Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

VŨ THỊ HƢỜNG
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN DREB5 PHÂN LẬP
TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐỊA PHƢƠNG XUÂN LẠNG SƠN
VÀ LƠ BẮC GIANG

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Chu Hoàng Mậu


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ii
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ chuyên
ngành Di truyền học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên, tôi đã
nhận đƣợc sự ủng hộ, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các đồng nghiệp, bạn bè
và gia đình.
Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng
Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trƣờng Đại
học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình
thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh- KTNN và khoa Sau
đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành
cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.

1.3.2. Gen DREB5 21
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 27
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 27
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 28
2.2.1. Hóa chất 28
2.2.2 Thiết bị 28
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.3.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử 30
2.3.2. Phƣơng pháp phân tích trình tự gen 36
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iv
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. KẾT QUẢ NHÂN BẢN GEN DREB5 TỪ HỆ GEN CỦA HAI GIỐNG
ĐẬU TƢƠNG XLS VÀ LBG 37
3.1.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng 37
3.1.2. Kết quả nhân bản gen GmDREB5 bằng phản ứng PCR 38
3.2. TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB5 40
3.3. SO SÁNH TRÌNH GEN GmDREB5 PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU
TƢƠNG XLS VÀ LBG VỚI CÁC TRÌNH TỰ ĐÃ CÔNG BỐ 43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
Heat shock protein
kb
Kilo base
LEA
Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tích luỹ với số
lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi)
LTP
Lipid Tranfer protein (Protein vận chuyển lipid)
LBG
Lơ Bắc Giang
MGPT
Môi giới phân tử
MS
Murashige- Skoog
NAA
Naphtyacetic acid
PCR
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
P5CS
Pyrroline- 5- Carboxylate Synthetase
TAE
Tris acetat EDTA
TBE
Tris borat EDTA
XLS
Xuân Lạng Sơn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Bảng 3.2
Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác của trình tự gen
GmDREB5 của 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS với trình
tự gen GmDREB5 của 6 giống đậu tƣơng công bố trên
ngân hàng gen quốc tế
46
Bảng 3.3
Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác của trình tự amino
acid của Protein DREB5 của 2 giống đậu tƣơng LBG và
XLS với trình tự amino acid của Protein DREB5 của 6
giống đậu tƣơng công bố trên ngân hàng gen quốc tế

52
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vii
DANH MỤC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
Hình 1.1
Sản xuất đậu tƣơng của Việt Nam
10
Hình 1.2
Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB5 ở
đậu tƣơng

Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống XLS và
LBG
38
Hình 3.2
Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB5
39
Hình 3.3
Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng
DH5 chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB5
40
Hình 3.4
Plasmid mang gen GmDREB5
41
Hình 3.5
So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân
lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS
42
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

viii
Hình 3.6
So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân
lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS với sáu trình
tự nucleotide của gen GmDREB5 đã công bố trên
Ngân hàng gen quốc tế
45
Hình 3.7
Biểu đồ hình cây so sánh mức độ tƣơng đồng gen
GmDREB5 của 8 giống đậu tƣơng


đƣợc sử dụng cho ngƣời và gia súc do đáp ứng đƣợc nhu cầu đạm trong khẩu
phần ăn hằng ngày của ngƣời cũng nhƣ gia súc [1], [3].
Hạt đậu tƣơng đƣợc dùng làm thực phẩm cho con ngƣời, thức ăn cho gia
súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là mặt hàng xuất khẩu. Trong hạt đậu
tƣơng có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, chứa 35%- 52% protein, 18%- 25% lipit,
20% glucid và nhiều loại axit amin cần thiết nhƣ: leucin, isoleucin, lysin,
metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, trong hạt đậu tƣơng còn
chứa nhiều vitamin (B1, B2, A, D, E, K…) là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng
cao rất cần thiết cho cơ thể ngƣời và động vật. Đặc biệt, protein của đậu tƣơng
đƣợc coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng
kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hoá và không
có các thành phần tạo cholesterol. Lipit của đậu tƣơng chứa tỉ lệ lớn các axit
béo chƣa no, có hệ số đồng hoá lớn (98%), chỉ số iot cao (120-137). Sử dụng
protein và lipit của hạt đậu tƣơng còn có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ: đái
tháo đƣờng, béo phì, huyết áp cao, chảy máu não… [3].
Ngoài ra, ở rễ cây đậu tƣơng có các nốt sần, đó là kết quả của sự cộng
sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Vì vậy, đậu tƣơng là loại cây
trồng có tác dụng cải tạo đất, làm cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chống ô nhiễm môi trƣờng do lạm dụng phân
bón và thuốc trừ sâu [3].
Với những giá trị to lớn đó, cây đậu tƣơng đƣợc trồng phổ biến ở nhiều
nơi từ 55
o
vĩ Bắc đến 55
o
vĩ Nam, từ vùng thấp hơn mực nƣớc biển đến vùng
cao trên 2000m so với mực nƣớc biển với diện tích đạt khoảng hơn 74,7 triệu

Sơn và Lơ Bắc Giang”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định đƣợc sự khác biệt về trình tự gen DREB5 của hai giống đậu
tƣơng địa phƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang và sự đa dạng về cấu trúc
gen DREB5 ở cây đậu tƣơng trên cơ sở phân tích các trình tự đã công bố.
3. Nội dung nghiên cứu
- Khuếch đại gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ
Bắc Giang bằng kỹ thuật PCR;
- Tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 của hai giống đậu tƣơng
Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang;
- So sánh trình tự gen DREB5 của hai giống giống đậu tƣơng Xuân Lạng
Sơn và Lơ Bắc Giang;
- So sánh trình tự gen DREB5, trình tự amino acid của protein DREB5
của các giống đậu tƣơng nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên Ngân
hàng gen quốc tế.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG
Cây đậu tƣơng đƣợc thuần hóa ở Trung Quốc và đƣợc đƣa đến Triều
Tiên, Nhật Bản, Nga, sang Nam Á và Đông Nam Á qua con đƣờng tơ lụa. Ở
Việt Nam cây đậu tƣơng đƣợc trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu
vực trung du, miền núi phía Bắc và miền đông Nam Bộ.
Cây đậu tƣơng có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill có bộ nhiễm
sắc thể 2n = 40, là loại cây trồng thuộc họ Đậu (Fabaceae), họ phụ Cánh
Bƣớm (Papilionoideae) và bộ Phaseoleae. Cũng nhƣ một số cây họ đậu khác,

7 – 8 hoa, có màu trắng hoặc tím, mọc ở ngọn hay nách lá.
Quả đậu tƣơng thuộc loại quả ráp, đa số ngoài vỏ có lông bao phủ, khi
chín có màu vàng hoặc xám đen. Mỗi quả có 1 - 4 hạt, nhƣng thƣờng có 2 hạt.
Hạt đậu tƣơng có hình dạng tròn hay bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, vỏ hạt
thƣờng nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu đen…nhƣng đa số là hạt
màu vàng. Khối lƣợng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt.
Cây đậu tƣơng có 2 đặc tính sinh trƣởng: sinh trƣởng hữu hạn và sinh
trƣởng vô hạn; căn cứ vào thời gian sinh trƣởng có 3 loại: chín sớm (75- 85
ngày), trung bình (80- 100 ngày), chín muộn (110- 120 ngày).
Đậu tƣơng là cây trồng tƣơng đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh.
Trong tập đoàn giống đậu tƣơng, có những giống chỉ trồng vào vụ hè, ngƣợc
lại có những giống chỉ trồng vào vụ đông [3], [5].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6
1.1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng
Đậu tƣơng là cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm của
nó làm thức ăn cho con ngƣời, gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là hàng xuất
khẩu, cải tạo đất tốt.
Giá trị về mặt thực phẩm
Mặc dù thành phần hóa sinh của hạt phụ thuộc vào giống cây, điều kiện
canh tác, khí hậu, dịch bệnh…Nhƣng so với các loài thực vật khác thì hạt đậu
tƣơng có hàm lƣợng protein cao nhất, hàm lƣợng protein trung bình khoảng
35% - 40%. Trong khi đó hàm lƣợng protein trong gạo chỉ chứa 6,2- 12%,
ngô 9,8- 13,2%, thịt bò 21%, thịt gà 20%, cá 17- 20% và 13- 14,8%. Trong
hạt đậu tƣơng, protein dự trữ (chủ yếu là albumin và globulin) chiếm 70%
protein tổng số, Hàm lƣợng lipit từ 18%- 25%, glucid 20%. Ngoài ra là các
enzyme; các chất ức chế protease và lectin; muối khoáng; các vitamin nhóm
B; các amino acid cơ bản nhƣ isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin,

ăn cho gia súc. Đậu tƣơng còn là cây luân canh cải tạo đất tốt. 1ha trồng đậu
tƣơng nếu sinh trƣởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30 – 60kg Nitơ. Trong
hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tƣơng vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ
có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây
trồng mà giảm chi phí cho việc bón đạm. Thân và lá đậu tƣơng dùng bón
ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lƣợng Nitơ trong thân chiếm 0,05%,
trong lá chiếm 0,19%.
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam
Với những giá trị kinh tế và và giá trị sử dụng, cây đậu tƣơng đƣợc xem
là một loại cây trồng chiến lƣợc của nhiều quốc gia, với vị trí thứ tƣ, sau lúa,
ngô và lúa mỳ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
Đậu tƣơng có khả năng thích ứng khá rộng nên đƣợc trồng khắp các
châu lục, đặc biệt là châu Mỹ (75,68%) và châu Á (21,27%).
Trong những năm gần đây, do kết quả của việc ứng dụng những tiến bộ
của công nghệ sinh học từ chọn, tạo giống đến sản xuất nên năng suất đậu
tƣơng đã tăng lên đáng kể, đƣa đậu tƣơng trở thành cây trồng quan trọng
trong cơ cấu cây trồng của nhiều quốc gia.
Hiện nay, đậu tƣơng đƣợc trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thế giới.
Trong đó, 4 nƣớc có sản lƣợng đậu tƣơng đứng đầu là: Mỹ, Brazil, Argentina và
Trung Quốc. Đậu tƣơng là nguồn cung cấp dầu và protein quan trọng.
Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc trồng từ rất lâu, trƣớc cây đậu xanh và
các cây họ đậu khác. Các giống đậu tƣơng ở nƣớc ta bao gồm các giống đậu
tƣơng nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tƣơng đột biến và các giống đậu
tƣơng địa phƣơng.
Trƣớc cách mạng tháng 8 năm 1945, diện tích gieo trồng đậu tƣơng ở
Việt Nam chỉ khoảng 32 ha, năng suất 4,1 tạ/ha. Hiện nay, diện tích đó đã
đƣợc tăng lên đáng kể, cả nƣớc có 7 vùng nông nghiệp đều trồng đƣợc đậu

2010
2011
Diện tích canh
tác (nghìn ha)
204,1
185,6
190,1
192,1
146,2
197,
8
215*
Sản lƣợng
(tấn/ha)
1,43
1,39
1,45
1,39
1,46
002
1,63*
Tổng sản lƣợng
(nghìn tấn)
292,7
258,1
275,5
267,6
213,6
296,
9

1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU
TƢƠNG
Cây đậu tƣơng thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Các cây họ đậu nói
chung, cây đậu tƣơng nói riêng do có hàm lƣợng protein và lipid trong hạt cao
nên nhu cầu về nƣớc nhìn chung cao hơn các loại cây khác. Để tổng hợp 1 kg
chất khô cần 500- 530 kg nƣớc. Trong quá trình nảy mầm thì nhu cầu về nƣớc
của đậu tƣơng cũng khá cao, khoảng 50%, trong khi đó ở ngô là 30%, ở lúa là
26% [6].
Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng liên quan chặt chẽ đến đặc điểm
hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Tính chịu
hạn của cây đậu tƣơng mang tính đa gen. Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh
khác nhau: sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tƣơng đối, cũng nhƣ
bản chất di truyền của từng giống trong quá trình sinh trƣởng và phát triển có
khả năng sử dụng nƣớc tiết kiệm.
Hạn hán và độ mặn cao có ảnh hƣởng làm giảm mạnh năng suất cây
trồng trên toàn thế giới (Boyer 1982) trong đó có đậu tƣơng. Để thích ứng
với điều kiện nhƣ vậy cơ thể thực vật đã phát triển một loạt các cơ chế đòi hỏi
sự khởi động của nhiều gen liên quan chống lại stress do các điều kiện bất lợi
vô sinh. Một số lƣợng lớn các gen liên quan đến khả năng chịu hạn và chịu
mặn đã đƣợc xác định. Tuy nhiên, vẫn còn một số lƣợng đáng kể các gen liên
quan đến tính chống chịu của thực vật chƣa đƣợc xác định (Bzay 1997, Zhu
2002). Vì vậy điều quan trọng là nghiên cứu các chức năng của gen liên quan
đến stress để cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng với hạn hán. Có hai
nhóm gen có liên quan chủ yếu đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
(1). Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hƣởng trực tiếp tới đặc
tính chịu hạn; (2). Nhóm gen mà sản phẩm của chúng kích hoạt quá trình
phiên mã của nhóm gen chịu hạn.

ngƣời ta đã phân lập đƣợc 30 gen khác nhau thuộc thành viên của nhóm gen
dehydrin ở các cây trồng khác nhau. Gen mã hóa protein dehydrin ở đậu
tƣơng đã đƣợc nghiên cứu tại một số phòng thí nghiệm trên thế giới và tới nay
đã có một số trình tự gen dehydrin đậu tƣơng và một số thực vật khác đƣợc
công bố trên ngân hàng trình tự gen quốc tế.
HSP (Heat Shock Protein) và môi giới phân tử (Chaperons)
HSP có mặt hầu hết ở các loài thực vật nhƣ: lúa mì, lúa mach, ngô,
đậu… chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá và có hầu hết ở các loài thực
vật. Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy
do stress nóng và mở rộng giá trị ngƣỡng nhiệt độ với sự chống chịu nhiệt độ
cao. Trong các tế bào thực vật HSP tế bào chất tập trung thành các hạt sốc
nhiệt (HSG- Heat Shock Granules). Ngƣời ta cho rằng HSG gắn kết trên các
RNA polymerase để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình
stress nóng. Sau khi gặp sốc nóng, các hạt này phân tán và liên kết dày đặc
với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein. HSP xuất hiện trong các
quá trình sinh trƣởng bình thƣờng, các giai đoạn biệt hóa mô và cả trong thời
kỳ sinh trƣởng của thực vật. Ngoài ra, chúng đƣợc tổng hợp thêm trong điều
kiện cực đoan của môi trƣờng [4].
Dựa trên khối lƣợng phân tử, HSP có thể chia thành 6 nhóm: HSP110,
HSP90, HSP70, HSP60, HSP20, HSP8,5. Trong nhóm HSP có rất nhiều đại
diện của chất môi giới phân tử (MGPT) là HSP70, HSP60 nhƣng cũng có
HSP không phải là MGPT nhƣ HSP8,5 (Ubiquitin). Ubiquitin đƣợc xem là
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
chất bảo vệ tế bào, chúng có hoạt tính protease và thực hiện chức năng phân
giải các protein không có hoạt tính enzyme, ngăn chặn các protein này gây
độc cho tế bào. Ubiquinin đóng vai trò quan trọng trong tự sửa chữa tế bào
bằng cách loại bỏ các protein biến tính khi gặp yếu tố cực đoan.
Các MGPT là chìa khóa tham gia nội cân bằng tế bào trong các điều

hạn. Gen mã hóa cho enzyme P5CS đã đƣợc nghiên cứu và tách dòng ở nhiều
loại cây khác nhau. Nhiều cây trồng đã đƣợc chuyển gen P5CS nhằm tăng
cƣờng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng.
Prorcel và đtg (2005) đã nghiên cứu phân lập gen P5CS ở đậu tƣơng và
đã đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số là AJ715851, kích thƣớc là
831 bp [29]. Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Thuý Hƣờng và đtg (2009) đã phân lập
gen P5CS từ mRNA với kích thƣớc 2148 bp [28].
LTP (Lipid transfer protein)
Gen LTP có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận
chuyển phospholipid qua màng. LTP liên quan đến sinh tổng hợp các biểu
bì, làm tăng độ dày của lớp màng tế bào, qua đó làm giảm sự mất nƣớc ở
thực vật.
Gen LTP đã đƣợc phân lập ở một số cây trồng nhƣ đậu xanh,
Arabidopsis [24], [25], [26].
1.2.2. Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn
Tuy không tác động trực tiếp đến tính chịu hạn của thực vật nhƣng các
gen điều khiển phiên mã lại có vai trò đáng kể trong việc kích thích sự biểu
hiện các gen chức năng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16
Các gen điều khiển sự phiên mã mà sản phẩm của chúng có khả năng
hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám
vào trình tự DNA điều khiển (nhân tố tác động cis) trên vùng khởi động
(promoter) của gen và tƣơng tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp
khởi đầu quá trình phiên mã của các gen chức năng.
Theo nghiên cứu của một số tác giả đã đƣợc công bố trên Ngân hàng
gen quốc tế, có nhiều yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn nhƣ:
DREB, ABRE, NAC, bZIP, ZFHD…[17], [21], [33].
Gen DREB