- 1 -
1/ Đặt vấn đề :
Di truyền học phân phân tử nghiên cứu cấu trúc các gen và sự vận
hành các sản phẩm của chúng trong một tế bào. Lãnh vực này không ngừng
được phát triển là nhờ kỹ thuật liên quan đến sự thao tác ADN, ARN và
protein thay đổi mau lẹ và mạnh mẽ mà các kỹ thuật đó ngày nay được gọi là
công nghệ gen hay công nghệ tái tổ hợp ADN.
Công nghệ tái tổ hợp ADN là những kỹ thuật tách và tái tổ hợp lại các
gen invitro. ADN tái tổ hợp là phân tử ADN lai từ ADN của hai lồi khác
nhau. Ví dụ một gen cần nghiên cứu được gắn vào ADN của virus tạo ADN
tái tổ hợp. Quá trình tách gen cần nghiên cứu, sử dụng rồi gắn vào ADN khác
(như ADN virus, ADN plasmid…) tạo ra ADN tái tổ hợp rồi chuyển ADN tái
tổ hợp vào tế bào cần thiết là các kỹ thuật cơ bản củ công nghệ tái tổ hợp
ADN.
Các enzym cắt hạn chế RE và các vector là các công cụ sử dụng trong
công nghệ tái tổ hợp ADN. Đề tài: “ Vai trò của enzyme restriction và
plasmid trong ứng dụng của sinh học phân tử” giúp người viết hiểu
hơn về vai trò của sinh học phân tử trong nhiều lĩnh vực khoa học.
2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu :
Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và các
enzym.
Phạm vi nghiên cứu: chỉ tập trung nghiên cứu vai trò của enzyme
restriction và plasmid thông qua kỹ thuật tái tổ hợp ADN.
3/ Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu
được lấy từ các nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet. Dựa vào sự
phân tích, tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Mặc dù đề tài được chuẩn bị khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn sơ
suất, rất mong được sự góp ý của quí thầy hướng dẫn và các bạn đồng
nghiệp. Tác giả chân thành biết ơn.
4/ Cấu trúc tiểu luận:

các enzym nuclease, ADN-polymerase, ligase, reverse transcriptase, terminal
transferase, trong đó vai trò hàng đầu là các enzyme restriction.
Vào năm 1962, V.Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những enzyme
đặc biệt hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phân biệt ADN
PHẦN NỘI DUNG
- 3 -
của mình với ADN lạ của phage. Các enzym này hạn chế khả năng sinh sản
của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng một cách đặc hiệu
do đó gọi theo tiếng Anh là Restriction enzyme. Chữ restriction có nghĩa là
hạn chế có nguồn gốc lịch sử từ đó và được dùng đến nay.
Các enzyme phân cắt ADN được gọi là nuclease gồm 2 loại là
exonuclease và endonuclease. Exonuclease cắt ADN từ 2 đầu mút, còn
endonuclease cắt ADN ở giữa phân tử. Các restriction enzyme cắt phân tử
AND ở giữa một cách đặc hiệu nên được gọi là restriction endonuclease.
Năm 1970, H.Smith và các cộng tác viên đã tách được restriction
endonuclease đầu tiên từ vi khuẩn Haemophilus influenzae Rd được gọi là
HindII. Các enzyme restriction endonuclease nằm trong hệ thống chuyên biệt
hạn chế- biến đổi ( restrictio-modification system) để bảo vệ tế bào khỏi sự
xâm nhập của ADN lạ.
Các restriction enzyme nhận biết ADN mạch kép ở những trình tự nhất
định thường được gọi là điểm nhận biết (recognition sites) và cắt ADN ở
ngay điểm này hay kế cận. Các điểm nhận biết này thường có trình tự 4-8 cặp
nucleotide đối xứng đảo ngược nhau, được gọi là các palyndrom. Sự cắt
ADN như vậy có thể tạo đầu tù hay đầu bằng (HpaI) hoặc đầu dính (BamHI)
phụ thuộc vào cơ chế cắt của enzyme. Đầu dính đặc biệt được sử dụng trong
cấu trúc phân tử ADN lai hay khảm.
Ngày nay hơn 500 loại restriction endonuclease đã được phát hiện,
chúng có khả năng cắt ADN tổng cộng với hơn 120 trình tự nhận biết khác
nhau. Hàng trăm loại restriction endonuclease được bán ở thị trường. Mỗi
restriction endonuclease có trình tự nhận biết đặc trưng.

Tính chất quan trọng này được sử dụng để cắt và ghép các gen.
Các enzyme endonucleaza hạn chế và những đoạn cắt của chúng
Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn
Bam III G G A T C C
C C T A G G
Bacillus amylolique faciens H
Bgl II A G A T C T
T C T A G A
Bacillus globigi
Hind III A A G C T T
T T C G A A
Haemophilus influenzeae R
d
Eco RII C C T G G
G G A C C
Escherichia coli R245
Hpa I G T T A A C
C A A T T G
Haemophilus parainfluenzea
Hha I G C G C Haemophilus haemolyticus
- 5 -
C G C G
Taq I T C G A
A G C T
Thermus aquaticus YTI
II.THU NHẬN GEN :
Có thể thu nhậân gen cho việc thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba
phương pháp : tách trực tiếp từ ADN bộ gen, tổng hợp hóa học và sinh tổng
hợp gen từ mARN tương ứng.
1.Tạo các đoạn ADN có chứa gen từ bộ gen :

đó.
- 6 -
III.CÁC VECTOR CHUYỂN GEN:
Vật chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập
trong tế bào và mang được đoạn gen cần thiết . Các vật chuyển gen phải thỏa
mãn các yêu cấu tối thiểu :
*Có các trình tự xuất phát sao chép (ori) để có thể tồn tại độc lập.
*Có các trình tự nhận biết (ricognition site) mà các restriction
endonuclease nhận biết để cắt.
*Các trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ.
*Đảm bảo sự di truyền bền vững của ADN tái tổ hợp ở dạng độc lập
hay gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ.
*Có các gen đánh dấu để dễ phát hiện vector hoặc các gen gắn vào.
1.Các vector chuyển gen plasmid :
a.Vector pBR322.
Các vector thông dụng được sử dụng với E.coli trước tiên phải kể đến
là pBR322 (chữ p là chữ viết tắt của cụm từ plasmid ; BR là tên viết tắt của
hai nhà khoa học ở phòng thí nghiệm đầu tiên tìm ra vector này là : F.Bolivar
và R.Rodrigues ; 322 là danh số của plasmid này để phân biệt với các
plasmid khác trong khi nghiên cứu cũng do phòng thí nghiệm này tìm ra như
pBR325, pBR327 ).
Plasmid có kích thước nhỏ hơn 10kb nên dễ loại trừ vấn đề ADN bị
gãy khi làm sạch : pBR322 có 4361 cặp base. Kích thước đó nói lên rằng,
không chỉ vector có thể làm sạch một cách dễ dàng mà còn có thể cả phân tử
ADN được cấu trúc với nó. Thậm chí thêm vào 6 kb ADN, phân tử pBR322
tái tổ hợp vẫn còn là kích thước có thể điều khiển được.
Plasmid này có hai bộ gen kháng kháng sinh là gen kháng ampicilin
hoặc gen kháng tetracyclin được dùng làm marker chọn lựa đối với tế bào
chứa plasmid này. Mỗi gen marker gồm những vị trí cắt gen hạn chế duy
nhất, mà chúng được dùng trong các thí nghiệm chọn dòng.

với pBR322 ở hai phương diện:
- pARI 53 có số lượng bản sao cao hơn pBR322, thường có mặt
khoảng 30-45 phân tử trên một E.coli. Với số lượng copy này thì dễ dàng
được phát hiện khi nghiên cứu hiệu quả của gen được chọn dòng trong tế bào
chủ.
- pARI 53 là một plasmid không liên tục, không trực tiếp vận chuyển
được tới tế bào E.coli khác do sự phát đi 700 đôi base đã làm phá hủy khả
năng liên tục của pBR322. Điều này quan trọng đối với sự kiềm chế sinh học
để tránh đi khả năng làm tẩu thốt phân tử pATK- 53 tái tổ hợp từ trong các
ống nghiệm.
d.Vector pUC8-sự chọn dòng gen lacZ.
Vector pUC8 đã được dẫn ra từ pBR322, mặc dù trong trường hợp này
sự tái bản và gen amp
R
vẫn còn nguyên vẹn. Một đoạn nucleotide của gen này
đã bị thay đổi. Tất cả những vị trí chọn dòng bây giờ đã được tụ tập lại trong
một đoạn ngắn của gen lacz
1
. Sự chọn dòng bằng gen lacz
1
không thuận tiện
hơn khi dùng marker kháng sinh song giá trị của nó ở chỗ là tập trung lại
được các vị trí cắt hạn chế và cho phép một đoạn ADN có hai đầu dính khác
nhau được chọn dòng mà không còn chất gắn.
2.Các vector chuyển gen là phage lamda :
- 8 -
Phân tử ADN lamda chứa 52 kb có thể tăng lên khồng 5% tức là
khoảng 3 kb ADN mới thêm vào nữa. Nếu kích thước của phân tử lớn hơn 52
kb, thì nó không bao gói vào cấu trúc đầu lamda được và các tiểu phần phage
gây nhiễm không tiến hành được. Điều đó làm hạn chế kích thước của đoạn

mở ra một vị trí cắt hạn chế và những đoạn ADN mới được gài vào. Những
đoạn này thì được sản xuất bằng enzyme cắt hạn chế và được dẫn vào
cosmid. Sự kết nối được giản ra. Sau đó ADN cosmid tái tổ hợp được bao gói
và làm nhiễm E.coli mặc dù vòng plaque không được hình thành.
Cosmid được dùng để thuần hóa những đoạn ADN lớn có khi tới 40kb.
Khả năng này đã làm dấy lênvấn đề thư viện genom hay còn gọi là thư viện
bộ gen. Thư viện bộ gen là một bộ của dòng tái tổ hợp-mà dòng đó chứa tất
cả các ADN có mặt trong một cơ thể riêng lẻ, chẳng hạn thư viện bộ gen
E.coli chứa tất cả những gen E.coli. Các cơ thể có thư viện bộ gen được giới
thiệu ở bảng sau :
- 9 -
Số lượng các dòng gen có mặt trong thư viện bộ gen của các cá thể.
Các cá thể khác nhau Kích thước bộ
gen (đôi base)
Số đoạn dài
17 kb (1)
Số đoạn dài
35 kb (2)
Escherichia coli 4x10
6
700 340
Bacillus megaterium 3x10
7
5.300 2.600
Aspergillus nidulans 4x10
7
7.000 3.400
Saccharomyces cerevisiae 7x10
7
12.500 6.000

EcoRI và BamHI. YAC bị đứt thành 2 đoạn A và B, mỗi cái có một đầu TEL
và đầu kia là EcoRI. Nếu ADN, ví dụ của người, cũng bị cắt rất nhẹ nhàng
bằng EcoRI thì nhờ các đầu cố kết, chúng sẽ gắn vào trình tự EcoRI và nối A
với B thành nhiễm sắc thể nhân tạo có khả năng sao chép nhờ Ori và phân
chia đều về các cực của tế bào nhờ CEN. YAC có khả năng mang đoạn gen
rất dài, có thể đến 1 triệu cặp nucleotide.
IV.TẠO ADN TÁI TỔ HỢP (recombinant ADN) :
Bước tiếp theo là gắn các đoạn ADN lạ hay các c-ADN vào vector
chuyển gen để tạo plasmid tái tổ hợp có mang ADN lạ. Phương pháp gắn các
đoạn ADN vào vector đơn giản dùng các đầu mút cố kế hay đầu dính.
Phương pháp này dựa trên cơ sở sự gắn các đoạn ADN với nhau, mà
mỗi một trong chúng có đầu dính tương tự nhận được do bị cắt bơiû cùng
một loại restriction endonuclease. Dưới đây là sơ đồ mô tả quá trình gắn
ADN lạ vào vector chuyển gen nhờ có đầu dính hay đầu cố kết :
- 11 -
Vector là ADN vòng tròn được cắt bởi một loại restristion
endonuclease (ví dụ Eco RI) chuyển thành dạng thẳng có hai đầu cố kết. Các
phân tử ADN của bộ gen khác được cắt bởi cùng một loại restriction nuclease
sẽ tạo ra nhiều đoạn ADN thẳng có các đầu dính. Trộn lẫn ADN thẳng của
vector chuyển gen với các đoạn ADN lạ. Các đầu dính của hai loại ADN bổ
sung bắt cặp với nhau. Enzyme ligase hàn dính các loại ADN lại với nhau tạo
ra plasmid tái tổ hợp (còn gọi là ADN tái tổ hợp).
V.TẠO DÒNG PHÂN TỬ :
1.Các loại vector trong tạo dòng
Loại vector Đặc tính
1. Vector plasmid -Thông thường gắn 8-9kb ADN lạ, tế
bào chủ là vi khuẩn.
2. Vector phage -Có thể gắn 15-20kb ADN lạ, xâm
nhiễm tế bào vi khuẩn cao.
3. Vector cosmid (phối hợp giữa

-Kích thước của các plasmid khoảng từ 10kb cho tới 250 kb.
-Số lượng bản sao từ 1 đến 50.
-Có năm loại plasmid chính :
*Plasmid F-có khả năng khởi động chuyển plasmid sang một cơ
thể khác.
*Plasmid R kháng lại kháng sinh.
*Plasmid col-mã hóa colicin một phân tử protein giết vi khuẩn
khác.
*Plasmid thối hóa-cho phép vi khuẩn làm thối hóa những phân
tử chuyển hóa không bình thường như toluen, acid salicylic.
*Plasmid độc-gây bệnh lý cho vật chủ như plasmid Ti sinh ra
bệnh ung thư rễ trên cây hai lá mầm.
-Trong nấm men S.cerevisae cũng có plasmid vòng 2 micromet; nó kết
hợp với pBR322 của E.coli tạo ra vector episom gài vào ADN chromosom
của nấm men và nhân lên nhiều lần.
Tóm lại plasmid vi khuẩn là phân tử ADN hai chuỗi vòng nhỏ, có chức
phận tự nhiên là kháng kháng sinh. Plasmid có nhiều đặc tính mà những đặc
tính đó được sử dụng đặc biệt vào cấu trúc vector chọn dòng. Chúng có thể
có một bàn duy nhất hay nhiều bản sao trong phạm vi một vi khuẩn và tái bản
không lệ thuộc vào ADN của vi khuẩn. Thứ tự ADN tồn bộ của nhiều
plasmid đã biết được. Nhờ đó người ta có thể gài đoạn ADN ngoại lai vào
những vị trí chính xác bởi những enzym cắt hạn chế. Plasmid nhỏ hơn nhiễm
sắc thể vật chủ (vi khuẩn), bởi vậy người ta có thể tách nó dễ dàng ra khỏi
ADN vi khuẩn để thao tác gắn ADN ngoại lai.
- 13 -
Từ khi phát hiện được plasmid có các đặc điểm và tính chất nêu trên,
cho đến nay các plasmid không ngừng được cải tiến, ngày càng mang thêm
nhiều đặc tính quí cho việc tạo dòng. Hiện nay đã sinh ra ba thế hệ của
plasmid.
Các đặc tính của các thế hệ plasmid.

*Nhóm PUC, 2600bp, mang gen ApR và một phàn
gen lacZ để dễ phát hiện mẫu xen vào giữa gen lacZ
là polylinkơ có thể cho phép gắn xen vào bất cứ gen
lạ nào.
*Nhóm pSP và Gemini, 3000bp mang gen ApRp
và polylinkơ, có một promotor đặc trưng cho ARN
polymeraza ở hai bên polylinkơ thuận lợi cho phiên
mã ra nhiểu ARN để làm mẫu dò nghiên cứu.
* Nhóm pBluescript kết hợp được tất cả các ưu
điểm nói trên.
ADN tái tổ hợp tiếp theo được đưa vào tế bào bằng nhiều phương pháp
khác nhau như biến nạp hóa học, điện biến nạp, vi tiêm hoặc bắn vào tế bào.
Từ những dòng tế bào nhận được chọn ra đúng dòng có mang gen lạ, kiểm tra
lại. Những dòng tế bào có mang đúng gen lạ được đem nhân lên và như vậy
- 14 -
gen ban đầu được nhân lên vô số bản sao. Nến những dòng này có khả năng
biểu hiện tốt trong sinh tổng hợp prôtêin thì được sử dụng để tạo sản phẩm.
Phần II: MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT DI
TRUYỀN.
Kỹ thuật di truyền đã dẫn đến nhiều ứng dụng có tính chất cách mạng
trong sinh học và thực tiễn sản xuất. Nó không những là công cụ hữu hiệu
phục vụ cho nghiên cứu mà còn mở ra nhiều ứng dụng mới mà con người
hằng mơ ước. Sau đây là một số ứng dụng chính :
1.ADN và cả ARN trở nên dễ nghiên cứu.
Nhờ kỹ thuật tạo dòng các gen có thể được nhân ra nhiều bản sao và
tương ứng thu được số lượng lớn ADN của gen. Phân tử ADN trở nên dễ
nghiên cứu. Phương pháp xác định trình tự nuclêotide các gen (giải mã gen)
nhanh chóng ra đời. Đến nay việc giải mã bộ gen người có những thành tựu
ngoạn mục làm thay đổi chiến lược y học thế kỷ 21. Hàng chục bộ gen của
các vi sinh vật như Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis, E.coli,

-Thực vật mang gen của đom đóm, gen tổng hợp protein máu người hay
kháng thể của người. Trong tương lai, thực vật sẽ thành nhà máy sản xuất hóa
chất.
-Heo mang gen hormone tăng trưởng của bò hoặc gen của người chống
phản ứng loại bỏ cơ quan lạ nhằm có thể lấy tim heo thay cho tim người
bệnh. Nhiều dạng chuột mang các gen bệnh của người để làm mô hình nghiên
cứu chữa trị các bệnh nguy hiểm
5.Liệu pháp gen :
Nhờ kỹ thuật di truyền khả năng chữa các bệnh di truyền ở người mở ra
triển vọng mới. Nhiều thí nghiệm tiến hành nhằm đưa gen lành vào thay thế
gen bệnh ở những người bị bệnh di truyền do sai hỏng một gen. Hiện nay kết
quả chưa cụ thể nhưng hứa hẹn một triển vọng tốt đẹp cho lồi người.
Tuy điều trị gen mới ra đời, nhưng đến nay đã hình thành một số hướng
về liệu pháp gen trong chưã bệnh cho người như sau :
-Liệu pháp antisense, antigene.
-Đưa một gen mới vào bù đắp cho gen hỏng hóc.
-Đưa một gen mới vào sản xuất ra chất cần thiết để tiêu hủy tế bào bệnh.
-Cấy gen vào các vi khuẩn, nấm men để sản xuất các dược phẩm mới
quý, hiếm sử dụng trong điều trị các bệnh.
-Tái tổ hợp gen trong tạo vaccin thế hệ mới, vaccin phân tử-vaccin ADN.
-Sử dụng kỹ thuật di truyền trong cấy ghép các cơ quan để thay thế
những cơ quan bệnh
-Thay phẫu thuật bằng liệu pháp gen.
Phân loại bệnh Trên các bệnh cụ thể
Các bệnh do virus 1. Adeno virus
2. Herpes simplex virus 1 (HSV 1)
3. Herpes simplex virus 1 (HSV 2)
4. Herpes Zoster
5. Cytimegalovirus (CMV)
6. Epstein-Barr virus (EBV)

trong lập bản đồ giới hạn để so sánh bộ gen giữa các lồi thông qua kỹ
thuật RFLP.
Các plasmid với vai trò làm vector, là công cụ để chọn và tạo dòng
trong công nghệ tái tổ hợp ADN.
KẾT LUẬN
- 17 -
Công nghệ tái tổ hợp ADN ra đời đã dẫn tới những tiến bộ phi thường
trong thực tiễn y khoa và trong nông nghiệp. Công nghệ tái tổ hợp ADN
là sợi chỉ đỏ của công nghệ sinh học. Nhờ công nghệ tái tổ hợp ADN
người ta đã và đang tạo ra các loại cây trồng, vật nuôi biến đổi gen nhằm
cung cấp lương thực phẩm một cách dồi dào và đa dạng; tạo ra các loại
thuốc, các sinh phẩm quý giá đắt tiền để chữa bện; sản xuất ra các bộ kít
chẩn đốn sớm và chính xác các bệnh; tạo ra các vaccine phân tử tái tổ hợp
để phòng các bệnh virus và nhiễm khuẩn.
Công nghệ tái tổ hợp ADN cho phép các nhà sinh học lấy gen từ tế bào
này và ghép vào một tế bào khác. Khi được ghép vào một tế bào mới, gen
có thể biến đổi chức năng của tế bào đó, để có lợi cho con người, vật nuôi
và cây trồng.
Hiện nay công nghệ tái tổ hợp ADN đã mang nhiều hy vọng làm gia
tăng sản lượng nông nghiệp, mùa màng bội thu bằng cách chuyển gen cho
cây trồng và vật nuôi tạo ra giống mới cho năng suất cao, tạo lương thực
phẩm có phẩm chất tốt, tạo giống mới chống chịu với khí hậu khắc nghiệt,
khô hạn, lạnh hay chua mặn và tạo ra giống kháng được nhi62u và chống
được nhiều bệnh tật do vi sinh vật có hại gây ra.
Công nghệ tái tổ hợp ADN cũng đang đuợc nghiên cứu để phát triển
khoa học máy tính : bằng cách sử dụng trình tự ADN để thay thế cho con
bọ bán dẫn, nhằm vượt qua những hạn chế của máy tính điện tử hiện nay.
Công nghệ tái tổ hợp ADN đang giúp cho vấn đề nghiên cứu nguồn
gốc sự sống và đa dạng sinh học, giúp tìm hiểu cơ chế sống, trong đó có
điều hòa hoạt động, biệt hóa, tăng sinh tế bào dẫn đến ung thư ngày