MÔN: SINH HỌC PHÂN
MÔN: SINH HỌC PHÂN
TỬ
TỬ
GVHD:
GVHD:
NGUYỄN THỊ DUY KHOA
NGUYỄN THỊ DUY KHOA
GVHD:
GVHD:
NGUYỄN THỊ DUY KHOA
NGUYỄN THỊ DUY KHOA

I. KHÁI NIỆM
I. KHÁI NIỆM

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction

PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng khuếch đại
gen".

PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch
đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các
sinh vật sống như E. coli hay nấm men.

PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ
nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận
dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác
định huyết thống
II.
II.

PCR machine
chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun
nóng và làm nguội trong ống
phản ứng ở nhiệt độ chính xác
cho mỗi phản ứng. Để
ngăn ngừa sự bay hơi của
hỗn hợp phản ứng, phần nắp
đậy của máy PCR cũng được
đun nóng, trường hợp lượng
dung dịch phản ứng quá ít,
người ta cho một lớp dầu
(natural oil) lên trên bề mặt
hỗn hợp phản ứng. Năm
2004, giá máy khoảng 2500
USD Phản ứng PCR được
thực hiện trong
III.1 Đoạn mồi
Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá
50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi,
chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base
(bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay
nucleotides)
III.2 Quy trình
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước:
- Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước
này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi
DNA.
- Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống
để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi.

được tiến hành theo qui trình
khép kín.
Trước tiên, mẫu tôm Post
được nghiền nhuyễn trong một
dung dịch tách chiết gen di
truyền (DNA).
Sau đó, hỗn hợp này
được đưa qua nồi hấp cách thủy
trong vòng 10 phút nhằm làm sốc
nhiệt để trích ly DNA.
Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong
xét nghiệm bệnh tôm
Hỗn hợp dung dịch và tôm post
nghiền nhuyễn lại trải qua công đoạn
làm lạnh nhanh, cho vào tủ đông ở
nhiệt độ (-200C) trong vòng 15 phút.
Hỗn hợp tiếp tục được đưa vào
máy ly tâm khoảng 5 phút, với tốc độ
780.000 vòng/h để loại tạp chất.
Phần cặn bã và chất hữu cơ bị
lắng xuống đáy. Phần dung dịch còn lại
có chứa DNA.
Bến Tre ứng dụng công nghệ PCR Real-time trong
xét nghiệm bệnh tôm
Dùng thiết bị chuyên
dụng lấy khoảng 2 µl (microlít)
dung dịch này cho vào một ống
có chứa hóa chất gọi là ống
phản ứng.
Ống phản ứng được đặt

lượng >50ng/ml
b. Kỹ thuật PCR:
Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồi và
tổng hợp. Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắn mồi
khác nhau được lựa chọn từ 50oC đến 58oC. Sản phẩm PCR
sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộm ethidium
bromide (25mg/ml).
2. Phương pháp:
c. Kỹ thuật điện di:
Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR
đã được kiểm tra trên gel agaroza 2% sau
đó được điện di trên gel polyacrylamide
6% sử dụng ure 7M. Băng ADN được phát
hiện bằng phương pháp nhuộm bạc của
Bassam, 1991.
d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang
alen
* Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào các alen
quan sát được của các mẫu khác nhau trên bản điện di,
chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau và
đánh số alen theo thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từ
băng ADN có trọng lượng phân tử thấp nhất đến băng
ADN có trọng lượng phân tử cao nhất). Việc đánh số ở
đây chỉ mang tính quy ước sao cho mỗi alen xác định
được có ký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban đầu
chưa có thang alen chuẩn để so sánh.
d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang
alen
* Xây dựng thang alen: Trong quá trình
đánh số, chúng tôi đồng thời chọn ra những

xác các đặc trưng cá thể ở người bằng kỹ thuật
PCR"
Với các mẫu máu, tóc, nước bọt ở các cá thể
khác nhau, dùng PCR có thể tìm ra các tính trạng
chung ở các cá thể có cùng huyết thống
Hiện nay, để xác định huyết thống, thế
giới thường dùng từ 8-14 gen. Phòng thí
nghiệm của chúng tôi đã đưa vào ứng dụng
thường xuyên hàng ngày 13 gen. Vì với
mỗi trường hợp cụ thể, cần sử dụng những
gien khác nhau và với mỗi trường hợp chỉ
dùng từ 8-14 gien là đủ
CÁC CÁCH LẤY MẪU

Cách thu thập mẫu ADN bằng tăm bông: Mẫu lấy ở đây
không phải là nước bọt mà là các tế bào má từ bên trong
miệng

Việc lấy mẫu máu khô