iii LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp
đỡ và góp ý kiến tận tình của quý thầy cô trƣờng Đại học Bách khoa Thành phố Hồ
Chí Minh.
Trƣớc hết em xin cảm ơn đến quý thầy cô trƣờng Đại học Bách khoa Thành phố
Hồ Chí Minh đặc biệt các thầy cô thuộc bộ môn Công nghiệ sinh học đã tận tình dạy
bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng và tạo điều kiện tốt nhất cho em
thực hiện và hoàn thành luận văn.
Em xin giửi lời biết ơn sâu sắc đến thạc sĩ Hoàng Mỹ Dung đã dành rất nhiều
thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp HC06BSH đã luôn sát cánh
giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng và quá trình làm luận văn.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình yêu quý luôn bên cạnh, theo sát từng bƣớc đi
trong quá trình học tập và trƣởng thành của em.
Mặc dù em đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và
năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận
đƣợc những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn. iv

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1
1.1. Giới thiệu enzyme cellulase 1
1.1.1. Phân loại và danh pháp quốc tế 1
1.1.2. Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase 3
1.1.3.1. Giới thiệu cellulose cơ chất của cellulase 3
1.1.3.2. Cấu tạo cellulose 4
1.1.3.3. Tính chất chung của cellulose 5
1.1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase 6
1.2. Giới thiệu chung về nấm mốc Trichoderma reesei 7
1.2.1. Vị trí phân loại 7
1.2.2 Nguồn gốc 7
1.2.3. Đặc điểm hình thái 7
1.2.4. Đặc điểm sinh lý 8
1.3. Giới thiệu các phƣơng pháp xử lý đột biến 11
1.3.1. Phƣơng pháp gây đột biến bằng tác nhân hóa học 11
1.3.2. Phƣơng pháp gây đột biến bằng tác nhân vật lý 12
1.3.3. Gây đột biến bằng tác nhân sinh học 12
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Nguyên liệu 15
2.1.1. Giống vi sinh vật 15
2.1.2. Thành phần môi trƣờng 15
2.1.3. Hóa chất sử dụng 15
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị 16
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 16

vi

2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật 16
2.2.1.1. Phƣơng pháp cấy chuyền và giữ giống 16

đột biến trên môi trƣờng bán rắn 33
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40
PHỤ LỤC

viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian của cellulase 2
Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc cellulase 3
Hình 1.3: Cấu tạo phân tử D-glucose 4

Bảng 1.3: Một số chủng đột biến Trichoderma reesei 14
Bảng 2.1: Môi trƣờng sử dụng 15
Bảng 2.2: Dụng cụ và thiết bị 16
Bảng 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV 24
Bảng 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng
microwave………… 26
Bảng 3.3: Kết quả thu sinh khối lên men lần 1 (mg/ml) 28
Bảng 3.4: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến nuôi cấy trên
môi trƣờng lỏng (UI/g) 30
Bảng 3.5: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 4 32
Bảng 3.6: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 9 32
Bảng 3.7: Hoạt tính CMCase (UI/g) của Tc, T3 trên môi trƣờng bán rắn 34

x

MỞ ĐẦU
Trichoderma reesei là loài nấm mốc đã có lịch sử lâu đời trong nền công nghiệp
sản xuất enzyme. Các ứng dụng của enzyme cellulase, xylanlase sản xuất bởi enzyme
này đƣợc tìm thấy trong thực phẩm, thức ăn gia súc, dệt may, dƣợc phẩm và các ngành
công nghiệp giấy và bột giấy. Nấm Trichoderma reesei không gây bệnh cho ngƣời.
Trong những năm gần đây các kỹ thuật di truyền cũng đã đƣợc sử dụng để cải thiện

Cellulose kết tinh
Cellulose vô định
hình
Cắt liên kết giữa các
chuỗi cellulose
Chuỗi đơn
cellulose
Exo-cellulase
(cellobiohydrolase):
E.C.3.2.191: CAS
37329-65-0
Chuỗi đơn cellulose
Cellulose kết tinh
Cắt liên kết nội
chuỗi (1 vị trí cắt sau
2-4 glucose)

Tetrasaccharides,
disaccharides
Cellobiase:
E.C.3.2.1.21: CAS
9001-22-3
Tetrasaccharides,
disaccharides
Cắt liên kết
glycoside giữa 2
glucose
Monosaccharide

Ban đầu enzyme cellulase đƣợc phân chia thành 2 loại dựa trên khả năng phân

3
Trung tâm tạo liên kết với cellulose không phải là đơn vị chức năng đặc trƣng
cho enzyme thủy phân cellulose mà nó còn cấu thành tiểu đơn vị xúc tác cấu trúc
cellulosome.
Trung tâm tạo liên kết với cellulose liên kết thuận nghịch với cellulose nên nó
đƣợc ứng dụng trong công nghệ sản xuất protein [20].

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc cellulase
A. Cellulase ở nấm và một số vi khuẩn chỉ chứa 1 trung tâm tạo liên kết với
cellulose
B. Cellulase ở một số vi khuẩn chứa 2 trung tâm tạo liên kết với cellulose
C. Sơ đồ cấu trúc cellulosome (cấu trúc gồm nhiều enzyme, hoạt động
ngoài tế bào)
Vùng không xúc tác giữ vai trò cầu nối giữa trung tâm tạo liên kết với
cellulose và trung tâm xúc tác. Đây chính là vùng đại diện cho sự tƣơng tác giữa
protein – protein và giữa protein – đƣờng trong quá trình tổng hợp enzyme [6].
1.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase
1.1.3.1. Giới thiệu cellulose cơ chất của cellulase
Cellulose rất phổ biến trong tự nhiên. Hàng năm lƣợng cellulose do thực vật tạo
nên là 10
11
tấn. Nếu nhƣ sự tân tạo ra cellulose là do cây xanh thì sự phân hủy

Chƣơng 1: Tổng quan

4
cellulose lại chủ yếu do vi sinh vật. Do đó mà quá trình phân hủy cellulase bằng
enzyme từ vi sinh vật có một ý nghĩa lớn về lý thuyết cũng nhƣ về thực tế.
Cellulose là polysacharit chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong bông nó
chiếm khoảng 90% còn trong gỗ hơn 50%. Các đơn vị cấu tạo cellobiose gắn với nhau


Hình 1.5: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử cellulose [29]
1.1.3.3. Tính chất chung của cellulose
Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền, không tan trong nƣớc
nhƣng có thể hút nƣớc và trƣơng nở lên. Cellulose có cấu tạo từ các đơn vị C
6
H
10
O
5

nhƣng cấu tạo phức tạp hơn rất nhiều so với tinh bột và cho màu nâu với iod. Trong tế
bào thực vật cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose, pectin, ligin. Điều này ảnh
hƣởng rất lớn đến sự phân hủy cellulose của enzyme. Dạng kết tinh vô định hình dễ bị
phân hủy bởi enzyme vi sinh vật, nhƣng dạng kết tinh thì có cấu trúc rất chặt chẽ nên
khó bị phân hủy. Ở các loại gỗ càng có nhiều vùng kết tinh thì gỗ càng chắc. Muốn
phá hủy hoàn toàn cellulose thì trƣớc tiên phải chuyển chúng sang dạng vô định hình
nhờ các loại enzyme khác có ở vi sinh vật.

Chƣơng 1: Tổng quan

6
1.1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase
Ban đầu endocellulase sẽ cắt liên kết giữa các chuỗi cellulose để hình thành các
monomer. Sau đó exocellulase cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành
cellobiose (tetrasaccharides, disaccharides). Sau cùng cellobiase còn đƣợc gọi là β-
glucosidase, tham gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose.

Hình 1.6: Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase [30]
Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase đối với cơ chất có thể đƣợc cụ thể hóa

cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng
đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng của Trichoderma có tốc độ

Chƣơng 1: Tổng quan

8
phát triển nhanh,
chúng có thể đạt đƣờng kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi
cấy ở 20
0
C.
Khuẩn lạc tăng trƣởng nhanh (5 – 9 cm). Sự hình thành khuẩn lạc kết lại thành
chùm hoặc tỏa rộng ra hơn, màu xanh xám. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc màu
vàng nhạt. Cuống bào tử thƣờng không phân nhánh rộng và thƣờng có sự sắp xếp lỏng
lẻo. Nhánh thƣờng ở dạng đôi, đơn hoặc mọc vòng, thƣờng ngoằn nghèo.
Bào tử hình cầu tới elip, màu hơi xanh tới xanh đậm, kích thƣớc từ (4 – 4,8) x
(3,5 – 4) µm. Sợi nấm màu trắng, khuẩn lạc màu xanh.

Hình 1.8: Trichoderma reesei dƣới kính hiển vi (nguồn bởi G.B.Sharples)
1.2.4. Đặc điểm sinh lý
Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2.5 đến 9.5.
Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ƣu thƣờng là 25 –
30
0
C. Một vài chủng phát triển tốt ở 35
0
C. Một số ít phát triển đƣợc ở 40
0
C. Hình
thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau.


Hình 1.9: Tính đối kháng với nấm bệnh của Trichoderma reesei [ 32]
Tiết kháng sinh: T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự
phát triển của các loài Rhizoctonia solani và Pythium spp. Isonitriles đƣợc sản xuất bởi
T. hamatum, harzianum, viride, koningii, polysporum giúp hạn chế sự phát triển của
nấm bệnh. Ở một vài loài T. atroviride và T. reesei tiết 6-pentyl alpha-pyrone (α –
pyrones) có hƣơng dừa, hoạt động của loại phytotoxin này có thể ngăn cản sự nảy
mầm của những noãn bào tử nấm gây bệnh Phytophthrora cinnamomea và bào tử của
Botrytis cinnerea. Peptaibols do T. polysporum, harzianum, koningii sản xuất giúp

Chƣơng 1: Tổng quan

10
ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời
hoạt động hỗ trợ enzyme phá huỷ thành tế bào ngăn chăn sự phát triển của mầm bệnh
và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. T. virens, koningii, viride sản xuất
sesquiterpenes và polyketides đƣợc T. harzianum sản xuất. Steroids (viridin) là một
độc tố thực vật có hiệu lực nhƣ một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của
bào tử, đƣợc sản xuất bởi T. virens.
Ký sinh: Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hƣớng hóa
chất, nó ký sinh phân nhánh hƣớng về những nấm đã đƣợc định trƣớc (do những nấm
này tiết ra các hóa chất). Ngoài ra, vật kí sinh và vật đối kháng đƣợc Trichoderma
nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự nhiên hay hóa học (qua trung
gian là pectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời,
Trichoderma kí sinh vào và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thông qua hình thành các
dạng móc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease. Những
enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây
thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công trực tiếp của Trichoderma. Không
những thế, Trichoderma còn có khả năng tiết các enzyme phân giải nhƣ chitinase,
glucanase, protease giúp bào mòn thành tế bào sau khi kí sinh và cuộn quanh nấm gây

Các tác nhân làm tăng tần số đột biến cao hơn mức tự nhiên đƣợc gọi là tác
nhân đột biến (mutagen). Các tác nhân vật lý nhƣ phóng xạ, tia X, tia tử ngoại gây đột
biến. Nhiều hóa chất là tác nhân gây đột biến nhƣ các đồng đẳng của các base nitric,
HNO
2
(nitrous acid), các chất alkyl hóa mạch… các đột biến này gọi là đột biến nhân
tạo hay đột biến cảm ứng (induced mutation). Ngoài ra ngày nay kỹ thuật phân tử đang
rất phổ biến để gây đột biến chọn lọc.
1.3.1. Phƣơng pháp gây đột biến bằng tác nhân hóa học
Một số chất hóa học có khả năng gây ra đột biến điểm trong gen. Các chất đó
đƣợc chia làm 4 nhóm sau [1]:
- Nhóm oxy hóa khử: nhóm này bao gồm HNO
2
, H
2
O
2
, aldehide,
hydroxylanime. Cơ chế chuyển hóa của các nhóm này là chúng có khả năng tác động
trực tiếp vào các base và chuyển hóa chúng sang một chất khác.
- Các chất ức chế tổng hợp base nitơ trong cấu trúc DNA nhƣ coffein, ethyl
methane…
- Các chất đồng đẳng với base nitơ nhƣ 5-bromuracil.
- Các chất alkyl hóa làm đứt mạch DNA. Các tác nhân hóa học thƣờng gây ra
những biến đổi sâu sắc trong DNA nhƣng các biến đổi thu đƣợc thƣờng không có định
hƣớng. Chƣơng 1: Tổng quan


của chúng trên DNA nhƣ bảng 1.2

Chƣơng 1: Tổng quan

13
Bảng 1.2: Tác động của việc xử lý đột biến lên sự phát triển của chủng nấm
[22]
Tác nhân đột biến
Đột biến gây ra
Ảnh hƣởng lên DNA
Mức độ
Bức xạ
Bức xạ ion hóa
1. Tia X, γ

Bƣớc sóng ngắn
2. Tia UV

Hóa chất tác động lên
base
3. 5-chlorouracil
5-bromouracil
4. 2-aminopurin
5. NH
2
OH
6. HNO
2

Tác nhân alkylating
Thay thế base, gãy đoạn Phá vỡ cấu trúc, cấu trúc thay
đổi

Bẻ gãy, làm mất, thay đổi cấu
trúc, chyển GC AT AT GC, GC AT
AT GC, GC AT

GC  AT
Điều khiển dịch mã, loại bỏ AT
 CG và /hoặc GC  AT

GC  AT
GC  AT
GC  AT

Biến đổi cấu trúc, mất plasmid Mất đoạn, nhân đôi, sự chèn vào Cao

Chủng gốc – xuất
xứ
Chủng đột biến
Xuất xứ
Tác nhân
QM9414 – MỸ
M-B1
ĐÀI LOAN
UV, microwave
M-B2
M-B3
M-B5
M-B7
VTT-D-78085 –
PHẦN LAN

VTT-D-79124
PHẦN LAN
Either-N-methyl-
N’-nitro-N-
nitrosoguanidine
(NG)
Tia γ
VTT-D-79125
VTT-D-80130
VTT-D-80131
VTT-D-80132
VTT-D-80133
ALK02221 – MỸ
ALK0376

2
Môi trƣờng CMC: thử khả năng phân giải cellulose (MT2)
3

Môi trƣờng dịch khoáng: lên men lỏng, xác định hoạt tính
CMCase (MT3)
4
Môi trƣờng bán rắn (MT4): lên men bán rắn, xác định ảnh
hƣởng của thời gian đến khả năng sản xuất enzyme cellulase
2.1.3. Hóa chất sử dụng
Hóa chất sử dụng phải rõ ràng về nguồn gốc xuất xứ, thành phần, thời hạn sử
dụng.
Hóa chất làm môi trƣờng và hóa chất dùng trong phân tích tham khảo phụ lục 2.

Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu

16
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 2.2: Dụng cụ và thiết bị
1. Erlen 250 mL
12. Cân phân tích 4 số lẻ
2. Erlen 500 mL
13. Cân 2 số lẻ
3. Bercher 50, 100, 250, 500 mL
14. Bể ổn nhiệt
4. Ống hút các loại
15. Máy đo độ ẩm
5. Đũa khuấy
16. Máy đo pH
6. Các chai lọ đựng hóa chất

dịch huyền phù. Sau đó đổ toàn bộ nƣớc chứa bào tử vào trong môi trƣờng nuôi cấy
(hay còn gọi là môi trƣờng nhân giống) và trộn kỹ. Mục đích của việc trộn kỹ là làm
cho các bào tử phân phối đều trong toàn bộ môi trƣờng nuôi cấy.
2.2.1.3. Phƣơng pháp xác định số tế bào vi sinh vật [2]
Xác định số tế bào vi sinh vật bằng phƣơng pháp pha loãng tới hạn. Ở thời điểm
cấy chuyền từ môi trƣờng nhân giống sang môi trƣờng sản xuất, lấy 1ml giống pha với
9 ml nƣớc cất vô trùng nhƣ vậy mẫu đã đƣợc pha loãng 10 lần. Cứ tiếp tục lấy 1 ml
của dung dịch mẹ pha với 9 ml nƣớc cất thì lại đƣợc một dung dịch khác có độ pha
loãng là 10 lần. Tƣơng tự nhƣ thế ta có đƣợc một loạt các dung dịch có độ pha loãng từ
cao cho đến thấp 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
,… Dùng buồng đếm hồng cầu để đếm bào tử
nấm mốc. Số tế bào trong 1 g mẫu nghiên cứu đƣợc tính bằng công thức sau: Trong đó:
a: số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ)
b: số ô nhỏ trong 5 ô lớn (16 x 5 = 80 ô nhỏ)
400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm
0.1: thể tích dịch tế bào (tính bằng mm
3
) chứa trên ô trung tâm
10
3