ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH NGUYÊN PHÁT
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ
VÀO LAN DENDROBIUM CV. BURANA WHITE BẰNG VI
KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Chuyên ngành: DI TRUYỀN
Mã số: 60 42 70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ba mẹ, anh chị em và vợ tôi đã luôn luôn đồng hành, ủng hộ và nâng đỡ tôi
về mặt vật chất cũng như tinh thần. TP. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2012

Huỳnh Nguyên Phát

1

MỞ ĐẦU

Họ Phong Lan là một họ lớn của thực vật có hoa, gồm hơn 800 giống và 30.000
loài, đặc biệt là hoa rất đẹp. Có rất nhiều loài Phong Lan đã được thương mại hóa
trên thế giới, trong số đó có Dendrobium. Dendrobium là một trong những giống
lan thương mại quan trọng được trồng phổ biến dùng như hoa cắt cành lẫn cây
trồng chậu bởi hoa đẹp, dễ trồng và thích ứng với phổ khí hậu rộng.
Việc áp dụng các kỹ thuật di truyền vào thực vật mở ra cơ hội có thể đưa các
tính trạng mới mong muốn vào Phong Lan. Kết quả đã tạo ra rất nhiều giống lan
mới không chỉ có giá trị kinh tế mà còn góp phần làm tăng thêm tính đa dạng cho
Phong lan. Tuy có nhiều phương pháp chuyển gen khác nhau vào thực vật, nhưng
hai phương pháp chuyển gen thường được sử dụng nhiều nhất, đó là phương pháp
chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và phương pháp chuyển gen gián tiếp
thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược
MỤC LỤC Trang phụ bìa
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC BIỂU ĐỒ


1.9.1 Xử lý mẫu 25
1.9.2 Thời gian đồng nuôi cấy và mật độ A. tumefaciens 25
1.9.3 Làm khô mẫu cấy 26
1.9.4 Xử lý với chất chống hoại tử 26
1.9.5 Nhiệt độ 27
1.9.6 Chất hoạt động bề mặt 27
1.9.7 Môi trường ủ và môi trường đồng nuôi cấy 27
1.9.8 Kháng sinh 28
1.9.9 Marker chọn lọc 30
1.10 Ứng dụng plasmid Ti trong công nghệ chuyển gen ở thực vật 30
1.11 So sánh phương pháp bắn gen với phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn
A. tumefaciens 32
1.12 Cấu trúc của gen chuyển nạp 32
1.12.1 Promoter và terminator 32
1.12.2 Gen chọn lọc (selectable gene) 33
1.12.3 Gen chỉ thị (reporter gene) 34
1.13 Một số phương pháp phát hiện gen chuyển 35
1.13.1 Phương pháp thử GUS 35
1.13.2 Phương pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ (PPT)
của cây tái sinh trong in vitro 35
1.13.3 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 35
1.14 Tình hình nghiên cứu thực vật chuyển gen 37
1.14.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen lan Dendrobium trên thế giới 37
1.14.2 Tình hình nghiên cứu chuyển gen thực vật ở Việt Nam 39
2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 41
2.1 Vật liệu thí nghiệm 41
2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 41
2.1.2 Môi trường nuôi cấy 41
2.1.3 Chủng vi khuẩn A. tumefaciens 41
2.1.4 Thiết bị và hóa chất thực hiện chuyển nạp gen bằng A. tumefaciens 42

BURANA WHITE chuyển gen 74
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 78
4.1 Kết luận 78
4.2 Đề nghị 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO 80
DANH MỤC CÔNG TRÌNH 90
PHỤ LỤC 91 Chương 1
TỔNG QUAN
3

1. TỔNG QUAN
1.1 Sơ lƣợc về họ Lan

Giống Dendrobium có khoảng trên 1600 loài và đã được lai tạo thêm nhiều
giống mới với hình thái và cấu tạo hết sức phức tạp, đa dạng. Dendrobium được
tìm thấy ở Đông Bán Cầu, trải dài từ Australia, xuyên suốt Nam Thái Bình Dương,
Philippines, Ấn Độ, và xuất hiện một ít ở Nhật Bản và nhiều nhất ở Đông Nam Á.
Ở Việt Nam, Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông và được phân biệt
bằng thân (giả hành), lá và hoa.
1.2.3 Đặc điểm hình thái Dendrobium [4]
Dendrobium là lan đa thân, có hoa bên nách, nhiều nhánh, sống lâu năm, tăng
trưởng không liên tục, có thời gian nghỉ sau mùa tăng trưởng và thường sống trên
những cây gỗ lớn với bộ rễ khí sinh. Do phân bố rộng nên hình thái rất đa dạng.
Nhìn chung, các giống Dendrobium đều có cơ quan sinh dưỡng là thân, giả hành,
lá và rễ; cơ quan sinh sản là hoa, hạt, trái (quả).
 Thân
Dendrobium thuộc nhóm đa thân, nhánh nằm ngang, bò dài trên giá hoặc nằm
sâu trong đất, gọi là thân rễ. Kích thước thân dao động từ 0.1-0.2m đến 3-4m,
mang rễ và lá. Phát hoa mọc trên thân ở các nách lá, song song với lá và thẳng góc
với rễ. Thân nhẵn hay có nhiều vảy (do thoái hóa) và một phần thẳng đứng mang lá.
Các lá này bao nhau hợp thành thân giả (giả hành).
 Giả hành
Giả hành là những đoạn phình to, bên trong là các mô mềm chứa dịch nhầy làm
giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng. Ngoài ra, giả hành còn chứa diệp lục
tố nên có khả năng quang hợp. Giả hành có hình dạng và kích thước rất đa dạng:
nhỏ hoặc lớn, hình cầu, thuôn dài hay hình trụ xếp chồng lên nhau, tạo thành thân
5

giả. Trên thân giả, có nhiều mắt ngủ nên có thể nhân giống nhanh bằng phương
pháp tách chiết. Một số loài ở xứ lạnh chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên
giả hành không có màu xanh.
 Lá
Lá mọc xen, hình giáo thuôn dài thành bẹ ôm lấy thân, màu xanh bóng, đậm và

1.3 Các phƣơng pháp nhân giống
1.3.1 Phƣơng pháp tách chiết
Thời điểm tách chiết tốt nhất đa số các loài lan là vào đầu mùa tăng trưởng.
Những vùng có khí hậu bốn mùa (xuân, hạ, thu, đông) rõ rệt thì thời điểm tách
chiết là vào đầu mùa xuân (như ở miền Bắc). Những vùng có khí hậu bốn mùa
không rõ rệt và có hai mùa là mùa khô và mùa mưa, thì thời điểm tách chiết là vào
đầu mùa mưa. Nếu kiểm soát được nhiệt độ trong vườn ươm hay trong nhà kính thì
có thể tách chiết quanh năm. Thường tách ba giả hành thành một đơn vị trồng [4].
1.3.2 Phƣơng pháp gieo hạt
 Phương pháp gieo hạt nhờ nấm cộng sinh
Hạt lan rất nhỏ, không có chất dinh dưỡng dự trữ để tự nảy mầm nên không thể
gieo như cách thông thường, mà hạt phải cộng sinh với nấm chuyên biệt để cung
cấp chất dinh dưỡng (chủ yếu là đường). Khi đó, hạt mới có thể nảy mầm [4].
 Phương pháp gieo hạt không cần nấm cộng sinh
Phương pháp này được thực hiện trong điều kiện vô trùng của phòng thí
nghiệm: hạt sau khi được rửa sạch và được khử trùng sẽ được gieo trên môi trường
gieo hạt giàu khoáng và dinh dưỡng. Khi lan con được 4 lá và rễ dài thì đem ra
trồng. Phương pháp này đơn giản, ít tốn kém và tỷ lệ nảy mầm cao [7].
 Phương pháp gieo hạt xanh
Hai phương pháp trên không thể áp dụng cho những loài từ sự lai bất thường
giữa hai loài xa nhau vì thời gian hạt chín lâu (6 tháng đến 1 năm). Vì trái lan còn
xanh, vỏ trái chưa bung ra nên hạt bên trong chưa bị nhiễm bệnh và chỉ cần khử
trùng một lần, sau đó cấy lên môi trường gieo hạt [4].
7

1.3.3 Phƣơng pháp lai tạo
Chọn các cây bố mẹ cùng loài. Sau đó, dùng tăm tre vô trùng ấn vào nhị đực và
đưa sang quệt vào bề mặt nuốm nhụy cái. Tiếp đó, đem cây mẹ để riêng, không
tưới nước, bảo quản thật tốt, không để côn trùng bay vào thụ phấn. Sau khi thụ
phấn thành công, cần bón phân chứa nhiều phospho và đem ra ngoài để trồng [7].

1.4 PLB (Protocorm-Like Body)
1.4.1 Thuật ngữ
 Thuật ngữ Protocorm
Protocorm là thuật ngữ được đặt ra đầu tiên bởi nhà quản lý Melchoior Treub
của vườn bách thảo Bogor, Indonesia (hiện nay là vườn Kebun Raya). Ông dùng từ
này để chỉ ra một giai đoạn phát triển của rêu (Treub, 1890). Sau đó, Noel Bernard
(1899-1910) dùng protocorm cho các cây họ Lan. Hiện nay, protocorm dùng để mô
tả những cấu trúc hình cầu nhỏ hình thành từ hạt lan, có vài lông hút đơn bào và
mô phân sinh ở đỉnh. Các thể có cấu trúc tương tự hình thành từ các mẫu cấy in
vitro không được gọi là protocorm. Các tế bào bề mặt protocorm duy trì tiềm năng
của các tế bào phôi, từ đây chúng phát khởi tạo nhiều điểm sinh trưởng bất định
[4][75][81]
 Thuật ngữ PLB
PLB (Protocorm-Like Body) là thuật ngữ dùng để chỉ các thể có cấu trúc tương
tự protocorm, được hình thành từ mô nuôi cấy hoặc mô sẹo in vitro. Thuật ngữ này
được ông Georges Morel sử dụng đầu tiên khi nuôi cấy chồi đỉnh. PLB là một thể
có tổ chức, có thể tái sinh nhiều PLB mới và có thể tái sinh thành chồi. Hiện nay,
PLB là nguồn nguyên liệu để nhân nhanh lan và thường dùng trong chuyển gen [4].
1.4.2 Các nguồn nguyên liệu tạo PLB
Mô lá (in vitro), nốt phát hoa, chồi (in vitro), rễ, chóp rễ, phát hoa
1.5 Cách trồng và chăm sóc lan Dendrobium
1.5.1 Điều kiện sống của Dendrobium [4][8]
 Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp từ 25-30
0
C, một số thì khoảng 18-22
0
C [8]. Dendrobium ưa
vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm
9

 Giá thể
Dendrobium là loài phụ sinh, sống trên nhiều loại giá thể như xơ dừa, dớn, than
củi, vỏ cây khô, có thể sử dụng cả mút xốp làm giá thể. Giá thể phải xốp, thoáng
khí và không giữ nước quá lâu.
 Thay chậu
Lan Dendrobium trồng cỡ 2 năm thì giả hành phát triển, mọc lan ra ngoài nên
cần phải thay chậu và cần tách chiết ra để nhân giống.
10

 Sâu bệnh
Việc bón phân hữa cơ hay dùng giá thể xơ dừa (sẽ mục nát sau một thời gian
nào đó) là nguyên nhân chủ yếu tạo điều kiện cho gián, rệp, côn trùng cắn phá,
nấm và virus… gây hại cho cây lan. Do đó, cần phải theo dõi thường xuyên để
phòng trừ mầm bệnh một cách nhanh chóng và hiệu quả.
1.5.2 Cách trồng lan Dendrobium
 Trồng cây con từ tách chiết
Các lan con từ việc tách chiết được trồng trong chậu nhựa hoặc đất nung, bên
trong có thể là than củi, xơ dừa hoặc xốp. Cũng có thể trồng thành luống bằng vỏ
dừa già. Buộc cây lan vào một cái nẹp, gốc lan giáp với xơ dừa. Tưới nước đủ ẩm
hàng ngày nhưng đừng để đọng nước. Sau 2-3 năm, xơ dừa mục thì thay, sau đó
trồng lại [8].
 Trồng cây con nuôi cấy mô
Dùng kẹp móc nhẹ nhàng các lan con trong chai nuôi cấy mô, đem rửa sạch
thạch (agar). Sau đó, lấy xơ dừa đã cắt nhỏ, bó nhẹ chung quanh rễ lan con và ràng
lại bằng một sợi dây thun nhỏ. Có thể tưới phun kích thích tố ra rễ, nước dừa pha
loãng, hoặc Vitamin B1 trước khi trồng. Chú ý là để bộ rễ thật thông thoáng và
tưới nước thường xuyên ba lần mỗi ngày [7].
1.5.3 Cách chăm sóc lan Dendrobium
Dendrobium xuất xứ từ Đông Nam Á nên rất phù hợp với khí hậu Việt Nam.
Dendrobium rất dễ trồng, chịu nắng 70%, chịu ẩm, tưới nước ngày hai lần. Những

ra, lá và giả hành còn được dùng làm trà để uống…[4]
1.6.2 Giá trị kinh tế
Ngày nay, đời sống của con người ngày một nâng cao thì nhu cầu trưng bày hoa
nói chung và hoa lan nói riêng, làm cảnh quan để thưởng ngoạn là nhu cầu tất yếu.
Sự hiện diện của hoa lan thể hiện sự sang trọng và quý phái.
Hàng năm, tỷ lệ ngành sản xuất hoa lan trên thế giới là 10%, đạt khoảng 40 tỷ
(2006), đến nay (2012) đã đạt 102 tỷ USD [82]. Trong năm 2000, kim ngạch xuất
nhập khẩu lan cắt cành và cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó lan cắt
cành đạt 128 triệu USD. Vì lợi nhuận đem lại khá cao nên nhiều nước đã xem
ngành trồng phong lan là một trong những ngành kinh tế quan trọng, góp phần phát
triển kinh tế. Hiện nay, các quốc gia ở Đông Nam Á đã phát triển rất mạnh nghề
trồng hoa nói chung và hoa lan nói riêng, trong đó có cả Việt Nam [4].
1.7 Tình hình sản xuất hoa lan ở nƣớc ta và trên thế giới
Trên thế giới, hoa cắt cành nói chung và hoa lan nói riêng là một trong những
ngành đem lại nhiều tỷ đô-la (USD) và vô cùng năng động. Ở Mỹ, giá trị lan trồng
chậu ước tính đạt từ 47 triệu USD (1996) đến 121 triệu USD (2003). Ở Hà Lan,
trong năm 2002-2003, ước tính giá trị lan trồng chậu Phalaenopsis khoảng 87 triệu
bảng Anh (Michel Paul, 2004). Theo số liệu thống kê từ FlowerTECH (2004), đến
năm 2014, sản lượng hoa lan trồng chậu đạt khoảng 305 triệu USD.

Hình 1.6 Sản lượng lan trồng chậu đến năm 2014
13

Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã vươn lên trở thành nước không chỉ xuất khẩu lan
cắt cành mà còn xuất khẩu giống nhiều nhất trên thế giới. Năm 1990, Thái Lan
xuất khẩu khoảng 15.5 triệu cành, đến năm 1995 là 26.5 triệu cành. Đến năm 2009
xuất khẩu đạt 104 triệu USD. Thái Lan cũng dành khoảng 3718 ha (chiếm 30.6%)
để trồng lan (2009). Khoảng 60-70% sản lượng lan cắt cành của Thái Lan được
xuất khẩu sang khoảng 38 nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [77].
Chính phủ Malaysia cũng đã thấy được tiềm năng trong ngành hoa lan nên đã

bệnh khối u ở thân cây. Khối u này chứa một số chất mới như nopalin và octopin,
gọi chung là opine, mà ở cây bình thường không có. Đặc biệt hơn là khối u không
ngừng tăng trưởng ngay cả khi diệt hết các vi khuẩn trong cây bị nhiễm [11].
Bộ gen của A. tumefaciens chứa một nhiễm sắc thể và một plasmid lớn có kích
thước khoảng 200kb, gọi là plasmid Ti (Tumor-inducing). Chính plasmid này là tác
nhân gây bệnh khối u ở thân cây.

Hình 1.7 Bộ gen của vi khuẩn A. tumefaciens
Khi xâm nhiễm vào cây, A. tumefaciens chuyển đoạn T-DNA nằm trên plasmid
Ti vào bộ gen thực vật. Sau khi sát nhập vào bộ gen thực vật, các gen trên T-DNA
sẽ tiến hành phiên mã và dịch mã để tạo nên các protein đặc biệt mà cây bình
thường không có, đó là các opine. Kết quả hình thành nên các khối u trên thân cây.
Vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng xâm nhập vào cây Hai lá mầm, nhưng lại khó
khăn với cây Một lá mầm, ngoại trừ vài loài của Asparagus [2].

Hình 1.8 Khối u do A. tumefaciens tạo ra
Nhiễm sắc thể
Plasmid
15

 Phân loại [61]
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Rhizobiaceae
Loài: Agrobacterium tumefaciens Hình 1.9 A. tumefaciens đang
gắn vào tế bào thực vật
Dựa vào đặc tính gây bệnh, Agrobacterium được phân loại như sau:
 Các chủng gây khối u sủi thân (crown gall) được gọi là
Agrobacterium tumefaciens

cùng chiều có kích thước khoảng 25 nucleotide, có vai trò như là tín hiệu cis trong
bộ máy vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật.

Nopaline Octopine Agropine
Hình 1.11 Một số loại opine
17

Vùng gen vir là vùng gen độc tính, dài khoảng 30-40 kb, là một regulon gồm 6
operon cần thiết cho sự vận chuyển T-DNA (virA, virB, virD, virG) và làm tăng
hiệu quả chuyển gen (virC và virE). Các gen này mã hóa cho các enzym tương
ứng có chức năng cắt đứt bờ trái và bờ phải để giải phóng T-DNA, đồng thời còn
có chức năng bao bọc T-DNA, vận chuyển và gắn T-DNA vào bộ gen tế bào thực
vật. Hai gen virA và virG hợp lại thành một hệ thống điều hòa hai thành phần để
điều hòa hoạt động của các gen vir khác. Các gen vir thường được kích thích bởi
các hợp chất phenolic được tiết ra từ vết thương của cây. Các hợp chất này vừa có
tính kháng khuẩn vừa là chất dẫn dụ vi khuẩn.
Ngoài vùng T-DNA và vùng gen vir, trên plasmid Ti còn có vùng khởi đầu sao
chép giúp cho vi khuẩn tự sao chép độc lập trong tế bào, vùng gen đồng hóa opine
giúp cho vi khuẩn tiêu hóa các opine được tạo ra trong các khối u.
Ngoài các yếu tố di truyền từ plasmid Ti, còn có các yếu tố di truyền khác từ
nhiễm sắc thể của vi khuẩn, có vai trò quan trọng trong việc giúp A. tumefaciens
bám vào tế bào thực vật và dòng hóa vi khuẩn [22], đó là: locus chvA và chvB
(tổng hợp và bài tiết β-1,2 glucan), locus chvE (gia tăng đường cảm ứng gen vir và
gia tăng tính hướng hóa của vi khuẩn), locus cel: (tổng hợp sợi cellulose), locus
pscA (exoC) (tổng hợp c-glucan và acid succinoglycan) và locus att (liên quan đến
các protein bề mặt tế bào).
 Quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens [22]
Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào những vị trí tổn
thương trên cây Hai lá mầm và gây ra khối u tại những vị trí tổn thương đó. Khi bị
xâm nhiễm, tế bào thực vật tiết ra các chất độc có bản chất phenolic (như