SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI
TRƯỜNG THPT CHUYÊN HÀ NỘI - AMSTERDAM
QUẬN CẦU GIẤY – THÀNH PHỐ HÀ NỘI
**************
ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT
DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015).
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP TĂNG SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY
ĐAN SÂM (SALVIA MILTIORRHIZA BUNGE) PHỤC VỤ
NGÀNH CÔNG NGHIỆP DƯỢC.
Lĩnh vực: Công nghệ sinh học
NGƯỜI HƯỚNG DẪN
GV. Trần Thu Hương
Trường THPT Chuyên HN – Amsterdam.
PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
TÁC GIẢ:
1. Đinh Thục Anh (Nhóm trưởng) - Lớp 11 Sinh –
THPT Chuyên HN – Amsterdam.
2. Nguyễn Minh Châu – Lớp 11 Sinh –
THPT Chuyên HN – Amsterdam.
Hà Nội, tháng 12 năm 2014
MỤC LỤC
MỤC LỤC 2
PHẦN 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN 3
I.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
II.ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI 4
PHẦN 3. NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 4
I. PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 5

khác dẫn đến số lượng thành phẩm thu được không đáp ứng đủ nhu cầu.
Với nhiều khó khăn như đã nêu trên, việc đưa kĩ thuật công nghệ sinh học
như nuôi cấy rễ bất định, rễ tơ… vào sản xuất, thu nhận các hợp chất có hoạt
tính cao đã và đang được nghiên cứu, thử nghiệm rộng rãi trên thế Các nhà khoa
học Việt Nam nghiên cứu và hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính cây sâm
Ngọc Linh, rút ngắn thời gian trồng mà vẫn có đầy đủ lượng hoạt chất saponin ở
thân, củ, rễ… như cây thu hoạch trong tự nhiên.Vậy tại sao chúng ta không thay
cho các phương pháp truyền thống nhiều rủi ro bằng cácg áp dụng kỹ thuật công
nghệ sinh học vào sản xuất các hợp chất thứ cấp chất lượng cao? Dù đòi hỏi chi
phí ban đầu và đội ngũ kỹ thuật viên trình độ cao nhưng đây chính là chìa khóa
mở ra cánh cửa của nền công nghiệp dược liệu sạch trong tương lai. Phương
pháp nuôi cấy rễ tơ với những ưu điểm vượt bậc hứa hẹn là một hướng đi đầy
triển vọng. Vậy làm thế nào để tăng sinh khối rễ tơ đan sâm trong nuôi cấy intro
để thu được những hợp chất có hoạt tính dược liệu cao ?
Với những lý do trên, chúng em đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biện
pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) phục vụ
ngành công nghiệp dược.”
PHẦN 2. TỔNG QUAN
I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Đan Sâm
Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) là một cây thuốc quý trong y học cổ
truyền. Hơn 80 hợp chất khác nhau đã được xác định trong đan sâm, 50 trong số
đó là chất hòa tan trong nước, 30 chất còn lại là chất tan trong lipit. Các thành
phần tan trong lipit là các hợp chất diterpene thuộc nhóm “tanshinones”, trong
đó hai hợp chất quan trọng là tanshinone IIA và cryptotanshinone. Các thành
phần hòa tan trong nước gồm nhiều axit polyphenolic bao gồm axit salvianolic,
aldehyde và protocatechuic acid, và danshensu (axit salvianic A). Hợp chất
đáng chú ý khác là beta- sitosterol, axit ursolic, baicalin, Vitamin E. Hoạt tính
dược lý của cây đan sâm gồm có: hoạt động chống vi khuẩn hoạt động hỗ trợ,
bảo vệ tim mạch, hoạt tính kháng viêm, cảm ứng quá trình apoptosis và hoạt

và pha lỏng (25 ml) ở trên.
Môi trường nuôi cấy được điểu chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở
nhiệt độ 121
0
C trong 20 phút, 1,1 atm. Điều kiện nuôi cấy in vitro: 14h sáng,
cường độ ánh sáng 2000-2500 lux, nhiệt độ 25 ± 2
0
C
 Phương pháp xác định khối lượng rễ khô
Rễ tơ sau khi thu sinh khối được sấy ở nhiệt độ 45
0
C đến khối lượng
không đổi để xác khối lượng rễ khô (Ge và cs., 2005).
 Phương pháp phân tích hoạt chất mục tiêu
Các hoạt chất mục tiêu (Crytotanshinone, Tanshinone I, Tanshinone IIA)
được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
 Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
Các thí nghiệm nhân được bố trí nhắc lại 3 lần mỗi công thức, mồi lần
10-20 mẫu tùy từng thí nghiệm. Các chỉ tiêu được theo dõi và đo đếm sau 4
tuần.
Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel và IRRISTAT 5.0.
2. Nội dung nghiên cứu
Nôi dụng 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường nuôi cấy
đến sự tăng sinh khối và hàm lượng hoạt chất mục tiêu.
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sinh khối rễ tơ đan
sâm dòng A5.14
CTTN Môi trường nền
CT1 MS
CT2 B5
Thành phần của môi trường MS và B5 theo như bảng sau:

4
170 -
NaH
2
PO
4
- 130,5
Khoáng vi lượng
H
3
PO
3
6,2 3,0
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 0,025
CuSO
4
.5H
2
O 0,025 0,025
Na
2
EDTA 37,3 37,3
FeSO
4
.7H
2

CT1 Đặc
CT2 Bán Lỏng
CT3 Lỏng, tĩnh
CT4 Phân lớp
Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối rễ tơ
và sự tổng hợp hoạt chất mục tiêu
Công thức Elicitor
CT1 Đối chứng (B5)
CT2 B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l Sorbitol
CT3 B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM Salicylic acid
CT4 B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM Methyl Jasmonate
CT5 B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM ABA
Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của dạng bình nuôi cấy đến sự tăng sinh khối rễ tơ
Công thức Dạng bình nuôi cấy
CT1 Bình trụ
CT2 Bình tam giác
CT3 Bình chữ nhật
CT4 Túi nilon
II. KẾT QUẢ
1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sinh khối rễ tơ đan sâm dòng
A5.14
Trong số các dòng rễ tơ đã được cảm ứng thành công, dòng rễ tơ A5.14
có sự tăng sinh khối nhanh, ổn định trong môi trường nuôi cấy không bổ sung
chất điều tiết sinh trưởng nên được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy trên hai môi
trường MS và B5 đặc. Tốc độ tăng trưởng của rễ tơ trên môi trường B5 cao hơn
so với trên môi trường MS (Hình 1A, B). Từ 0,57 gram rễ nuôi cấy trên môi
trường B5, sau 4 tuần, khối lượng rễ tăng 7,67 lần, đạt 4,34 gram khối lượng rễ
tươi và 0,373 gram khối lượng rễ khô. Trong khi đó, khối lượng rễ tăng trên
môi trường MS là 5,96 lần, đạt 3,25 gram khối lượng tươi và 0,297 gram khối
lượng khô từ 0,55 gram rễ ban đầu (Bảng 2).

Khối lượng rễ
ban đầu
(gram)
Khối lượng rễ
tươi sau 4
tuần (gram)
Khối lượng rễ
tăng (lần)
Khối lượng rễ
khô (gram)
Đặc 0,57 4,34 7,67 0,373
Bán lỏng 0,69 2,53 3,67 0,14
Lỏng, tĩnh 0,73 2,25 3,08 0,11
Phân lớp 0,77 2,18 2,83 0,11
Hsia và cs. (2007) khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đặc và lỏng,
lắc 100 vòng/phút đến sự tăng sinh khối rễ tơ đan sâm và nhận thấy rễ tơ nuôi
cấy trên môi trường lỏng, lắc cho khối lượng tươi cao gấp 3 lần và khối lượng
khô cao gấp 6 lần so với rễ tơ nuôi cấy trên môi trường đặc. Tuy nhiên trong
nghiên cứu này, môi trường đặc cho hiệu quả nuôi cấy rễ tơ đan sâm cao hơn so
với ba phương thức nuôi cấy còn lại có thể do nuôi cấy trong môi trường bán
lỏng; lỏng, tĩnh; rễ tơ đan sâm ngập chìm trong môi trường, kết quả tạo ra sự
nghèo thoáng khí, làm mẫu rễ bị chết, hoặc xảy ra hiện tượng trương nước làm
ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của rễ tơ đan sâm. Môi trường đặc là thích
hợp cho nhân nuôi sinh khối rễ tơ trong điều kiện hạn chế về trang thiết bị mà
vẫn đảm bảo sự tăng sinh khối rễ cao.
Hình 1. Rễ tơ đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS đặc (A), B5
đặc (B), B5 bán lỏng (C), B5 lỏng (D), B5 phân lớp (E)
1. Ảnh hưởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối rễ tơ và sự
tổng hợp hoạt chất mục tiêu
Thí nghiệm tiến hành trên các điều kiện tốt nhất thu được từ các thí nghiệm 1

0.62 5.22 8.42 0.36
B5 + 100 mg/l
YE + 0.1 mM
ABA
0.64 5.54 8.66 0.38
Từ bảng kết quả cho thấy rễ trong môi trường có bổ sung elicitor cho sinh
khối lớn hơn so với rễ trong mẫu đối chứng. Tỉ lệ tăng sinh khối rễ tốt nhất thu
được ở công thức có bổ sung YE và ABA.
Bảng 5. Ảnh hưởng của yếu tố elicitor đến sự tích lũy hoạt chất mục tiêu
trong rễ tơ đan sâm
Công thức
Cryptotanshinone
(mg/g)
Tanshinone I
(mg/g)
Tanshinone IIA
(mg/g)
Đối chứng (B5) 0.12596 0.08199 0.11310
B5 + 100 mg/l YE + 50
g/l Sorbitol
0.22694 0.10596 0.14128
B5 + 100 mg/l YE + 0.1
mM Salicylic acid
0.16149 0.09814 0.10849
B5 + 100 mg/l YE + 0.1
mM Methyl Jasmonate
0.54866 0.23020 0.21253
B5 + 100 mg/l YE + 0.1
mM ABA
0.22100 0.09353 0.10303

Bình tam giác 0.83 13.12 15.90 0.757
Bình chữ nhật 1.55 15.05 9.70 0.837
Túi nilon 0.85 12.95 14.7 0.703
AB
C D EBA
Kết quả từ bảng số liệu cho thấy với các loại bình nuôi khác nhau (cùng
thể tích) thì sự phát triển tăng sinh khối rễ tơ là khác nhau. Biểu hiện tốt nhất là
nuôi trong dạng bình tam giác, với thể tích môi trường B5 sử dụng là 100ml sau
10 tuần nuôi cấy khối lượng rễ tươi tăng gần 16 lần so với khối lượng ban đầu.
Sự khác nhau này có thể được giải thích do khả năng thu nhận ánh sáng của rễ
trong bình tam giác là lớn nhất và diện tích bề mặt rễ tiếp xúc với môi trường ở
bình tam giác là thích hợp cho sự phát triển sinh khối của rễ tơ.
Hình 3. Rễ tơ đan sâm sau 10 tuần nuôi cấy trong bình trụ (A), bình tam
giác (B), túi nilon (C) và bình chữ nhật (D)
III. HƯỚNG PHÁT TRIỂN
- Phân tích hoạt chất thứ cấp trong rễ thu được.
- Hoàn thiện quy trình nhân nuôi sinh khối rễ tơ cây đan sâm (Salvia
miltiorrhiza Bunge).
- Phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ rễ tơ cây đan
sâm (Chè nhúng, chè tan, nước tăng lực, viên nén, viên nang…)
PHẦN 4. KẾT LUẬN
I. KẾT LUẬN
- Môi trường thích hợp sử dụng nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro đan sâm
là môi trường B5 bổ sung 3% sucrose.
- Tìm ra được phương thức nuôi cấy phù hợp cho việc nhân nuôi sinh khối
rễ tơ in vitro đan sâm là phương thức nuôi cấy trên môi trường rắn.
- Elicitor phù hợp nhất cho sự tăng sinh khối rễ tơ in vitro đan sâm là dịch
chiết nấm men (YE) bổ sung ABA.
- Elicitor phù hợp nhất cho sự tích lũy hoạt chất là dịch chiết nấm men
(YE) bổ sung Methyl Jasmonate.

3. Kai G., Xu H., Zhou C., Liao P., Xiao J., Luo X., You L., Zhang L.
(2011) Metabolic engineering tanshinone biosynthetic pathway in Salvia
miltiorrhiza hairy root cultures . Metab Eng. 13(3): 139-27
4. Hsia C. N., Lin J. F., Chen U. C., Tsao C. Y., Chan H.S. (2007)
Establishment Hairy Root Culture System of Salvia militorrhiza (P-20)
International Symposium on Ecological and Environmental Biosafety of
Transgenic Plants December 7-8. ARI, Taichung, Taiwan
5. Yan Q., Hu Z., Tan R. X., Wu J. (2005) Efficient production and
recovery of diterpenoid tanshinones in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures
with in situ adsorption, elicitation and semi-continuous operation. J. Biotec.
119: 416-424.