BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
= = = = = = = =
NGUYỄN THỊ THỦY
NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH CÁC CON LAI SOMA
KHOAI TÂY VÀ CÁC ðẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC
CỦA CÁC DÒNG CON LAI ðÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyªn ngµnh : Công nghệ sinh học
M· sè : 60.42.80
Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: GS.TS. NGUYÔN QUANG TH¹CH

HÀ NỘI – 2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………


Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh ñạo Viện Sinh học Nông nghiệp –
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi
về thời gian, cơ sở vật chất thiết bị trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè, ñồng
nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập, ñóng góp
những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành ñược nghiên cứu này.

Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2012
Tác giả
Nguyễn Thị Thủy Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii
MỤC LỤC


2.4.1. Các giải pháp về canh tác 15
2.4.2. Giải pháp công nghệ sinh học 15
2.5. Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần 19
2.5.1. Nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới. 19
2.5.2. Một số nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên ñối tượng cây khoai tây
ở Việt Nam 24
3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
3.1. ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 25
3.2. Nội dung nghiên cứu 26
3.3. Phương pháp nghiên cứu. 27
3.3.1. Các phương pháp nghiên cứu trong phòng 27
3.3.2. Các phương pháp ngoài ñồng 32
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
4.1. Chọn lọc các con lai soma (heterozygous) qua phân tích ñộ bội, isozym
và chỉ thị phân tử 33
4.1.1. Xác ñịnh ñộ bội của các dòng lai soma tái sinh ñược sau dung hợp
(phương pháp flow cytometry) 33
4.1.2. Xác ñịnh con lai soma bằng phương pháp Isozyme 34
4.1.3. Xác ñịnh con lai soma bằng chỉ thị SSR trên máy Beckman Coutler 37
4.2. ðánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và hình thành củ trong ñiều
kiện in vitro của các con lai soma heterozygous (dị nhân) xác ñịnh ñược 43
4.2.1. ðánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của con lai soma
heterozygous (dị nhân) trong ñiều kiện in vitro. 44
4.2.2. ðánh giá khả năng tạo củ của các dòng “bố mẹ” và con lai của chúng.
45
4.3. ðánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển và các yếu tố hình thành năng
suất của các dòng “bố mẹ” và con lai soma trong ñiều kiện chậu vại 47
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v

giới năm 2011 (FAOSTAT) 8

Bảng 2.2. Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007 9

Bảng 2.3. Nhóm virus chính hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987;
Burton 1989; Brunt và cs. 1996) [15] 12

Bảng 3.1. Các dòng lai soma tái sinh ñược từ 4 tổ hợp dung hợp 25

nghiên cứu 25

Bảng 4.1. Kết quả xác ñịnh ñộ bội các dòng lai soma tái sinh sau dung hợp 34

Bảng 4.2. Trình tự và nhiệt ñộ gắn mồi sử dụng trong phân tích PCR 37

Bảng 4.3. Kết quả ñánh giá ña hình các dòng “bố mẹ” nhị bội 38

Bảng 4.4. Kết quả xác ñịnh con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR 43

Bảng 4.5. ðánh giá ñộng thái tăng trưởng chiều cao, số lá của các con lai và
“bố mẹ” của chúng sau 4 tuần theo dõi trong ñiều kiện in vitro trên tổ hợp
B208+B186 44

Bảng 4.6. Kết quả ñánh giả khả năng tạo củ các con lai soma dị nhân xác ñịnh
ñược trong ñiều kiện in vitro của tổ hợp B208 + B186 45

Bảng 4.7. ðộng thái tăng trưởng chiều cao, số lá các con lai của tổ hợp lai
B208+B186 47

Bảng 4.8. Năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất các con lai soma dị nhân

sinh bằng phương pháp dòng chảy tế bào (flow cytometry) 33

Hình 4.2. Hình ảnh xác ñịnh con lai soma bằng isozym với hai hệ enzym khác
nhau 36

Hình 4.3. Kết quả phân tích con lai của tổ hợp lai B208+B186 sử dụng mồi
STM - 3023 40

Hình 4.4. Kết quả phân tích con lai của tổ hợp lai A15+A56 sử dụng mồi
STM - 3023 41

Hình 4.5. Kết quả phân tích con lai của tổ hợp lai A15+B208 sử dụng mồi
STM - 3023 41

Hình 4.6. Kết quả phân tích một số con lai của tổ hợp lai A16+B208 sử dụng
mồi STM - 3023 42

Hình 4.7. Hình ảnh cây “bố mẹ” và các dòng con lai sau 30 ngày theo dõi
trong ñiều kiện in vitro 45

Hình 4.8. Khả năng tạo củ của các con lai sau dung hợp trong ñiều kiện in
vitro sau 60 ngày 46

Hình 4.9. Hình dạng củ của các dòng con lai của tổ hợp B208+B186 50

Hình 4.10. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu GM339
liên kết chặt với gen Nb – gen kháng virus PVX 53

Hình 4.11. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu STM
0003 liên kết chặt với gen Ry

9 cs Cộng sự
10 PVY Potato virus Y
11 PVYN Potato virus Y strain N
12 PVYC Potato virus Y strain C
13 PVYO Potato virus Y strain O
14 PVYNTN Potato virus Y strain (variant) NTN
15 PA Polyacrylamid
16 DAS-ELISA Double Antibody Sanwich- Enzyme linked
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1
1. MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề
Khoai tây là cây trồng lý tưởng cho vụ ðông ở ðồng bằng Sông Hồng,
tuy nhiên diện tích khoai tây của Việt Nam không vượt quá 50.000 ha. Có
nhiều nguyên nhân hạn chế sự phát triển khoai tây của Việt Nam nhưng
nguyên nhân chính là do công tác giống khoai tây. Công tác giống khoai tây
có vai trò quyết ñịnh sự phát triển ngành sản xuất khoai tây của Việt Nam. Có
2 vấn ñề bức xúc của công tác giống khoai tây là:
(1) Chưa xây dựng ñược hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh tại
chỗ nhằm chủ ñộng cung cấp củ giống sạch bệnh thay cho các giống cũ ñã
thoái hóa do bị bệnh virus. Các giống khoai tây sử dụng trong sản xuất chủ
yếu vẫn phải nhập nội.
(2) Còn có rất nhiều khó khăn và hạn chế trong công tác chọn tạo giống
khoai tây phù hợp với ñiều kiện sinh thái Việt Nam có năng suất cao, phẩm
chất tốt (ăn tươi hoặc chế biến) và ñặc biệt có ñặc tính kháng bệnh nhất là
bệnh virus PVX, PVY gây thoái hóa giống khoai tây.
Ở Việt Nam các nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây chủ yếu vẫn sử
dụng các phương pháp chọn tạo giống truyền thống. ðiều này gặp rất nhiều

gen kháng và phương pháp lây nhiễm nhân tạo
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của ñề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học mới và có
giá trị về khả năng sinh trưởng phát triển, hình thành củ và kháng virus của
các con lai soma từ dung hợp protoplast của các giống khoai tây nhị bội mang
gen kháng virus.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3
Kết quả là tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu về tạo giống khoai
tây kháng bệnh virus thông qua dung hợp tế bào trần.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ñược các dòng khoai tây tứ bội có khả năng kháng virus PVX,
PVY làm vật liệu khởi ñầu cho các nghiên cứu chọn tạo giống tiếp theo

yếu ở ðồng Bằng Sông Hồng, Sapa, ðà Lạt những vùng có khí hậu mát mẻ,
ôn hòa… (ðỗ Kim Chung, 2003).[1], [2]
2.1.2. Phân loại
Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S. tuberosum, chi
Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớp
Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta. Trong chi này có khoảng trên 200 loài
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5
ñược phân bố khắp thế giới. Sự ña dạng về loài, giống tập trung chủ yếu ở
vùng Trung – Nam Mỹ và Australia cùng với loài S. tuberosum có khoảng 7
loài trồng trọt khác.
Có nhiều cách ñể phân loại khoai tây; dựa vào ñặc ñiểm hình thái thân,
lá, hoa…hay số lượng nhiễm sắc thể…Theo J.G Hawkerkks (1991), khoai tây
ñược phân thành 18 nhóm, trong ñó có 68 loài dại, chỉ có 8 loài trồng trọt,
ñược chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa vào số lượng NST (Tạ Thu Cúc,
2007).[3]
• Nhóm 1: Diploid: 2n = 2x = 24.
S. arjanhuiri juz.et Buk
S. gomiocalyx juz.et Buck
S. stenotomum Juz.et Buk
S. phueja Juz.et Buk.
Trong các loài trên, loài S. phueja Juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất với trồng trọt.
• Nhóm 2 : Triploid: 2n = 3x = 36.
S. chaucha Juz. Et Buk. là dạng lai tự nhiên giữa S. tuberosum
subp.vaifigena và S. stenotomum.
S. juzepczukii Buk. Là dạng lai tự nhiên giữ S. acuale và S.
snenotomum, phân bố ở trung Peru ñến Nam Bolivia, có khả năng kháng bệnh
sương mai.
• Nhóm 3 : Tetraploid: 2n = 4x = 48.

C. Nhiệt ñộ lớn hơn 25
o
C làm mầm phát triển chậm và dễ thối.
Thời kỳ sinh trưởng thân lá nhiệt ñộ thích hợp là 20
o
C – 22
o
C
Thời kỳ hình thành và phát triển củ: Quá trình tích lũy tinh bột vào củ hình
thành khó khăn hơn, tia củ vươn dài và thời gian hình thành củ kéo dài hơn
dẫn ñến giảm năng suất, củ khoa tây bị dị hình.
ðộ dài ngày ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của cây
khoai tây. Khoai tây là cây ưa ánh sáng ngày dài. Cường ñộ ánh sáng thích
hợp từ 40000 – 60000 Lux sẽ cho năng suất cao. Cường ñộ ánh sáng mạnh có
lợi cho quang hợp, sẽ thuận lợi cho sự hình thành và tích luỹ chất khô. Các
thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu thời gian chiếu sáng khác nhau.
Từ khi khoai tây mọc khỏi mặt ñất cho ñến thời kỳ xuất hiện nụ hoa
yêu cầu thời gian chiếu sáng dài ñể cây quang hợp và tích lũy vật chất.
Thời kỳ phát triển tia củ yêu cầu thời gian chiếu sáng ngắn ñể thúc ñẩy
hình thành thân và củ (Mai Thạch Hoành, 2003).[4]
* ðộ ẩm:
Khoai tây là cây có bộ rễ ăn nông, tiềm năng năng suất cao nên ñể cây
khoai tây sinh trưởng, phát triển tốt cần phải cung cấp nước thường xuyên.
Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu về nước cũng khác nhau:
Thời kỳ trồng ñến xuất hiện tia củ ñảm bảo ñộ ẩm tối thiểu 60 – 80%.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7
Thời kỳ phát triển củ cần thường xuyên giữ ẩm ñộ ẩm ñất là 80%.
Thiếu nước hoặc thừa nước ñều ảnh hưởng xấu ñến sinh trưởng của cây

Diện tích
(ha)
Sản lượng
(tấn)
Năng suất
(tấn/ha)
Trung Quốc
Ấn ðộ
Nga
Ukraine
Mỹ
ðức
Ba Lan
Bangladesh
Belarus
Netherlands
Các nước khác
5 077 504
1 863 000
2 109 100
1 408 000
406 588
255 200
490 853
435 000
366 766
156 969
6 061 218
74 799 084


18,7
Thế giới 18 630 198 330 047 109

17,7 Khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ sau ñó mở rộng sang các nước
phát triển. Vậy tại sao hiện nay khoai tây ñược trồng chủ yếu ở những nước
ñang phát triển? Theo các chuyên gia nhận ñịnh: Khoai tây chính là cây lương
thực của tương lai dành cho những nước nghèo và nước ñang phát triển “Khi
giá lúa gạo và lúa mỳ tăng lên, lúc này khoai tây ñược phát hiện là nguồn cây
trồng giàu dinh dưỡng cho những nước ñó với giá rất rẻ” (FAO, 2006) [65].
Mặt khác “Khoai tây là cây trồng tạo ra khối lượng sinh học và năng lượng
nhiều hơn bất kỳ một loại cây trồng lương thực nào (trừ lúa gạo, ngô, lúa mỳ)
trong thời gian ngắn trên cùng một ñơn vị diện tích” (FAO, 2005). [65]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9
Bảng 2.2. Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007
(triệu tấn) (FAOSTAT)
Năm
Quốc gia
1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007
Phát triển 183.13 199.31

177.47

174.63


313.08

319.98

325.30

Qua bảng 2.2 cho thấy: Từ năm 1991 – 2003 sản lượng khoai tây ở các
nước ñang phát triển tăng liên tục từ 84,86 triệu tấn (1991) lên 152,11 triệu
tấn (2003) và tăng ñều hơn so với các nước phát triển mặc dù sản lượng thấp
hơn. Bởi các nước ñang phát triển ngày càng mở rộng diện tích trồng nhưng
năng suất không cao, còn các nước phát triển thì diện tích thu dẹp dần, năng
suất khá cao do có vốn ñầu tư lớn và kinh nghiệm trồng trọt lâu năm. Vào
những năm 2005, lần ñầu tiên sản lượng khoai tây ở các nước ñang phát triển
vượt qua sản lượng khoai tây ở các nước phát triển. Trong ñó Trung Quốc là
quốc gia dẫn ñầu về sản lượng khoai tây ñạt 72 triệu tấn năm 2007 và 1/3 sản
lượng khoai tây của thế giới ñược thu hoạch ở Trung Quốc và Ấn ðộ.
Ở các nước ñang phát triển có diện tích trồng lớn nhưng năng suất kém
một phần là do nguồn giống không ñảm bảo chất lượng, củ giống không rõ
nguồn gốc, dễ bị nhiễm bệnh nhất là bệnh virus sau vài năm trồng, dẫn ñến sự
thoái hóa củ giống nghiêm trọng ảnh hưởng ñến năng suất và chất lượng củ.
Do vậy, các nhà nghiên cứu ñang xây dựng chiến lược sản xuất củ giống sạch
bệnh và có phẩm chất tốt phục vụ sản xuất khoai tây thương mại.
2.2.2. Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam
Vấn ñề khó khăn nhất hiện nay ñối với ngành sản xuất khoai tây ñó là
giống. Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ ñáp ứng từ 20 – 25% nhu
cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan…
Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10

11
2.3.1. Tìm hiểu về virus hại khoai tây
Bệnh virus là bệnh rất nguy hiểm, khi xâm nhập vào cây, virus sẽ tấn
công vào các tế bào, các cơ quan làm thay ñổi các quá trình trao ñổi chất của
cây, qua ñó sẽ làm ảnh hưởng lớn ñến năng suất. Khi cây bị nhiễm virus
không thể chữa, chỉ có thể nhổ cây bị hại vứt xa nguồn nước và nơi trồng. Bởi
vì virus tồn tại ở các mô sống nên virus rất nguy hiểm ñối với những cây
trồng nhân giống vô tính bằng củ tiếp tục nhân lên ở các thế hệ sau. Ngoài ra
bệnh virus còn ñược lan truyền do côn trùng hoặc tiếp xúc cơ giới.
Theo (Vũ Triệu Mân, 1978) [6] và một số tác giả khác cho rằng: virus
ñã làm ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất và phẩm chất khoai tây, ñặc biệt là
virus PVY làm giảm năng suất từ 50% - 90%. Chính vì vậy, ñến nay dù có
nhiều tác nhân gây bệnh hại khoai tây nhưng virus vẫn là nguyên nhân chủ
yếu làm giảm năng suất kinh tế một cách trầm trọng.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thơ, Nguyễn Phương ðại, Hà Minh Trung,
Vũ Triệu Mân (1978 – 1986) [6,7] về virus khoai tây ở Miền Bắc Việt Nam cho
thấy: Bệnh virus khoai tây ở Việt Nam do 7 loài virus gây hại chính. ðó là:
Virus Y khoai tây (PVY)
Virus X khoai tây (PVX)
VirusA khoai tây (PVA)
Virus S khoai tây (PVS)
Virus M khoai tây (PVM)
Virus cuốn lá khoai tây (PLRV)
Virus khảm Aucuba khoai tây (PAMV)
Năm 1991 Ủy Ban Quốc Tế về phân loại virus (ICTV–International
Committee on Taxonomy of Viruses) ñã xây dựng hệ thống dữ liệu về các
nhóm virus gồm ñặc ñiểm của từng nhóm và hệ thống hóa số liệu ño lường
(số hóa) các loại virus ñó.
Với loài S. Tuberosum L. phát hiện tác nhân virus gây bệnh chính như sau:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

39.0.0.1.0.012

57.0.1.0.058

57.0.1.0.056

57.0.1.057

56.0.1.0.018

14.0.1.0.025 14.0.1.026• PLRV – Peters phát hiện năm 1967 ở Hà Lan, gây ra nhiều triệu chứng
khác nhau. Loại virus này gây hại mạnh ở Châu Âu. Khả năng giảm năng suất
từ 40-90%. Ở Việt Nam khoai tây ít bị nhiễm virus này (Bode, 1969).
• PVY – Smith phát hiện năm 1931 tại Anh. Nhóm này gồm 3 dòng
chính: PVY
O
gây bệnh quan trọng ở khắp thế giới, PVY
N
gây ra các vết chết
hoại trên gân lá thuốc lá, PVY
C
ít nguy hiểm, không phổ biến trên thế giới.
Bên cạnh ñó mới phát hiện ra PVY
NTN
, PVY
NW
, PVY

Virus khoai tây ñược ñánh giá là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm,
làm giảm ñáng kể năng suất và chất lượng củ. Bởi bệnh virus có những ñặc
tính sau:
- Là bệnh không chữa ñược khi ñã bị nhiễm. Do virus khi xâm nhiễm
vào cây trồng chúng không có sự trao ñổi chất riêng và ñộc lập mà phải sử
dụng vật chất của ký chủ ñể nhân lên, tấn công các tế bào khác từ vị trí xâm
nhiễm. Như vậy, tế bào ký chủ ñã làm nhiệm vụ nhân virus lên, nên nếu tác
nhân nào ngăn chặn sự tái bản của phân tử virus ñồng thời cũng ức chế các
quá trình sinh tổng hợp của ký chủ.
- Bệnh virus khoai tây có ñặc tính di truyền. Ở những cây nhân giống
theo con ñường hữu tính, bệnh virus rất ít truyền qua hạt. Ngược lại cây nhân
giống vô tính, virus có mặt ở mọi tế bào ñang sống nên rất dễ lan truyền. Khi
virus xâm nhiễm vào cây chúng nhân lên và di chuyển theo dòng nhựa luyện
tới các bộ phận trong cây, tới tận các củ con. Khi ñó, một củ mẹ bị nhiễm
bệnh sẽ tạo ra một cây bệnh, cây này lại tạo ra các thế hệ củ con bị nhiễm
virus. Do vậy, năm này qua năn khác bệnh càng mở rộng, tăng lên nhanh
chóng. Sự xâm nhiễm virus rất khó phát hiện, diễn ra trong suốt quá trình
sống của cây.
- Bệnh virus lan truyền qua các vector truyền bệnh và tiếp xúc cơ giới.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14
Tùy từng kiểu truyền bệnh của côn trùng mà virus ñược truyền ngay hoặc có thời
gian tiềm ẩn trong cơ thể côn trùng kể từ khi trích nạp virus cho tới lúc truyền
sang cây mới.
Từ những nguyên nhân trên dẫn tới khi khoai tây bị nhiễm virus sẽ gây
nên hiện tượng thoái hóa giống. Nghĩa là làm giảm dần năng suất gieo trồng
của củ, biểu hiện củ nhỏ ñi về kích thước và trọng lượng, chất lượng củ xấu,
hàm lượng dinh dưỡng giảm so với trước, thân lá bị biến dạng làm giảm khả
năng quang hợp Nếu hiện tượng này diễn ra dài có thể dẫn ñến tiêu diệt