó
ý nhĩa cải thiện việc làm sạch và loại bỏ vết đỏ máu ( theo Adinarayanavaf cộng
ý nhĩa cải thiện việc làm sạch và loại bỏ vết đỏ máu ( theo Adinarayanavaf cộng
sự 2003).
sự 2003).

Fig6
Fig6
:
:
Khả năng của protease được tăng lên với chất tẩy rửa Wheel trong việc
Khả năng của protease được tăng lên với chất tẩy rửa Wheel trong việc
làm sạch
làm sạch
.
. (A). Vết đỏ máu trên áo quần được làm sạch với nước
(A). Vết đỏ máu trên áo quần được làm sạch với nước(B).Vết đỏ máu trên áo quần được làm sạch với chất tẩy rửa.

định tại pH kiềm , nhiệt độ cao , loại chất nền lớn và tính tương thích vơí
định tại pH kiềm , nhiệt độ cao , loại chất nền lớn và tính tương thích vơí
chất tẩy rửa thương mại . Những thuộc tính này cho biết công dụng của
chất tẩy rửa thương mại . Những thuộc tính này cho biết công dụng của
protease trong công nghiệp tẩy rửa .
protease trong công nghiệp tẩy rửa .
Lời cảm ơn
Lời cảm ơnChúng tôi xin chân thành cám ơn: Giáo sư N. Anand, D. Sc.,
Chúng tôi xin chân thành cám ơn: Giáo sư N. Anand, D. Sc.,giám đốcCAS trường đại học Thực vật học Madras đã cung cấpcho
giám đốcCAS trường đại học Thực vật học Madras đã cung cấpcho
phòng thí nghiệm những phương tiện cho sự nghiên cưú này .
phòng thí nghiệm những phương tiện cho sự nghiên cưú này .