1

I. MỞ ĐẦU
Đậu tương (Glycine max (L.) Merr) là cây trồng quan trọng trên thế giới có giá trị sử
dụng toàn diện do hàm lượng protein cao nhất trong các loại hạt thực vật (38-47%), lipid (12,5-
25,0%), glucid (10-15%). Đây là nguồn cung cấp protein và dầu thực vật chủ lực cho toàn thế
giới. Hạt đậu tương chứa gần như đầy đủ các axit amin cơ bản như isoleucin, leucin,
methyonin, phenylalanin, tryptophan, valin.
Mặc dù đã bắt đầu tiến hành sản xuất trên quy mô công nghiệp từ năm 2011 nhưng Việt
Nam vẫn tiếp tục phải nhập khẩu phần lớn lượng bột đậu tương. Năm 2013, Việt Nam đã nhập
khẩu khoảng 2,97 triệu tấn khô đậu tương. Trước tình hình đó Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn đặt ra yêu cầu tăng năng suất và diện tích trồng đậu tương trên cả nước.
Ngày nay, công nghệ gen sử dụng các phương pháp hiện đại đã khắc phục được rất
nhiều hạn chế của phương pháp chọn giống truyền thống. Công nghệ gen cho phép các nhà di
truyền và chọn giống thực vật xác định, thiết kế các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn
rồi chuyển các gen này vào các giống đang sử dụng nhằm tăng tính chống chịu, tăng năng suất
chất lượng cây trồng.
Có nhiều phương pháp chuyển gen được sử dụng đã thành công trong đó phương pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đang được các phòng thí nghiệm trên thế
giới cũng như ở Việt Nam sử dụng nhiều nhất. Với ưu điểm là tần số biến nạp khá cao, các cây
chuyển gen thu được tương đối dễ và ít tốn kém, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens đã đạt được kết quả trên nhiều đối tượng như thuốc lá, hoa cúc, đậu xanh, lúa và
nhiều giống cây trồng khác.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước
đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào cây đậu tương nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens’’.

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về đậu tƣơng
1.1.1. Nguồn gốc
2

thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ. Trong tự nhiên,
3

Agrobacterium tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa.
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u do Agrobacterium tumefaciens sinh
ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Đó là
do Agrobacterium tumefaciens đã chuyển một đoạn T-DNA (transfer DNA) sang tế bào thực
vật và T-DNA điều khiển quá trình sinh tổng hợp các chất đó. Ngoài ra, các khối u cũng sinh
tổng hợp các opine là các axit amin, đặc biệt là các dẫn xuất của đường. Opine được vi khuẩn sử
dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hóa opine trên plasmid gây khối
u thực vật. Dạng opine được tổng hợp có thể là nopanin, octopin, agrocinopin, mannozapin và
agropin, phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, octopin và nopalin là hai
dạng opine phổ biến.
1.2.2. Ti-plasmid
Ti-plasmid là một phân tử DNA mạch vòng, kích thước khoảng 200kb, phân tử lượng của
nó sấp xỉ 1,2.10
8
. Trong tế bào thực vật chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập. Ti-
plasmid ở các chủng Agrobacterium khác nhau đều có bốn vùng tương đồng: vùng có liên quan
đến sự tái bản, vùng liên quan đến sự tiếp hợp, vùng gây độc hay còn gọi là vùng vir (virulent
region), vùng T-DNA. Quá trình gây tạo khối u có liên quan trực tiếp đến vùng T-DNA và
vùng vir.
Vùng T-DNA
Vùng T-DNA là vùng được chuyển vào tế bào thực vật và gây nên các khối u thực vật. Có
hai hệ gen tồn tại trên T-DNA:
- Hệ gen thứ nhất quy định quá trình sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật
là auxin và cytokinin. Khi các gen này hoạt động sẽ dẫn đến sự phân chia các tế bào một cách
liên tục gây ra khối u.
- Hệ gen thứ hai quy định lên quá trình sinh tổng hợp các opine. Đây là các axit amin lạ có
nguồn gốc từ arginine và không bao giờ xuất hiện trong tế bào bình thường.

cần thiết gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không được dùng trực tiếp làm vector. Các
enzym giới hạn có thể cắt DNA của plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ
gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzym giới hạn. Ngoài ra,
các gen one được dùng làm chỉ thị chọc lọc có tính trội, nhưng chúng lại làm cản trở quá trình
tái sinh bình thường ở thực vật. Với những lí do này, Ti-plasmid đã được nghiên cứu cải biến
như cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng
MCS (multicloning site- trình tự tạo dòng) tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả: vectơ
5

liên hợp, vectơ nhị phân. Nhờ vậy, cây trồng được biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen
quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thường.
Vectơ liên hợp (co-integrative vector)
Hệ thống vector liên hợp (co-integrative vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại
plasmid: Ti-plasmid đã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhưng vẫn
giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là đoạn tương đồng với
một đoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại
plasmid. Plasmid trung gian là một plasmid tách dòng từ vi khuẩn E. coli và có thể tái sinh
được ở Agrobacterium. Plasmid này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị
phục vụ việc chọn lọc và có đoạn tương đồng. Khi cho tương tác hai loại plasmid này với nhau
chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector liên
hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens và hoạt động theo cơ chế chuyển
gen thông thường của vi khuẩn đất. Do tần số đưa plasmid trung gian từ E. coli sang
Agrobacterium rất thấp nên vector này ít được sử dụng.
Vectơ nhị phân (binary vector)
Hệ thống vector nhị phân khác với vector liên hợp là chúng có hai vector (plasmid) cùng
có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. (1) Vector chuyển gen: là Ti-plasmid nhỏ có khả
năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần
thiết ở giữa hai trình tự bờ trái và bờ phải, gắn thêm các đơn vị sao chép để DNA plasmid có
thể vừa tự nhân trong cả E. coli và Agrobacterium, các gen chọn lọc, gen chỉ thị, vùng có chứa
nhiều điểm cắt của các enzym giới hạn (vùng tạo ra dòng đa năng) nằm ở giữa hai trình tự bờ

sống kém dẫn đến tỷ lệ mẫu sống thấp, còn nếu mẫu quá già lúc này hệ gen thực vật ổn định
dẫn đến việc tiếp nhận gen ngoại lai trở nên khó khăn hơn.
Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium và plasmid: các nghiên cứu chuyển gen thành
công thông qua A. tumefaciens cho thấy các chủng vi khuẩn được sử dụng hiệu quả ở các loài
cây một lá mầm đó là LBA4404, C58 đã bị bất hoạt, EHA101 và các chủng cải biên (EHA105
từ EHA101, AGL0 và AGL1 từ EHA101) [33]. Dạng Ti-plasmid của Agrobacterium cũng có
vai trò trong quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Các nghiên cứu cho thấy, Ti-
plasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Ti-
plasmid dạng octopin.
Nhiệt độ: ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển T-
ADN đã được phát hiện ở các loài cây hai lá mầm. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình chuyển T-
7

ADN có thể thay đổi đối với mỗi dạng mẫu mô biến nạp nhất định. Nhiệt độ thích hợp cho
chuyển gen bền vững cũng cần phải được đánh giá với mỗi dạng mẫu mô đích và với mỗi
chủng Agrobacterium biến nạp. Ở các loài cây một lá mầm nhiệt đồng nuôi cấy thường là 24-
25
0
C, một số trường hợp là 28
0
C. Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp (dưới 23
0
C) đến khả năng
chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững đã được đánh giá. Biểu hiện gen bền vững gen trong
chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi đạt được cao nhất ở 22
0
C. Tần số chuyển gen cao hơn đã nhận
được ở phôi ngô non sau biến nạp được đồng nuôi cấy ở 20
0
C so với 23

Glyphosate được phân giải trong đất nhờ vi sinh vật và không để lại sản phẩm độc hại nào.
Kháng glyphosate có thể do những cơ chế khác nhau:
+ Thứ nhất trong cây có sự biểu hiện mạnh mẽ của enzyme của EPSP-synthase dưới sự
điều khiển của promoter CaMV-35S và đồng thời tạo nên một enzyme oxidoreductase của vi
khuẩn. Nhờ enzyme oxidoreductase mà thuốc bị bất hoạt và với một lượng lớn EPSP-synthase
được tạo nên thì lượng thuốc còn lại không thể gây hại ở cây biến đổi gen. Ở đây 2 gen cần
thiết, trong đó gen oxidoreductase là không có trong thực vật.
+ Một khả năng thứ hai là sử dụng EPSP-synthase của vi khuẩn. Từ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (loài CP4), EPSP-synthase vi khuẩn được phân lập và do sự thay
đổi trình tự amino acid nên enzyme này không còn mẫn cảm với glyphosate và vì vậy được sử
dụng trong nhiều cây trồng thương mại.
+ Thứ ba là xuất hiện một dạng đột biến EPSP-synthase của cây trồng có khả năng
kháng glyphosate.
Sự kết hợp của glyphosate vào enzyme EPSP-synthase ở loại hình bình thường đã làm
mất hoạt tính xúc tác và hạn chế sự di chuyển của enzyme này vào lục lạp. Dạng EPSP*-
synthase (mã hóa bởi shkG*- dạng đột biến) có hoạt tính thấp với glyphosate và vẫn thể hiện
hoạt tính khi có mặt của thuốc diệt cỏ này.
1.6.2. Đậu tương chuyển gen kháng glyphosate
Hiện nay, các cây trồng chuyển gen kháng glyphosate thường mang 1 hoặc vài gen dưới
đây:
- Gen EPSPS phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 mã hoá cho một dạng của
enzym 5-enolpyruvyshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) có khả năng kháng thuốc diệt cỏ
glyphosate.
- Gen EPSPS cải biên phân lập từ ngô mã hoá cho enzym EPSPS
9

- Gen phân lập từ vi khuẩn đất Achromobacter chủng LBAA mã hoá cho enzym oxy
hoá khử glyphosate (GOX).
Ở cây đậu tương, người ta đã đưa một số gen kháng thuốc diệt cỏ, tuy nhiên khi
chuyển gen EPSPS phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 biểu hiện tính

2.3. Nội dung nghiên cứu
10

Nội dung 1: Xây dựng quy trình tái sinh giống đậu tương DT2008 và ĐT26
Nội dung 2: Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS kháng thuốc trừ cỏ
vào hai giống đậu tương DT2008, ĐT26 nhờ Agrobacterium tumefaciens.
Nội dung 3: Đánh giá xác định sự biểu hiện của gen chuyển.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để xây dựng hệ thống tái sinh cây
 Phương pháp lây nhiễm chủng vi khuẩn vào mẫu thực vật
 Phương pháp tách chiết DNA
 Phương pháp PCR
 Phương pháp điện di trên gel agarose

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng quy trình tái sinh hai giống đậu tƣơng DT2008 và ĐT26
3.1.1. Ảnh hưởng của H
2
O
2
đến khả năng khử trùng hạt
Khử trùng mẫu là công đoạn đầu tiên có ý nghĩa quyết định đến kết quả của quá trình nuôi
cấy mô và tế bào thực vật.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của H
2
O
2
đến khả năng khử trùng của hạt giống đậu tương DT2008 và
giống ĐT26
Nồng độ

mẫu
sống
(%)
15
8
94
0
6
98
0
2
10
8
0
92
10
0
90
12
2
34
64
5
40
55
20
8
35
20
45

ghi nhận được kết quả ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP và IBA lên khả năng tạo cụm chồi từ lá mầm
Công thức
Giống DT2008
Giống ĐT26
BAP
(mg/l)
IBA
(mg/l)
Tỉ lệ tạo
cụm
chồi
Số
chồi/cụm
Chất
lƣợng
chồi
Tỉ lệ tạo
cụm
chồi
Số
chồi/cụm
Chất
lƣợng
chồi
0
0
0
1
++

5,45
+
100
5,72
+
1
0,2
60
3,13
+++
62
3,26
+++
1,5
0,2
76
4,36
+++
80
4,67
+++
2
0,2
100
5,2
++
100
5,31
++
2,5

Chiều cao chồi
(cm)
1
0,1
0,1
3.2
3.8
2
0,5
0,1
6,2
7,4
3
1
0,1
5,8
6,6
Kết quả cho thấy, khả năng kéo dài chồi của hai giống đậu tương nghiên cứu trên môi
trường bổ sung GA3 có sự khác biệt rõ rệt. Chiều cao chồi dao động từ 3,2 cm đến 7,4 cm. Khả
năng kéo dài chồi của hai giống DT2008 và ĐT26 thích hợp hơn ở nồng độ GA3 là 0,5 mg/l
(chiều cao chồi giống DT2008 đạt 6,2 và ĐT26 đạt 7,4 cm). Trong đó, giống ĐT26 có khả
năng kéo dài chồi tốt hơn giống DT2008. Ở tất cả các công thức khi so sánh chiều cao chồi của
2giống DT2008 và ĐT26 đều cho thấy ĐT26 có khả năng kéo dài chồi tốt hơn (chiều cao chồi
ở giống DT2008 lần lượt là 3,2; 6,2; 5,8; còn ở giống ĐT26 tương ứng là 3,8; 7,4; 6,6). Điều
này chứng tỏ, việc kéo dài chồi ngoài yếu tố GA3 còn do đặc điểm của từng giống quyết định.
Như vậy, từ kết quả thí nghiệm chúng tôi chọn ra được công thức 2 có bổ sung 0,5 mg/l
GA3 và 0,1 mg/l IAA là công thức tối ưu để kéo dài chồi của hai giống đậu tương nghiên cứu.
3.1.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng hình thành rễ của các giống đậu tương nghiên
cứu
α-NAA có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và

có 2-3 lá xanh đậm
0,5
100
4,15
7,12
Tốt
Thân cây mập,
khoẻ, có 2-3 lá xanh
đậm
1
90
3,22
4,30
Xấu
Thân cây nhỏ, có 2-3
lá xanh nhạt.
ĐT26
0,1
45
1,50
2,82
Xấu
Thân cây nhỏ, có 3-4
lá xanh nhạt
0,5
98
4,36
7,65
Tốt
Thân cây mập,
Bảng 3.5. Biểu hiện tạm thời của gen gus khi lây nhiễm các chủng Agrobacterium khác nhau
với nốt lá mầm giống đậu tương DT2008 và ĐT26
CT
Chủng
khuẩn
Giống DT2008
Giống ĐT26
Tổng
số
mẫu
Số mẫu
biểu
hiện gus
Tần số
biểu hiện
tạm thời
Tổng
số
mẫu
Số mẫu
biểu hiện
gus
Tần số biểu
hiện tạm
thời (%)
Hạt đậu tƣơng
DT2008, ĐT26


lI
I
B
B
A
A+
+2
2m
m
g
g
/
/
1
1
B
B
A

ư
ớ
ớ
c
cd
d
ừ
ừ
a
aM
M
S
S
-
-
B
B
5
5+
+

M
M
S
S
-
-
B
B
5
5+
+0
0
,
,
5
5m
m
g
g

/
/
l
lI
I
A
A
A
A15

(%)
1
GV3101
101
4
3,96
100
5
5,0
2
LBA4404
115
20
17,4

Tỷ lệ
chết
(%)
Tần số
biểu hiện
tạm thời
(%)
Tỷ lệ
sống
(%)
Tỷ lệ
chết
(%)
Tần số biểu
hiện tạm thời
(%)
0,0
86,5
13,5
0,0
85,3
14,7
0,0
0,2
84,5
15,5
1,65
82,5
17,5
1,64

34,7
4,5
66,4
33,6
4,7
1,4
60,4
39,6
2,2
61,6
38,4
2,1

Như vậy, từ kết quả thí nghiệm trên ta hoàn toàn có thể sử dụng giá trị OD = 0,8 khi
biến nạp vi khuẩn với giống đậu tương DT2008 và ĐT26.
16

3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens đến hiệu quả chuyển gen
trên giống đậu tương DT2008, ĐT26
Bảng 3.7. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp đối với giống đậu tương
DT2008, ĐT26
Thời
gian
Giống DT2008
ĐT26
Tỉ lệ
sống
(%)
Tỉ lệ
chết

83,5
16,5
7,5
82,5
17,5
6,5
60
81,5
18,5
18,7
80
20,0
18,2
90
65,5
34,5
10,5
64,6
35,4
10,5

Quan sát kết quả bảng 3.7 ta thấy thời gian biến nạp thích hợp nhất với chủng C58C1
dòng đậu tương DT2008 và ĐT26 là 60 phút, tần số biểu hiện tạm thời tốt nhất lần lượt
là18,7% và 18,2%.
3.2.4. Ảnh hươ
̉
ng cu
̉
a thơ
̀

15,8
17

6
7
14,2
13,8
Như vậy, trong thí nghiệm này thì thời gian đồng nuôi cấy thích hợp nhất là 5 ngày, cho
tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus đạt 18,5% ở giống đậu tương DT2008 và 18,1% ở giống
đậu tương ĐT26.
3.2.5. Ảnh hưởng của tổ hợp kháng sinh cefotaxim và vancomycin đến hiệu quả ức chế vi
khuẩn
Trong một quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A .tumefaciens điển hình, sau khi vi khuẩn A.
tumefaciens được sử dụng để chuyển gen ngoại lai vào mô hay tế bào thực vật, vật liệu chuyển gen cần
được xử lý với các loại kháng sinh thích hợp để loại bỏ vi khuẩn. Việc sử dụng kết hợp cefotaxim và
vancomycin giúp cải thiện đáng kể hiệu quả ức chế vi khuẩn. Vì vậy, trong thí nghiệm chúng
tôi sử dụng vancomycin ở nồng độ 250 mg/l kết hợp với cefotaxim ở các nồng độ khác nhau
nhằm cải thiện hiệu quả ức chế vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Hiệu quả ức chế vi khuẩn A. tumefaciens và ảnh hưởng của tổ hợp kháng sinh
cefotaxim và vancomycin đến khả năng tái sinh của hai giống
ĐT26 và DT2008
Nồng độ kháng sinh
(mg/l)
Giống DT2008
Giống ĐT26
Vancomycin
Cefotaxim
Tỉ lệ
mẫu

1,17
250
150
45
41
1,32
38
40
1,32
250
200
62
46
1,32
60
44
1,32
250
250
72
49
1,35
71
39
1,35
250
300
81
39
1

Số chồi
trung bình
(chồi/mẫu)
Tỉ lệ mẫu
chết (%)
Tỉ lệ mẫu
tái sinh (%)
Số chồi
trung bình
(chồi/mẫu)
1
0
90
2,22
0
94
2,27
2
60
40
1,15
56
44
1,14
3
96
4
1
92
8

= 0,8 (lây nhiễm trong 60 phút)
Chủng vi khuẩn C58C1

Nuôi lỏng tạo huyền
phù
Khử khuẩn bằng cefotaxim (250 mg/l) và
vancomycim (250 mg/l)
Tạo chồi trên môi trường MS-B5 + 0,1mg/l IBA +
2mg/l BAP (trong 9 tuần)
Ra rễ trên môi trường MS-B5 +0,5 mg/l α-
NAA(trong 4 tuần)
Kéo dài chồi trên môi trường MS-B5 +0,5 mg/l
α-NAA(trong 4 tuần)
Chọn lọc bằng Kanamycin (50 mg/l)
20

Sơ đồ quy trình quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ CP4-EPSPS vào hai giống đậu tương
DT2008 và ĐT26

3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 đã
biến nạp
3.3.1 Kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tương DT2008 đã biến nạp Hình 3.14. Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA genome của
các cây đậu tương DT2008 đã biến nạp
Sau khi kiểm tra thì có 5 mẫu có sự xuất hiện của băng có kích thước xấp xỉ 1,5 kb
tương đương với đối chứng dương (mẫu ADN của plasmid pCAMBIA2300.1). Còn lại 20 mẫu
không có sự xuất hiện của băng kích thước này và không có sự khuếch đại sản phẩm PCR. Kết
quả này chứng tỏ 5 cây đậu tương DT2008 tái sinh này nhiều khả năng mang gen CP4-EPSPS

15% trong thời gian 10 phút để khử trùng mẫu, tạo cụm chồi đậu tương trên môi trường
MS-B5 có bổ sung 0,1mg/l IBA, 2 mg/l BAP, kéo dài chồi trên môi trường MS-B5 có bổ sung
0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3. Các chồi đậu tương đạt tiêu chuẩn chuyển sang môi trường ra rễ là
môi trường MS-B5 có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA.
2. Đã xây dựng được quy trình chuyển gen CP4-EPSPS vào 2 giống đậu tương DT2008
và ĐT26 bằng cách sử dụng chủng C58C1 có OD = 0,8 lây nhiễm trên nốt lá mầm với thời gian
lây nhiễm là 60 phút, sau lây nhiễm đồng nuôi cấy trong 5 ngày. Mẫu đậu tương được khử
khuẩn bằng cefotaxim (250 mg/l) và vancomycin (250 mg/l), sau đó cho tái sinh theo quy trình
như trên để thu được cây chuyển gen.
3. Bằng kĩ thuật PCR đã xác định được 5 mẫu giống DT2008 (trong tổng số 25 mẫu thu
được sau biến nạp) và 4 mẫu đậu tương ĐT26 (trong tổng số 25 mẫu thu được sau biến nạp)
mang gen CP4-EPSPS, với kích thước xấp xỉ 1,5 kB.
Đề nghị
1.Tiếp tục tiến hành các thí nghiệm bổ sung để xác minh sự tồn tại của gen kháng thuốc
trừ cỏ trong các cây chuyển gen, đồng thời thực hiện tự thụ và chọn lọc để thu được các cây
chuyển gen đồng hợp tử làm vật liệu ổn định cho các thí nghiệm lai tạo giống kháng thuốc trừ
cỏ glyphosate tiếp theo.
2. Sau khi thu được vật liệu chuyển gen cần tiếp tục đánh khả năng kháng thuốc trừ cỏ
của cây chuyển gen ngoài đồng ruộng và theo dõi tính ổn định của gen chuyển trong cây đậu
tương đã được chuyển gen CP4-EPSPS.