ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

ĐÀO THỊ HỒNG BÍCH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG

THÀNH PHẦN TANSHINON IIA
TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge)
PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG
DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa

: QH.2012.Y

Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Hữu Tùng – giảng
viên bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia
Hà Nội, thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho
em trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa cùng toàn thể các thầy cô
giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung và các thầy cô, cán bộ

DAD

Đầu dò UV (Diode array detector)

4.

EtOAc

Etyl acetat

5.

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance Liquid Chromatography)

6.

Hex

Hexan

7.

IUPAC

Tên hợp chất
(International Union of Pure and Atrie Chemistry)


Độ lệch chuẩn tương đối

15. SKC

Sắc ký cột

16. TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

17. UV-VIS

Phổ hấp thụ phân tử

18. UV

Tia tử ngoại

19. Φ

Đường kính cột

20. 

Hệ số chọn lọc

21.

13


2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc của tanshinon IIA ..................................17
2.2.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất.......................17
2.2.4. Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC ......................................17
2.2.5. Phương pháp phân tích định tính, định lượng mẫu dược liệu đan sâm ...19
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................20
3.1. CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM ..............20
3.1.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu ..............................................................20
3.1.2. Phương pháp phân lập và tinh chế ...........................................................20


3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC TANSHINON IIA ..................................................22
3.2.1. Tính chất vật lý .........................................................................................22
3.2.2. Các phương pháp phổ: phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân .......22
3.2.3. Xác định cấu trúc ......................................................................................24
3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ TINH KHIẾT VÀ PHÂN TÍCH TẠP CHẤT…..………...24
3.3.1. Sắc ký lớp mỏng .......................................................................................24
3.3.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .............................................................25
3.4. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG HPLC..........25
3.4.1. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký .........................................................25
3.4.2. Tính thích hợp của hệ thống .....................................................................26
3.4.3. Độ tuyến tính ............................................................................................27
3.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .......................27
3.4.5. Độ chính xác .............................................................................................28
3.4.6. Độ đặc hiệu ...............................................................................................29
3.5. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƢỢNG DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM……29
3.6. BÀN LUẬN .......................................................................................................30
3.6.1. Về phân lập và xác định cấu trúc của tanshinon IIA ................................30
3.6.2. Về phân tích bằng HPLC..........................................................................30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................32


Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

26

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của tanshinon IIA

27

Bảng 3.6

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của
tanshinon IIA

28

Bảng 3.7

Kết quả phân tích độ lặp lại của phương pháp

28

Bảng 3.8

Kết quả phân tích độ đúng của phương pháp

29


5

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA

7

Hình 1.6 Sắc ký đồ và các thông số đặc trưng

10

Hình 2.1 Một số hình ảnh cây đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai

16

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất và phân lập hợp chất A

21

Hình 3.1 Phổ 13CNMR(CDCl3,100MHz) của chất tanshinon IIA

22,23

Hình 3.2 Cấu trúc tanshinon IIA

24

Hình 3.3 Sắc ký lớp mỏng khảo sát tanshinon IIA tinh chế được

24


định trong Dược điển Trung Quốc. Ở nước ta, tanshinon IIA đã được phân lập [21]
nhưng chưa có nghiên cứu xa hơn để định hướng xây dựng chất chuẩn đối chiếu
cho hợp chất này để phục vụ công tác đánh giá dược liệu đan sâm và các sản phẩm
chứa đan sâm đang ngày càng có nhiều trên thị trường. Theo hướng nghiên cứu này,
chúng tôi thực hiện đề tài ―Nghiên cứu phân lập và định lƣợng thành phần
tanshinon IIA từ cây đan sâm phục vụ công tác kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu
đan sâm” với mục tiêu như sau:
1. Phân lập và xác định hợp chất tanshinon IIA từ đan sâm
2. Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của tanshinon IIA trong
đan sâm và khảo sát tiêu chí làm chất chuẩn đối chiếu.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đan sâm
Cây đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc chi Salvia,
họ Bạc hà (Lamiaceae).

Hình 1.1 Cây đan sâm
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn gọi là huyết sâm, xích sâm,
huyết căn là cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn màu
vàng trắng nhạt. Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu. Thân
vuông trên có các gân dọc. Lá kép, mọc đối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có 7. Lá
chét mọc giữa thường lớn hơn cả. Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa.
Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm. Mép lá chét có răng cưa tù. Mặt trên lá chét
màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng
dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi nhỏ. Cụm hoa mọc
thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm. Hoa mọc vòng, mỗi vòng


19

R = R1 = H, Δ5(10),6(7),15(16)

20

R = R1 = H, Δ5(10),6(7)

22

23 Δ15(16)
24

15(16)

21

R = R1 = OH, Δ

25

R = R1 = H, Δ5(10),6(7)

19-21.Tanshinon I, II, III

24. Isocryptotanshinon

22-23. Isotanshinon I, II


anagadiol, taraxerol acetate, germanicol (hình 4), navidiol,…[ 31].
Ngoài ra còn có Tanin và một số thành phần khác [35].

R R1 R2 R3 R4
1 R=H, R1=R2=Me, R3=H
3 OH OH H Me Me
4
2 R=R1=H, R2=R3=Me
5 OH H H Me Me
1. Acid ursolic 2. Acid oleanolic 3. Anagadiol 4. Taraxerol 5.Germanicol
Hình 1.4. Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L.
1.1.4. Tác dụng sinh học
Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia
miltiorrhiza Bunge. Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:
- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ. Các tác
dụng này do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid
salvinolic B, militron và salvinon. Ngoài ra, đan sâm còn được chứng minh có tác
dụng chống đau thắt ngực [1-2,14,21,25,29].
- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [25].
- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở
tế bào [2,10].
- Tác dụng an thần do thành phần miltiron nên được sử dụng điều trị chứng
mất ngủ [7,10].
- Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn
Staphylococus kháng thuốc. Các thành phần như dihydrotanshinon I,
hydroxytanshinon II-A, cryptotanshinon, methyl tanshinat và tanshinon II-B được
chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn Staphylococus aureus [10,12,21,36].

5


- Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [3].

6


- Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm
vú [1,2].
- Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận
mạn tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [2].
Liều dùng: 8-20g [3].
Chú ý: không dùng chung với Lê lô [6].
1.2. Tổng quan về tanshinon IIA
Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Anh và
Việt Nam, tanshinon IIA là một trong những chất chính được dùng để định tính, có
thể định lượng dược liệu đan sâm và cao đan sâm [7][24][34].
1.2.1. Cấu trúc hóa học

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA
- Tên IUPAC:
1,6,6-trimethyl-8,9-dihydro-7H-naphthol[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dion.
- Công thức phân tử: C19H18O3
- Khối lượng phân tử: 294,3444g/mol
1.2.2. Đặc điểm tanshinon IIA
- Là bột màu đỏ, rất ít tan trong nước (0,0042 mg/l ở 25oC), tan tốt trong các
dung môi hữu cơ nhất là các dung môi kém phân cực trong methanol (5 mg/ml),
ethanol (5mg/ml) ở 25oC, EtOAc và dimethyl sulfoxit (25mg/ml) [27].
- Tanshinon IIA thuộc nhóm diterpenoid có khung terpenoid, ngoài ra trong
phân tử còn có nhóm lacton và xeton. Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy

7

pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích. Dựa
vào hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha tĩnh ta có thể

8


tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích. Các thành phần sau khi được
phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh.
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các
chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm
hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị
densitometer, một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của
chất cần phân tích… Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng
một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích.
- Các đại lượng đặc trưng
+ Hệ số lưu giữ Rf
Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất
phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

R

f

d
d

=

R

hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một
chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay
một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký
lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ.
- Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

Hình 1.6. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng
 Thời gian lưu :
- tR: (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ
thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
- t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
sắc ký
- tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0
- (Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất
nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).
- W : là chiều rộng đáy pic.
- W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.
 Hệ số dung lượng k’:

10


Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:
'
tR tR  t0 tR
k'  
 1
t0
t0
t0





1/2 

N  5,54  Wt R


2

Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính
bằng công thức:

H

L
N

 Hệ số bất đối AF (tailing factor):
Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.

AF 

W1/20
2a

11



b. Ứng dụng của phương pháp HPLC:
 Định tính:
Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng
phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử.
 Xác định tạp chất:
Dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu, trên sắc ký đồ không có pic tại thời
gian lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện.
 Định lượng:
Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích
pic của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng:
- Phương pháp chuẩn ngoại
- Phương pháp chuẩn nội
- Phương pháp thêm chuẩn

12


- Phương pháp chuẩn hoá diện tích
1.3.4. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
a. Nguyên tắc
Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi
từ trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng
hưởng từ hạt nhân.
Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân nguyên
tử có khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và
cho tín hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là
những số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR.
Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật
độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó.
b. Các đại lượng đặc trưng

tương quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tương tác.
 Diện tích dưới tín hiệu

13


Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó. Đường
cong tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton
cho tín hiệu.
c. Ứng dụng của phổ NMR
Bằng cách xác định độ dịch chuyển hoá học , hằng số tương tác J và diện
tích dưới tín hiệu người ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các
loại phổ khác như IR, MS từ đó xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [17,20].
1.3.5. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS)
a. Nguyên tắc
Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) để bắn phá phân
tử hữu cơ ở môi trường chân không cao (10-3 - 10-6 mmHg). Trong quá trình đó,
chất hữu cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành mảnh. Các ion được tạo thành trong
buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến
detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có
cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.
b. Ứng dụng của MS
 Xác định các đồng vị
Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân
chỉ khác nhau về số neutron trong nhân đó nên khối lượng nguyên tử khác nhau. Có
thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố trong mẫu.
 Định tính
Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+,
(M+1)+, (M+2)+, đây là các đặc trưng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên cạnh đó
xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của

(EtOAc), n-Butanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp. Dung môi dùng cho
phân tích: methanol (Merck, Đức), acetonitril (Merck, Đức), nước cất, acid acetic
(Merck).
Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm,
Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50μm, YMC Co. Ltd.,
Nhật Bản).
16


Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha
đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng
đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10 % hơ nóng để phát hiện vết chất.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu
- Năng suất quay cực đo trên máy Jasco DIP-360 digital polarimeter.
- Điểm nóng chảy được đo trên máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản).
- Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT
1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều được đo trên máy JEOL
ECX 400 (Jeol, Nhật Bản) và sử dụng dung môi CDCl3/CD3OD, chất nội chuẩn là
tetramethylsilan (TMS).
- Phân tích HPLC sử dụng hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity
(Agilent Technologies, Mỹ).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ đan sâm
- Mẫu rễ đan sâm được chiết siêu âm bằng dung môi etanol 80%, 3 lần tại
40oC và 4 giờ/lần, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao.
- Hòa tan cao và chiết phân bố lỏng-lỏng, cất loại dung môi ở các phân đoạn,
chạy sắc ký cột, phân lập được chất.
2.2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc của tanshinon IIA

có tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt 2-3.
- Giới hạn phát hiện LOQ = 3,3 x LOD.
e. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt so với giá trị thực
khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ
đúng.
* Độ lặp lại
Tiến hành phân tích 6 mẫu dung dịch tanshinon chuẩn song song, xác định
kết quả định lượng theo đường chuẩn, tiến hành trong cùng điều kiện. Xác định độ
lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng.
*Độ đúng
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho
nồng độ tanshinon IIA vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Tiến hành: Chuẩn bị các dung dịch sau:

18

Trích đoạn Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Về phân lập và xác định cấu trúc của tanshinonIIA

---