ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Lê Thị Thu Trang

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN LIÊN QUAN
ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở LÚA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÃ TUẤN NGHĨA Hà Nội – Năm 2011
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang iii ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

MỤC LỤC
Lời cam đoan i
Mục lục ii


2.1. Vật liệu 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu 38
2.2.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa 38
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa 40
2.2.3. Nhận dạng di truyền các giống/dòng lúa bằng chỉ thị SSR 41
2.2.4. Phân tích số liệu 43
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
44
3.1. Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống/dòng lúa 44
3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong
điều kiện phòng thí nghiệm 44
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống/dòng lúa trong điều
kiện nhà lưới 54
3.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số 60
3.3. Kết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide 61
3.4. Quan hệ di truyền liên quan đến tính chịu mặn của các giống/dòng lúa 73
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
78
TÀI LIỆU THAM KHẢO
80
PHỤ LỤC
93 Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang v ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

Danh mục bảng


Tỷ lệ sống sót của các giống/dòng lúa nghiên cứu trồng trong
đất với EC=6dS/m, EC=12dS/m………………………… …
Kết quả đánh giá cấp điểm chống chịu mặn của các
giống/dòng lúa nghiên cứu (EC = 6dS/m và EC = 12dS/m)…
Tần số alen của 20 locut SSR…………………………………

Đa hình các locut SSR ở các giống lúa nghiên cứu…………
Trang
34
36

40
42
43 47

51

56

58
70
72

Hình 3.11:

Hình 3.12:

Hình ảnh lúa ngập mặn………………………………………
Các cơ chế chịu mặn ưu thế ở lúa……………………………
Nguyên lý phản ứng PCR……………………………………
Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT)
n……………………
Thí nghiệm thanh lọc mặn các giống/dòng lúa nghiên cứu trong
điều kiện phòng thí nghiệm… …………
Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40
giống/dòng lúa nghiên cứu trong dung dịch Yoshida có NaCl
với E=6dS/m và EC=16dS/m……………………………
Thí nghiệm xử lý mặn các giống/dòng lúa trồng trong đất…….
Biểu đồ biểu diễn % tỷ lệ sống sót của các giống/dòng lúa
nghiên cứu trồng trong đất có NaCl với EC=6dS/m,
EC=12dS/m…………………
Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % mức chống chịu mặn của 40
giống/dòng lúa nghiên cứu trồng trong đất có NaCl với
EC=6dS/m và EC=12dS/m…………………………………….
Kết quả tách chiết ADN tổng số lúa……………………………
Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị
SSR- RM339…………………………………………………
Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị
SSR- RM261………………………………………………….
Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị
SSR- RM140…………………………………………………
Kết quả nhận dạng di truyền 40 giống/dòng lúa bằng chỉ thị


62

62

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang vii ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN Hình 3.13:

Hình 3.14:

Hình 3.15:

Hình 3.16:

Hình 3.17:

Hình 3.18:

Hình 3.19:

Hình 3.20:

Hình 3.21:

Hình 3.22:

Hình 3.23:

UPGMA………………………………………………………

63

63

63

64

64

64

65

65

65

66

66
67

68

75
VNTR
Amplification Fragment Length Polymorphism
Amonium persulfate
Arbitrary Primed polymerase Chain Reaction
Cleaved Amplification Polymorphism Sequence
Cộng sự
Conformation Sensitive Gel Electrophoresis
Cetyl trimethylammonium bromide
DNA Amplification Fringerprinting
Deoxyribonucleic acid
Deoxy nucleotide triphosphates
Ethylenediaminetetraacetic acid
Expressed sequence tag
Ethidium bromide
Inter-simple sequence repeat
Molecular Assisted Selection
Polymerase Chain Reaction
Polymorphism Information Content
Random Aplification Polymorhism DNA
Restriction Fragment length Polymorphism
Single Nucleotide Polymorphism
Simple sequence repeat
Sequence-tagged microsatellite site marker
Sequence- tagged site
Tris-Acetic acid- EDTA
N,N,N’,N’- Tetraethyl methylendiamine
Variable Number of Tandem Repeat
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang 1 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN


Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang 2 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

[31]. Tuy nhiên phần lớn các giống lúa có khả năng chịu tốt thì năng suất lại thấp,
tính thích nghi kém. Do đó, hướng lai tạo tập trung vào chuyển gen chống chịu mặn
ở giống lúa chịu mặn tốt và một số giống lúa mang đặc tính ưu việt về năng suất,
chất lượng đang được phát triển. Thông thường phải mất đến 3-4 năm lai tạo để
chuyển gen. Ngoài ra, một khó khăn thường gặp trong lai tạo giống mới là đôi khi
có mối liên hệ khá chặt chẽ giữa tính trạng chống chịu mặn với các tính trạng xấu,
không mong muốn thường được lai chuyển vào các con lai cùng một lúc. Các gen
điều khiển tính trạng mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Do
đó lai tạo tính trạng chống chịu mặn có thể kéo dài đến 10- 15 năm để phát triển
một giống lúa mới [29]. Vì vậy, phương pháp lai tạo truyền thống thường khó, mất
nhiều thời gian và không hiệu quả.
Ngày nay, nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học nên công tác chọn tạo giống đã
trở lên hiệu quả hơn. Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP,
AFLP được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa
dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể giống
khởi đầu, từ đó xác định các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp có thể cho ưu
thế lai cao nhất. Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ
một cách chính xác, không bị tác động bởi điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian
và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa
Việt Nam” với mục tiêu chính là xây dựng cơ sở dữ liệu ADN và tính chịu mặn của
các giống/dòng lúa nghiên cứu nh
ằm góp phần quan trọng cho việc khai thác
nguồn gen chịu mặn và định hướng cho chọn tạo giống lúa chịu mặn ở Vi ệt
Nam.
Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành những nội dung
nghiên cứu sau:

Nguyên nhân phát sinh mặn do nhiều yếu tố, một là mặn ven biển hoặc vùng
cửa sông do nước biển xâm thực vào mùa khô, có thể trồng trọt bình thường trong
mùa mưa; hai là mặn bên trong đất do mao dẫn từ tầng dưới lên có thể do phá rừng,
không có tán che phủ.
Đất mặn là đất có độ dẫn điện (EC) từ 4dS/m trở lên ở 25
o
C, phần trăm
sodium trao đổi ESP kém hơn 15, pH nhỏ hơn 8,5 [5]. Trong đất chứa một lượng
muối hoà tan trong nước ở vùng rễ cây, làm ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng
của cây trồng. Mức độ thiệt hại của đất mặn tuỳ thuộc vào loài cây trồng, giống cây,
thời gian sinh trưởng, các yếu tố môi trường và tính chất của đất.
Đất mặn được phân thành hai loại: (1) đất mặn nhiều; (2) đất mặn ít và trung
bình.
(1) Đất mặn nhiều (Hyper Salic Fluvisols) chiếm 0,03% diện tích đất tự
nhiên. Đất được hình thành do sự bồi tụ của phù sa sông, biển hoặc hỗn hợp sông
biển, nhưng do phân bố ở địa hình thấp, ven đầm phá, chịu trực tiếp của nguồn nước
mặn nên đất bị mặn nhiều (hàm lượng Cl
-
dao động từ 0,05- 0,15%). Đất thường có
màu tím hoặc nâu, hơi xám đen. Thành phần cơ giới rất khác nhau tùy thuộc vào
nguồn gốc đất bị mặn. Nơi đất cát bị mặn thì có thành phần cơ giới nhẹ, nơi đất phù
sa bị mặn thì thành phần cơ giới lại rất nặng. Đất có phản ứng ít chua đến trung
bình, nghèo mùn, đạm tổng số nghèo đến trung bình, nghèo lân tổng số, nồng độ
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang 5 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

Ca
2+
và Mg
2+

2
. Lượng mưa trung bình hàng năm toàn vùng là 1.520-1.800mm, phân
bố không đều theo thời gian và không gian. Mưa lũ tập trung vào tháng 5 đến tháng
10; lượng mưa chiếm khoảng 90% lượng mưa cả năm. Do đó, thuỷ triều có ảnh
hưởng rất lớn đến toàn bộ đồng bằng sông Cửu Long. Nước mặn từ biển tràn vào
sâu trong đất liền vào mùa khô. Các vùng lúa ven biển đồng bằng sông Cửu Long
đều bị nhiễm mặn. Mức độ xâm nhập mặn tuỳ thuộc vào sự xâm nhập mặn của
nước biển và tuỳ vào mùa trong năm, cao điểm vào khoảng tháng 3-4 là các tháng
có lượng mưa ít [1]. Theo Lê Sâm (2003), đồng bằng sông Cửu Long có khoảng
1,8-2,1 triệu ha đất tự nhiên chịu ảnh hượng của mặn tập trung ở các tỉnh Cà Mau,
Bạc Liêu, Kiên Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bến Tre, phần lớn là đất bị nhiễm mặn
kết hợp với phèn, ngập nước.
Bộ Nông nghiệp và PTNT (2001) chia vùng đồng bằng sông Cửu Long ra
làm 6 vùng: vùng ven và giữa sông Tiền và sông Hâu, vùng Đồng Tháp Mười, vùng
Tây sông Hậu, vùng Tứ giác Long Xuyên, vùng Bán đảo Cà Mau, vùng ven biển
Đông. Trong đó các vùng bị ảnh hưởng mặn chính là:
Vùng bán đảo Cà Mau: diện tích tự nhiên là 946.000ha. Diện tích đang sử
dụng 676.000ha, gồm các loại đất: đất mặn và đất phèn chua. Yếu tố chính ảnh
hưởng đến sản xuất của vùng là thiếu nước ngọt và ảnh hưởng mặn
Vùng ven biển Đông: diện tích tự nhiên 1.073.000ha. Diện tích đang sử dụng
844.000ha, gồm các loại đất phù sa, đất mặn và đất cát giồng. Yếu tố chính ảnh
hưởng đến sản xuất của vùng là không ngập lũ, thiếu nước ngọt và ảnh hưởng của
mặn.
1.2.2. Đồng bằng Sông Hồng
Sự nhiễm mặn tại các cửa sông thuộc các tỉnh đồng bằng Sông Hồng lên cao
và xâm nhập vào trong nội địa từ 30-40km làm cho diện tích nhiễm mặn lên tới
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang 7 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

100.000ha ở một số tỉnh: Hải Phòng, Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình, Thanh

Trong điều kiện nhiễm mặn cao cây lúa sẽ chết, tuy nhiên trong môi trường
mặn trung bình đến thấp chỉ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển của
cây. Hầu hết các cây bị mặn làm tổn hại thường có những triệu chứng biểu hiện như
trắng đầu lá sau đó cháy, đẻ nhánh kém, sinh trưởng còi cọc, tỉ lệ hạt lép cao, số
hạt/bông ít, thay đổi thời gian trỗ, rễ sinh trưởng kém, cuốn lá và năng suất thấp.
Bên cạnh đó, cây lúa cũng có thay đổi sinh lý và sinh hoá dưới điều kiện mặn cao
biểu hiện như vận chuyển Na
+
cao đến đỉnh sinh trưởng, tích lũy natri nhiều hơn ở
các lá già, hút Cl
-
, hút K
+
,
P và Zn thấp, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của
đỉnh và rễ thấp…

Hình 1.2: Các cơ chế chịu mặn ưu thế ở lúa
Nghiên cứu sự tác động của yếu tố mặn làm tổn hại đến lúa cho thấy do cây
tích lũy quá nhiều ion Na
+
và Cl
-
; mà ion Na
+
lại có tác động phá vỡ và cản trở vai
trò sinh học của tế bào chất trong cây [85]. Ngược lại những cây được xem là
chịu mặn (kháng mặn) thì nó có khả năng giảm hấp thu Na
+
và gia tăng hấp thu

chuyển thực của những ion ngoài rễ. Giá trị này là số lượng thực của những ion
được di chuyển tới chồi trên đơn vị trọng lượng của rễ trong một đơn vị thời gian.
Bằng chứng là ở giống lúa Pokkali (giống chống chịu mặn), hàm lượng natri ở chồi
trung bình thấp hơn của giống IR29 (giống nhiễm mặn). Bởi vì hàm lượng natri ở
chồi của giống lúa Pokkali được pha loãng do sự sinh trưởng dinh dưỡng nhanh của
nó. Với cơ chế này, cây hấp thu muối nhưng sẽ làm loãng muối nhờ tăng cường tốc
độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lượng nước trong chồi.
Khi cây lúa bị ảnh hưởng của mặn thì diện tích lá sẽ giảm, trọng lượng khô
của chồi và của rễ sẽ giảm tương ứng với độ mặn. Ở giai đoạn mạ, lá già hơn sẽ mất
khả năng sống sót hơn lá non [39]. Khi phân tích trên lá lúa sống trong môi trường
mặn có sự chênh lệch hàm lượng muối từ lá cây này sang lá cây khác, muối luôn
được tích lũy với nồng độ cao trong lá già và hiện tượng chết ở lá già là một cơ chế
loại muối ra khỏi cây. Như vậy, rụng lá là một hiện tượng thông thường ở cây lúa
để chống chịu mặn. Mặt khác, nghiên cứu nồng độ Na
+
trong các lá lúa cho thấy có
sự thay đổi rõ rệt về hàm lượng Na
+
từ những lá non sang những lá già; ion Na
+

tích lũy cao nhất ở những lá già nhất và giảm dần trên những lá non nhất.
Các cơ chế nêu trên cho thấy khi cây lúa bị nhiễm mặn nồng độ Na
+
trong
các mô chức năng bị giảm đi, do đó làm giảm tỷ lệ Na
+
/K
+
trong chồi. Tỷ lệ Na

+
và điểm chống chịu mặn cho thấy nó được
kiểm soát bởi 2 nhóm gen cộng tính và không cộng tính. Tính trạng thể hiện khả
năng hấp thu K
+
được kiểm soát bởi gen đối xứng. Nghiên cứu của Gregorio và
Senadhira (1993) còn cho thấy, tính trạng tỷ lệ Na
+
/K
+
thấp còn thể hiện ảnh
hưởng siêu trội và được điều khiển bởi ít nhất hai nhóm gen trội. Một số nghiên
cứu cho thấy chiều dài bông và khối lượng 1000 hạt ít bị tác động bởi các yếu tố
môi trường; trong khi đó khối lượng bông, số hạt chắc trên bông chịu tác động
lớn bởi tác động của môi trường và 3 tính trạng này đóng góp phần lớn trong
việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn [61].
Qua nhiều nghiên cứu di truyền phân tử tính kháng mặn, bản đồ QTL(
Quantitative Trait Loci)/gen được xây dựng trên cơ sở chỉ thị AFLP và STS cho
thấy, gen chủ lực điều khiển tính trạng chống chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể
số 1. Bên cạnh gen chủ lực Saltol, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang 11 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

hấp thu K cao, 4 QTL có quan hệ với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan
hệ với tính trạng tỷ số Na/K thấp. Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số 1,
3, 4, 10 và 12 [27, 52, 65].
1.4. Công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn
Hiện nay, công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn có thể là hợp lý và ít tốn
kém cho các vùng canh tác nhiễm mặn. Ngoài một số phương pháp truyền thống
(chọn lọc cá thể, đột biến ) với sự pháp triển của khoa học kỹ thuật- nhất là công

Từ năm 2001-2005, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã nghiên
cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn cho các vùng lúa ven biển phía Bắc và đã tạo ra
giống lúa chịu mặn M6 (Bầu Hải Phòng/1548) và một số giống khác như MT6,
MT163, BM9855, BM9820 và BM9830. Các giống này tỏ ra thích ứng trên các
chân đất ven biển và vùng bị nhiễm phèn mặn ở phía Bắc. Ngoài ra Viện Cây
lương thực và Cây thực phẩm cũng đã chọn lựa được 44 giống/dòng lúa chịu
mặn, trong đó 15 giống/dòng lúa có khả năng chịu mặn cao và 10 giống/dòng lúa
có khả năng chịu mặn trung bình đang được sử dụng trong công tác chọn lọc
giống lúa chịu mặn [8]. Bên cạnh đó Viện Di truyền Nông nghiệp đã nghiên cứu
ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng đồng
bằng ven biển Bắc bộ. Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co
60
) đã chọn được
các giống lúa CM1 và CM5 là những giống chịu mặn tốt, cứng cây, kháng bệnh
và cho năng suất cao.
Do đặc điểm di truyền và nông sinh học của cây lúa mà phương pháp lai
tạo truyền thống thường tốn nhiều thời gian và công sức (3-4 năm lai tạo). Đôi
khi trong quá trình lai tạo giống mới có các tính trạng không mong muốn được
lai chuyển vào con lai cùng lúc, các gen điều khiển tính trạng không mong muốn
này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Vì vậy, thời gian để phát triển một
giống lúa chịu mặn mới có thể mất đến hơn 10 năm [29].
1.4.2. Áp dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống lúa chịu mặn
Trong những năm gần đây, công nghệ sinh học được áp dụng mạnh mẽ trong
công tác chọn tạo giống lúa chịu mặn. Nhằm khắc phục những điểm yếu của
phương pháp truyền thống, công nghệ sinh học đã hỗ trợ hoặc thay thế một số công
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang 13 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

đoạn trong quá trình lai tạo giống, phổ biến nhất là hai mảng công nghệ chỉ thị phân
tử và nuôi cấy mô tê bào.

chịu rất tốt hoặc tốt đối với mặn. Tác giả cũng khuyến cáo việc sử dụng hai chỉ thị
RM8094 và RM10745 trong xác định kiểu gen của cây lúa chống chịu mặn có mang
gen Saltol trong các chương trình lai tạo lúa chịu mặn.
Ở Việt Nam, ứng dụng marker phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn
cũng được phát triển. Năm 2000, Vương Đình Tuấn và cs. đã xác định được 3 chỉ
thị RFLP đó là: R1928, R674 và G257 liên kết với các QTL điều khiển tính chịu
mặn trên các nhiễm sắc thể số 1, 6 và 11. Bùi Chí Bửu và cs. (2000) sử dụng 30 chỉ
thị SSR để lập bản đồ gen cho tính chống chịu mặn của quần thể F
3
gồm 257 cá thể
phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28/Đốc Phụng và đã xác định được chỉ thị
RM223 liên kết với gen chịu mặn với khoảng cách là 6.3cM trên nhiễm sắc thể số 8.
RM223 nhân bản đoạn DNA kích thước 120bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ
giống Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160bp từ giống nhiễm IR28. Hai
chỉ thị OSR1 và RM315 liên kết với QTL chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể
số 1 [63].
1.5. Đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học là vấn đề rất được quan tâm hiện nay. Giữ gìn và bảo
tồn đa dạng sinh học là mục tiêu sống còn trong việc duy trì cân bằng sinh thái,
đảm bảo môi sinh của các sinh vật trên trái đất, trong đó có con người. Khái
niệm đa dạng sinh học được hiểu theo nhiều cấp, đó có thể là sự đa dạng của các
quần xã sinh vật trong hệ sinh thái, là sự đa dạng giữa các loài trong quần xã hay
sự đa dạng ở cấp độ di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài. Mặc dù là cấp
độ thấp nhất, nhưng đa dạng di truyền lại có vai trò vô cùng quan trọng trong
tiến hoá và thích nghi của các sinh vật, mọi biến động ở cấp độ đa dạng di truyền
đều có tác động đến những cấp độ cao hơn và cuối cùng là ảnh hưởng đến đa
dạng sinh học [76].
Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở nguồn gen và kiểu gen trong
mỗi loài. Mỗi loài có một bản đồ nhiễm sắc thể và số lượng nhiễm sắc thể khác
nhau, cho nên hiếm có các cá thể của cùng một loài hoặc cùng một giống có trật

đổi của chúng trong quần thể, đặc biệt là tính trạng nông sinh học có lợi cho con
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang 16 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

người. Chỉ thị di truyền cho phép phát hiện sự sai khác về mặt thông tin di truyền
giữa hai hay nhiều cá thể. Sự sai khác này có thể được phát hiện với nhiều phương
pháp tiếp cận khác nhau, thông qua dữ liệu kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành phần
protein và hoạt chất (chỉ thị hoá sinh) hay sự khác biệt (đa hình) trong ADN (chỉ thị
ADN). Mỗi loại chỉ thị đều có những ưu, nhược điểm cũng như khả năng đánh giá
mức độ đa dạng di truyền khác nhau. Trong đó, chỉ thị hình thái được sử dụng sớm
nhất và là cơ sở ban đầu trong đánh giá phân loại sinh vật, còn chỉ thị hoá sinh và
đặc biệt là chỉ thị ADN hiện nay được sử dụng rộng rãi nhất không chỉ đánh giá đa
dạng di truyền mà còn là công cụ hữu hiệu trong chương trình chọn giống.
1.6.1. Chỉ thị hình thái
Chỉ thị hình thái là loại chỉ thị có thể nhìn thấy, đo đếm được và dễ dàng
nhận biết được ở dạng trội lặn. Thông thường, chỉ thị hình thái biểu hiện dưới một
tính trạng được kiểm soát bởi một locut đơn lẻ thường xuyên điều khiển các đặc
điểm hình thái như các gen qui định màu sắc, hình dạng, kích thước, đặc điểm các
bộ phận (hạt, vỏ, …). Với ưu điểm dễ dàng tiếp cận và nghiên cứu, không đòi hỏi
thiết bị đặc biệt cũng như quy trình thực hiện phức tạp, chỉ thị hình thái được áp
dụng khá rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật. Trong đánh giá và
chọn tạo giống truyền thống, chỉ thị hình thái được áp dụng phổ biến và hiệu quả ở
một số loại cây trồng như lúa, đậu tương, ngô, khoai [9, 22, 25, 86].
Mặc dù chỉ thị hình thái thường được sử dụng là một chỉ thị trội hoặc đồng
trội, nhưng trong nhiều trường hợp các đặc điểm hình thái lại chịu ảnh hưởng của
quá trình tương tác gen, nhân tố gen nhẩy, điều kiện ngoại cảnh và chỉ thể hiện ở
những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể. Do đó, kết quả thường có
sự sai lệch giữa các lần đánh giá hoặc trong điều kiện đánh giá khác nhau. Hơn nữa,
số lượng chỉ thị hình thái không nhiều cho mỗi loài sinh vật nên khả năng ứng dụng
của chúng trong nghiên cứu di truyền và chọn giống bị hạn chế rất nhiều. Bên cạnh

trạng. Do đó khả năng ứng dụng của chỉ thị hoá sinh còn hạn chế rất nhiều. Bởi
vậy trong hầu hết những nghiên cứu đa dạng di truyền ngày này, chỉ thị ADN
được sử dụng phổ biến hơn cả.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Di truyền học
Lê Thị Thu Trang 18 ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN

1.6.3. Chỉ thị phân tử ADN
Đầu những năm 80 của thế kỷ 20, kỹ thuật RFLP ra đời và được biết đến
là loại chỉ thị mới- chỉ thị ADN thế hệ đầu tiên - với những ưu điểm vượt trội so
với những chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá sinh đang được sử dụng trong đánh giá
đa dạng di truyền lúc đó. Tuy nhiên mốc đánh dấu quan trọng nhất của công
nghệ chỉ thị phân tử nói riêng và sinh học phân tử nói chung chính là phát minh
phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chains Reaction- PCR) của Karl Mullis
(1983). Với khả năng tạo ra vô số bản sao của một đoạn ADN chỉ từ một vài
phân tử ADN ban đầu, đây là phát minh mang tính bước ngoặt, làm thay đổi
hoàn toàn cách thức tiếp cận - nghiên cứu sinh học phân tử và là cơ sở nền tảng
ra đời cho thế hệ chỉ thị phân tử tiếp theo.
PCR (Polymerase Chains Reaction) là phản ứng nhân gen in-vitro, dựa trên
hoạt tính của loại enzym ADN polymerase chịu nhiệt.
Phản ứng PCR chuẩn có ba giai đoạn nhiệt độ được kiểm soát bởi máy gia
nhiệt. Thành phần phản ứng bao gồm:
1. Đệm phản ứng bao gồm KCl, MgCl
2
và Tris- HCl.
2. Enzym ADN polymerase chịu nhiệt có khả năng gắn nucleotit vào đầu 3’
của đoạn mồi gắn với ADN khuôn sợi đơn.
3. Bốn loại deoxyribonucleotit triphosphate (dNTP) là dATP, dCTP, dGTP và
dTTP.
4. Hai đoạn mồi oligonucleotit được thiết kế bổ sung đặc hiệu với đoạn
ADN cần nhân lên.