Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các
lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng
enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500
triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4].
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme
đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy
phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản
xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để
làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế
biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn.
Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử
dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy
sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm
20-30% [6]. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme
nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế
enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và
hóa học khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau:
- Phương pháp kết tủa
- Phương pháp sắc ký
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 1
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
- Phương pháp phân tách hệ hai pha nước
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở
vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và
xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất

nghiệp (60%) [4].
1.2. Tổng quan về enzyme Protease.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 3
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
1.2.1. Giới thiệu chung.
Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân
liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)
n
trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm
cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân
liên kết este và vận chuyển axit amin.

Hình 1.1. Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ
tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ
dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 4
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường
có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease.
1.2.2. Phân loại Protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) .SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 5

subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và
thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,
một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường
hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 6
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và
thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 7
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Chương 2:
NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE
2.1. Nguồn động vật:
- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều
enzyme nhất.
- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công
nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa

protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6].
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất
(Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt
động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 9
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và
có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein
thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các
protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm.
Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và
một số giống thuộc chi Clostridium.

Hình 2.2. Clostridium
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử
từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH
rộng 7-12 .
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 10
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô

Hình 2.3. Bacillus
 Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả
năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp
chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.

những lợi ích chính như sau:
• Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
• Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc
nhiều lần quanh năm.
• Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định
hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).
• Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức
sản xuất.
Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc,
gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh
vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất,
chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 13
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Chương 3:
THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ
VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT
3.1. Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.
Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn.
Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn
chủ yếu
Hình 3.1. Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 14
Tuyển chọn và cải tạo giống
vi sinh vật
Phương pháp bảo quản giống
vi sinh vật
Tách và làm sạch chế phẩm
enzim

SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 15
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại ADN nào chớ không đòi hỏi phải là ADN
từ các giống họ hàng. Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn ADN nhất định,
thường không quá 10 đoạn. Các đoạn ADN được di truyền trong biến nạp có
M=10
6
-10
7
và phải có cấu trúc xoắn kép. Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều loài
vi khuẩn như: Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium,
Bacillus, Xantomonas.
3.1.1.3. Phương pháp tiếp hợp gene.
Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được truyền từ tế bào cho đến
tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy các vi sinh vật có khả năng
biến nạp thì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa. Hiện nay quá trình
tiếp hợp gene đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, salmonella,
Pseudomonas aeruginosa.
3.1.1.4. Phương pháp tải nạp
Vật liệu di truyền (ADN) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ
vai trò trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn
AND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận. Do
đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận.
3.1.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã
được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưu
ý đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian
có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy
chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu.
• Phương pháp cấy chuyền.