1. ENZYM GIỚI HẠN (restriction enzyme,
RE)
1.1. Tên gọi các enzym giới hạn
1.2. Các loại enzym giới hạn
1.3. Các RE loại II
2. MỘT SỐ ENZYM KHÁC THƯỜNG SỬ
DỤNG TRONG KỸ THUẬT SINH HỌC
PHÂN TỬ
Tế bào vi khuẩn bị phage phá hủy
Một số tế bào vi khuẩn không bị
phá hủy
do DNA của phage đoạn nhỏ
Enzym
(cắt)
phage
(thực
khuẩn thể)
(hiện tượng giới hạn)
phage
(thực
khuẩn thể)
Enzym giới hạn (Restriction enzyme, RE) :

có khả năng cắt DNA phage ở những vị trí nhất định

trên phân tử DNA.

Điều kiện hoạt động :
- nhiệt độ
- dung dịch đệm thích hợp

Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế
bào prokaryote.
Chưa có hệ thống nào tương đương
được phát hiện ở eukaryote.
1.1.Tên gọi các enzym giới hạn
Tên Giống Loài Chủng Thứ tự dòng
Escherichia coli Ry13
EcoR I E co R I
EcoR V E co R V
Serratia martesens
Sma I S ma I
Hemophilus aegypticus
Hae III H ae III
3 loại (dựa vào khả năng nhận biết và cắt một
trình tự xác định trên phân tử DNA):
Loại I
nhận biết được trình tự đặc hiệu, cắt cách vị trí
giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotid cắt tại đó
và phóng thích độ vài chục nucleotid.
Loại II
nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.
Loại III
nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó
khoảng 20 nucleotid về phía trước.

3’…GGG CCC…5’
không có khả năng tự kết hợp lại.
Để nối phải dùng enzym T4 DNA ligase

Cắt tạo đầu so le hay đầu dính (cohesive ends):
Các đầu so le có thể tự nối lại không cần DNA ligase,
được sử dụng rất nhiều trong công nghệ tái tổ hợp
1.3.3. Một số điều kiện cần lưu ý khi tạo một phản ứng thủy
giải bởi RE

Chú ý đến điều kiện nhiệt độ, pH và
dung dịch đệm thích hợp

Bảo quản ở -20
o
C RE sẽ giữ được hoạt
tính

Thể tích RE = 1/10 thể tích phản ứng
1.3.4. Ứng dụng

Nghiên cứu bộ gen của eukaryote.

Phương pháp tạo dòng (cloning)

Lập bản đồ giới hạn (restriction map)

Phân tích so sánh bộ gen ở các loài khác nhau
nhờ kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism, tính đa hình kích thước của các

cả chiều 5’
→
3’ và 3’
→
5’.

Vai trò:
- xúc tác sự tổng hợp một mạch đơn DNA mới
- sửa chữa sai sót trong quá trình nhân đôi
DNA.

Ứng dụng :
- Xác định trình tự DNA bằng phương
pháp dideoxynucleotid
- Tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao
- Thiết kế các vectơ từ DNA mạch đơn
- Trong thực tế, sử dụng đoạn Klenow
(Klenow fragment) có hoạt tính
polymerase và exonuclease 3’
→
5’,
không có hoạt tính exonuclease 5’
→
3’

T4 DNA polymerase

có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli.

Hoạt tính:


Xác định trình tự acid nucleic bằng phương pháp sử dụng các
dideoxynucleotid.

Trên thị trường, transcriptase ngược có nguồn gốc từ AMV
(Avian Myeloblastosis Virus) và MMLV (Moloney Murine
Leukemia Virus).
Terminal transferase

ly trích từ tuyến ức của bê

xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotid vào đầu
3’- OH tự do của phân tử DNA

Gắn ngẫu nhiên nên thành phần nucleotid của
chuỗi polynucleotid mới hình thành hoàn toàn phụ
thuộc nồng độ của 4 loại nucleotid có trong phản
ứng

Ứng dụng:

Thêm đuôi polynucleotid (tailing) để tạo đầu so le
cho phân tử DNA, dùng trong kỹ thuật tạo dòng
(cloning)

Đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phương
pháp xác định trình tự acid nucleic Maxam và
Gilbert
2.1.2. Các RNA polymerase
