1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Giống vi khuẩn Haemophilus là một trong những loại vi khuẩn ký sinh
ở đường hô hấp người và một số loài động vật. Loài H. influenzae (Hi) là căn
nguyên của một số bệnh nhiễm trùng ở người (có thể từ viêm đường hô hấp
cho đến viêm màng não). Hi typ b (Hib) đã được thế giới xác định là một
trong những căn nguyên chớnh gõy viờm màng não (VMN) do vi khuẩn, đặc
biệt ở trẻ em dưới 5 tuổi [13], [78].
Tại các nước phát triển như khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, Châu Úc hầu hết
những nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ mang Hib ở họng rất cao ở trẻ nhỏ, đặc
biệt là những trẻ được chăm sóc tại các trung tâm giữ trẻ ban ngày có thể
mang Hib đến 15% [41], [58]. Bên cạnh đó, Hib cũng được đánh giá là
nguyên nhân hàng đầu gõy cỏc bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ như
viêm màng não (VMN), viêm phổi để lại di chứng và tỷ lệ tử vong cao
(khoảng 10%). Gánh nặng bệnh tật do Hib đã giảm đáng kể nhờ có vacxin
phòng bệnh tại các nước này [78]. Tuy nhiên, một số nước trên thế giới sau
khi đánh giá quá trình thực hiện phòng bệnh do Hib bằng vacxin đã cho thấy
tỷ lệ thất bại của vacxin cũng không nhỏ. Xuất phát từ vấn đề này, đã có
nhiều nghiên cứu về đặc điểm học phân tử (phổ biến nhất là sử dụng kỹ thuật
PFGE) của Hib được tiến hành để đỏnh giá dịch tễ học phân tử của vi khuẩn
này [71], [90], [95], [101], [102].
Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang
vi khuẩn Hi nói chung [1], tỷ lệ mắc VMN do Hi (chưa có điều kiện xác định
typ huyết thanh) ở trẻ dưới 5 tuổi [6]. Cho thấy tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi mang Hi
chiếm 21,4-35,5% [4] và Hi là căn nguyên hàng đầu gây VMN (50-60% các
trường hợp VMN xác định được vi khuẩn) ở trẻ nhỏ [6]. Từ năm 1999 đến
2004, một số nghiên cứu của Phan Lê Thanh Hương cùng cộng sự đã đưa ra
tỷ lệ VMN do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà Nội và một số tỉnh phớa Bắc [6],
2
[87], cũng như tìm hiểu về sự phân bố theo biotype, genotype (phân loại bằng
PFGE) và gen mã hóa tổng hợp enzym β−lactamase của Hib phân lập từ trẻ
cũng gây bệnh. Đến năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của
bệnh cúm, vai trò của Hi mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm,
còn Hi chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào đường hô
hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm [11], [32], [78]. Vì vậy, vi khuẩn
này có tên Haemophilus influenzae được xuất phát từ nhu cầu đòi hỏi môi
trường giàu chất dinh dưỡng, bao gồm các yếu tố phát triển có mặt ở máu
(Haemophilus: ưa mỏu), đặc biệt là yếu tố X (hemin) và yếu tố V (NAD hoặc
NADP). Thêm vào đó, vi khuẩn này lại có mối liên quan lịch sử với bệnh cúm
(influenzae: bệnh cúm). Cho nên, vi khuẩn được gọi tên là như vậy [11], [78].
1.1.2. Đặc điểm sinh học đặc trưng của Hib
1.1.2.1. Hình thể và cấu trúc [11], [78]
Hi là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực
khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5µm) nhưng uốn cong
ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy nhiên khi chúng ở dịch não tuỷ, hình thể
của Hi có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.1).
Hi bắt màu Gram õm, khụng di động và không hình thành nha bào. Thành tế
4
bào của vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide–protein tương tự
như thành của những vi khuẩn Gram õm khỏc. Tuy nhiên, Hi được phân loại
thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable khụng xác định
được typ huyết thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh).
Loài Hi (Hi) có vỏ bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh
(serotype) từ a đến f tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ
polysaccharide do gen qui định [11], [32], [78]. Vỏ bọc typ b là một dạng
trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol -
phosphate (PRP). Những polysaccharide bề mặt này có liên quan mạnh mẽ
đến tớnh gõy độc của vi khuẩn, đặc biệt là Hi typ b (Hib), nguyên nhân của
nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả VMN
(chiếm trên 90% các ca nhiễm khuẩn lan tràn do Hib).
Hình 1.1 Hình thể của Hi trên tiêu bản nhuộm gram dịch não tuỷ dưới
và cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử. Máu và các sản phẩm của
máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng để sản
xuất yếu tố X. Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố X mà
Hi cần thiết phát triển. Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ cần thiết là 0,1
– 1,0 µg/ml. Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong máu, nhưng
một phần chúng nằm bên trong tế bào. Mặt khác, trong máu của nhiều loài
động vật có enzym NADase, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do.
Thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế bào và enzym NADase bị
nhiệt phá huỷ. Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 µg/ml.
6
Hi hiếu khí, đòi hỏi môi trường nuôi cấy có CO
2
(2-5%) khi mới phân
lập. Mọc tốt trờn mụi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23-
39
0
C, tối ưu là 37
0
C. Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu mọc trờn cỏc
loại thạch mỏu khỏc (ví dụ máu thỏ) thỡ khụng gõy tan máu và khuẩn lạc nhỏ
hơn nhiều so với trên chocolate trong cựng cỏc điều kiện nuôi cấy. Cũng trên
thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc Hi mọc xung quanh các khuẩn lạc
Staphylococcus aureus bội nhiễm rất to, trong khi đó ở những vùng xa thì
khuẩn lạc hoặc là không mọc, hoặc là rất bé. Hiện tượng này gọi là hiện tượng
“vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đó
giúp Hi phát triển được thạch mỏu thụng thường.
Hình 1.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc của vi khuẩn Hi mọc xung
quanh khuẩn lạc của S. aureus trên môi trường thạch mỏu thỏ
Môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc:
Để nuôi cấy Hi, có 3 loại môi trường có thể được được sử dụng [11],
bắt màu Gram thay đổi.
Trờn môi trường lỏng, Hi thường phát triển làm đục môi trường. Tình
trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trờn mụi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác
định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18 giờ).
8
Haemophilus influenzae được phân biệt với những loại Heamophilus
khác ở các đặc điểm sau đây:
Tính chất
Loài
Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO
2
Hi - + + +
H. parainfluenzae - - + -
H. hemolyticus + + + -
H. parahemolyticus + - + ±
H. aphrophilus - + - +
H. paraphrophilus - - + +
Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học đặc trưng để phân biệt Hi với các
Haemophilus khác.
Tính chất sinh hóa đặc trưng của Hi :
Tớnh chất sinh hóa đặc trưng của Hi là nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu
tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy. Tớnh chất này có thể được
xác định bằng một trong các thử nghiệm sau [11], [32], [78], [117]:
Hình 1.4: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV, cho thấy vi
khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển.
1.1.3. Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh (serotype) và biotype của
Haemophilus influenzae
9
1.1.3.1. Đặc điểm phân loại Hi theo serotype (typ huyết thanh) [11], [32], [78]
Năm 1930, Hi được xác định thành 2 nhúm chớnh, đó là loài không vỏ
Kháng nguyên thân (LPS và protein màng ngoài)
Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate)
Kháng thể (Kháng nguyên vỏ)
Đại thực bào
Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa bởi kháng
thể đặc hiệu của kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [78].
10
Miễn dịch tự nhiên đối với Hib rất đa dạng, bao gồm một sự hợp nhất
phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố miễn
dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa và quá trình hoạt
hóa các phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả năng thực bào, diệt vi
khuẩn bởi những đại thực bào và tế bào đa nhân, 5) Chức năng miễn dịch qua
trung gian tế bào lympho T. Trong đó khó có thể đánh giá rạch ròi cơ chế
miễn dịch nào là quan trong nhất trong những cơ chế bảo vệ cơ thể vật chủ.
Tuy nhiên, hầu hết các cá thể có được khả năng miễn dịch bảo vệ trong những
năm đầu của cuộc đời mà không mắc bệnh nhiễm khuẩn Hib lan tràn. Khả
năng miễn dịch thu được một cách tự nhiên này, đó là kết quả của đáp ứng
với sự xâm nhiễm họng - mũi của Hib cũng như sự xâm nhiễm không triệu
chứng ở ruột của hệ vi khuẩn đường ruột bình thường, dẫn đến có phản ứng
chéo với kháng nguyên Hib. Mối liên quan tỷ lệ nghịch giữa nguy cơ mắc
11
bệnh nhiễm khuẩn do Hib đặc thù đối với tuổi và nồng độ kháng thể tự nhiên
kháng Hib có được trong những năm tháng đầu của cuộc đời. Đặc điểm này
cũng đã nêu lên được tầm quan trọng của kháng thể trong việc bảo vệ cơ thể
khỏi bệnh nhiễm khuẩn lan tràn do Hib. Hiện tượng trên được mô tả đầu tiên
bởi Fothergill và Wright năm 1933 [36], người ta biết trẻ sơ sinh đã có được
kháng thể diệt khuẩn Immunoglobulin G (IgG) từ mẹ, kháng thể này yếu dần
đi trong những tháng tuổi đầu tiên, đồng thời với nguy cơ nhạy cảm theo tuổi
giữa tháng tuổi thứ 6 cho đến 2-4 tuổi nên để bảo vệ cơ thể cần phải thông
qua việc gây miễn dịch chủ động.
1.1.5. Khả năng gõy bệnh VMN của vi khuẩn Hib
1.1.5.1. Đặc điểm sinh bệnh học [13]
Hib lây truyền qua tiếp xúc hoặc hít phải các chất bài tiết bị nhiễm
khuẩn của đường hô hấp. Sau khi định cư ở vùng mũi họng, vi khuẩn có thể
gõy nhiễm khuẩn đường hô hấp, lan ra tổ chức lân cận hoặc xâm nhập vào
dòng máu. Người ta cho rằng vi khuẩn từ mũi họng vào dòng máu do kết quả
của sự vận chuyển trong những tế bào thực bào từ niêm mạc vào các mạch
bạch huyết. Trong máu, những vi khuẩn Hib có vỏ PRP kháng lại được hiện
tượng đại thực bào và hoạt tính bổ thể. Ở trạng thái nhiễm khuẩn huyết, Hib
có thể lan tràn và vượt qua hàng rào mỏu – não. Vị trí Hib từ máu vào dịch
não tủy là đám rối màng mạch, nơi có sự phân bố mạch cao. VMN xảy ra
thường có tương quan trực tiếp tới thời gian và tính chất nghiêm trọng của
nhiễm trùng huyết (> 10
3
đơn vị tạo khuẩn lạc: CFU – Colony Formed Unit).
1.1.5.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh VMN [13]
Trên lâm sàng, VMN do Hi typ b có thể tiến triển âm ỉ trên vài ngày,
thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp trên hoặc đột ngột tiến triển
13
trong vài giờ. Những dấu hiệu và triệu chứng của VMN do vi khuẩn này cũng
giống hệt như triệu chứng và dấu hiệu gặp trong VMN do các vi khuẩn gây
bệnh khác.
Những dấu hiệu không đặc hiệu, bao gồm: sốt, ngủ gà, kích thích, chán
ăn, nôn, suy hô hấp và rối loạn tõm thần. Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu,
cứng gáy, sợ ánh sáng. Các dấu hiệu Brudzinski, Kernig và cứng gáy đặc
trưng ít thấy ở trẻ dưới 15 tháng tuổi. Thêm vào đó, những dấu hiệu khu trú
có thể xuất hiện sớm, có đến 1/3 số bệnh nhõn bị co giật trước khi nhập viện.
Tỷ lệ tử vong bởi VMN do Hi typ b khoảng 5% và tỷ lệ mắc bệnh kéo
dài là 15 – 30%.
1.1.6. Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm VMN do vi khuẩn Hib
o
C. T-I là môi trường hai
pha, rất thuận tiện cho nuôi cấy nguyên thủy N. meningitidis và các loại vi
khuẩn gây bệnh khỏc cú trong bệnh phẩm DNT hay bệnh phẩm máu.
- Nhuộm gram bệnh phẩm DNT:
Đõy là một phương pháp chẩn đoán sơ bộ Hib cũng như các vi khuẩn
khỏc gõy VMN. Có thể thực hiện bởi kỹ thuật nhuộm gram từ cặn dịch não
tủy hoặc bằng cách phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT bởi
kỹ thuật ngưng kết hạt latex (sẽ đề cập ở phần 1.1.6.2). Kết quả dương tính
của một trong hai kỹ thuật này đều cho thấy bằng chứng nhiễm trùng, thậm
chí nuôi cấy có thể thất bại.
+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt.
+ Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một
ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đậy.
+ Tiến hành nhuộm gram một tiêu bản từ cặn bệnh phẩm DNT vừa ly
tâm. Để khô tiêu bản.
15
+ Soi tiêu bản ở vật kớnh ì 100 để tìm vi khuẩn gây bệnh. Nếu trên tiêu
bản xuất hiện các trực khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái (có thể ở dạng cầu
trực khuẩn, trực khuẩn hoặc mảnh dài như sợi chỉ) thì đõy là dấu hiệu gợi ý
quan trọng định hướng chẩn đoán VMN do Hib.
- Nuôi cấy:
+ Lấy đầy một ăng cặn bệnh phẩm nuôi cấy vào mụt trường thạch
chocolate có bổ sung IsoVitalex.
+ Ủ ở 37
o
C với khí trường 5 - 10% CO
2
khoảng 18-24 giờ. Nếu có
khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch chocolate sau khi ủ, quan sát hình thái khuẩn lạc
+ Chọn một cánh tay và buộc dây garo phía trên vị trí cần lấy máu để
ngăn dòng chảy của máu tĩnh mạch. Tĩnh mạch lớn ở cẳng tay là loại tĩnh
mạch nổi thường được lựa chọn.
+ Rửa sạch vùng da định lấy máu bằng cồn 70
o
và sau đó sát khuẩn
bằng cồn iod hoặc povidone-iodine. Để khô. Nếu cần phải bắt tĩnh mạch lại
thì phải sát trùng nơi lấy bệnh phẩm một lần nữa.
+ Sau khi sát trùng da và để khô, chọc kim vào trong tĩnh mạch với mặt
nghiêng của mũi kim ngửa lên trên. Khi kim đã vào tĩnh mạch, hút máu bằng
cỏch rút từ từ pittong, đều đặn. Sau khi hút đủ lượng máu cần thiết (1-2 ml để
cấy vào 20ml môi trường canh thang dinh dưỡng), tháo bỏ dây garo và đặt
một viờn bụng trũn vô khuẩn đã tẩm cồn lên phía trên mũi kim.
(Chú ý: không để cho không khí lọt vào trong tĩnh mạch)
+ Rút bơm kim tiêm ra và đặt cố định viờn bụng trũn chắc ở vị trí lấy
máu cho đến khi không còn chảy máu.
+ Bơm máu vào môi trường dùng để cấy máu theo nguyên tắc vô trùng
(thông thường nên sử dụng chai cấy máu có môi trường pha chế sẵn của Hãng
Becton – Dickinson) [8].
17
+ Đặt một băng nhỏ lên vết thương. Ngay lập tức vận chuyển bình cấy
máu về phòng xét nghiệm vi sinh. Bình cấy máu có thể được giữ ở nhiệt độ
phòng (20
o
– 25
o
C) khoảng 4-6 giờ trước khi ủ ấm ở 35
o
– 37
o
1.1.6.2. Phương pháp phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong DNT
bằng phương pháp ngưng kết hạt latex [8], [32]
Nguyên lý: Phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccharide của Hib trong
dịch não tủy bằng kháng thể (đơn giá) kháng vỏ đặc hiệu với Hib được gắn
lên bề mặt gắn hạt latex. Kết quả phản ứng dương tính khi hỗn dịch làm phản
ứng trên lam kính hoặc phiến giấy xuất hiện các hạt ngưng kết; phản ứng âm
tính khi không có hiện tượng ngưng kết xảy ra.
18
Thực hiện kỹ thuật:
- Dụng cụ, hóa chất: Pasteurex Meningitis Hib (KHT đa giá); Bio
Merieux Slidex meningite KIT (HT đa giá)
- Tiến hành kỹ thuật:
+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt.
+ Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một
ống nghiệm sạch vô trùng có nắp đậy.
+ Đun nước nổi DNT trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 100
o
C/5 phút.
+ Lắc lọ kháng thể mẫu có gắn hạt latex cho đến khi có dung dịch
thuần nhất.
+ Nhỏ một giọt của mỗi loại kháng thể mẫu gắn hạt latex lên lam kính
ở giữa vòng tròn đã được khoanh bằng bút viết kính hoặc phiến giấy dùng
một lần để thực hiện các phản ứng ngưng kết.
+ Nhỏ 30 – 50 àl dịch não tủy vào từng loại kháng thể mẫu đã được
nhỏ lên lam kính hoặc phiến giấy.
+ Xoay tròn lam kính hoặc phiến giấy làm phản ứng 2 – 10 phút (hoặc
dựng mỏy lắc tròn với tần số 100 vũng/ phỳt)
- Đọc kết quả: phản ứng âm tính khi huyền dịch làm phản ứng vẫn đục
và có màu sữa nhạt; phản ứng dương tính khi xuất hiện các hạt ngưng kết xảy
ra trong vòng 2 phút sau khi thực hiện phản ứng và huyền dịch trở nên trong.
+ Đọc kết quả sau 1-3 giờ dừng chạy điện di, nếu dương tính sẽ thấy
vạch tủa trắng gần phía giếng kháng thể (cực dương).
1.1.6.4. Phương pháp phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của Hib trong DNT bằng
kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
20
PCR được biết là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả nhanh, nhạy và đặc
hiệu với Hib ở DNT. Hơn thế nữa, kỹ thuật này cũng góp phần nâng cao tối
đa khả năng quản lý các trường hợp viêm màng não nhằm giảm tỷ lệ trầm
trọng, tỷ lệ chết và những phức tạp trong điều trị các bệnh nhiễm trùng xâm
hại do Hib. Tại những cơ sở xét nghiệm lâm sàng, kỹ thuật PCR truyền thống
thường được dùng nhất trong chẩn đoán Hib. Tuy nhiên, hiện nay kỹ thuật
Realtime-PCR cũng đã được sử dụng trong phân loại và xác định Hi nói
chung và Hib nói riêng với độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao [8], [60], [63], [79].
Kỹ thuật PCR truyền thống [79]
- Hóa chất và sinh phẩm:
+ Enzym Taq ADN Polymerase 2.5U.
+ dNTPs gồm : ATP, TTP, GTP, CTP.
+ Cặp mồi (primer) được sử dụng để xác định Hib là Haem Right:
/ Primer 1: 5’ CAGTAAATACACCTGTTGCCCCTG 3’.
/ Primer 2: 5’ GCCATTCATCAAATA 3’.
Cặp mồi này tương tự và bổ sung với trình tự acid nucleic của vùng bảo
tồn gen “hpD” đặc hiệu cho typ huyết thanh b của Hi. Cả hai mồi bao gồm
khoảng 24 cặp base (base pair).
+ Thang ADN mẫu dùng trong diện di gen
+ Đệm, nước khử ion và MgCl
2
25mM.
- Các bước chẩn đoán PCR:
+ Tách chiết ADN của Hib trong dịch não tủy:
/ Bằng kỹ thuật vô trùng lấy 100àl DNT cho vào một ống ly tõm sạch,
o
C. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu ADN sau khi khuếch đại có thể
được giữ ở 4
o
C cho đến khi phân tích. Sản phẩm của phản ứng PCR để chẩn
đoán Hib được phát hiện bởi kết quả điện di trên thạch agarose.
Kỹ thuật Real-time PCR [8], [63]
- Hóa chất và sinh phẩm:
+ QIAamp blood kit (Qiagen, Hilden, Germany)
+ Mồi (primer):
/ Mồi xuôi: 5’-CAAGATACCTTTGGTCGTCTGCTA-3’ (vị trí 5481
đến 5504)
/ Mồi ngược: 5’-TAGGCTCGAAGAATGAGAAGTTTTG-3’ (vị trí
5631 đến 5607)
+ Probe đặc hiệu: 5’-ATGATATGGGTACATCTGTT -3’ (vị trí 5563 đến
5582)
- Các bước chẩn đoán RT-PCR [63]:
22
+ Tách chiết ADN của Hib từ dịch não tủy dựa vào QIAamp blood kit
(Qiagen, Hilden, Germany) theo quy trình của nhà sản xuất.
+ Tiến hành kỹ thuật:
Phản ứng khuếch đại được thực hiện với hỗn hợp phàn ứng có thể tích
tổng là 25àL, chứa 2ìTaqMan universal master mix (Perkin-Elmer-
Biosystems), mỗi primer với nồng độ 400nM, 200nM probe, và 1àl ADN tách
chiết.
Quá trình khuếch đại PCR có thể được thực hiện trên nhiều mẫu giống
nhau dựa trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM 7700. Các thông số
chuẩn cho quá trình khuếch đại: 2 phút ở 50
o
C, và 10 phút ở 95
1.2.1.1. Khái niệm về người khỏe mạnh mang vi khuẩn (Hib)
Người khỏe mạnh mang vi khuẩn (carriers) là những người mang vi
khuẩn gây bệnh trong cơ thể mà không có biểu hiện triệu chứng hoặc không
phát hiện thấy dấu hiệu đáp ứng miễn dịch của cơ thể [17].
Trạng thái mang vi khuẩn của cơ thể có thể tồn tại với thời gian ngắn
hoặc dài, có thể gián đoạn hoặc liên tục. Những người mang vi khuẩn thường
có khả năng lây truyền cho người khác. Vì vậy, người lành mang Hib đồng
nghĩa với vi khuẩn này định cư trên cơ thể và xác định được sự xuất hiện của
vi khuẩn Hib sống ở màng nhày họng (pharyngeal mucosa). Tuy nhiên, kết
quả xác định này cũn phụ thuộc vào độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp
xét nghiệm tìm vi khuẩn Hib còn sống ký sinh ở màng nhày họng người khỏe
mạnh [17].
1.2.1.2. Phương pháp xác định
Trong hầu hết các nghiên cứu điều tra về người khỏe mạnh mang Hib,
khó khăn xảy ra trong việc phân lập vi khuẩn này có thể dẫn đến kết quả tỷ lệ
mang Hib thu được thường thấp hơn so với thực tế. Qua một số nghiên cứu,
cho thấy phương pháp sử dụng tăm bông lấy bệnh phẩm từ họng miệng
(oropharyngeal swabs) dùng để nuôi cấy xác định người lành mang Hib
thường có kết quả tương tự hoặc cao hơn so với nuôi cấy từ tăm bông lấy
bệnh phẩm ở họng mũi (nasopharyngeal swabs) [66].
24
Trạng thái người khỏe mạnh mang Hib thường được xác định bằng các
kỹ thuật nuôi cấy. Vì vậy, tất cả các bước thực hiện trong kỹ thuật xét nghiệm
dùng cho nghiên cứu điều tra vi sinh này cần phải đạt được độ chuẩn xác tối
đa. Những sai số có khả năng xảy ra trong quá trình xác định tỷ lệ Hib ký sinh
ở họng người khỏe mạnh, bao gồm: kỹ thuật ngoáy họng lấy bệnh phẩm (đây
là kỹ thuật khó duy trì ổn định), sự sống sót của vi khuẩn trong quá trình vận
chuyển bệnh phẩm cho đến khi nuôi cấy vào môi trường; và sự xuất hiện
nhiều vi khuẩn khác nhau có trong bệnh phẩm nhưng lại có sự tương đồng về
hình thái khuẩn lạc, nên có thể dẫn đến chọn khuẩn lạc nhầm. Sự khác biệt
và 31,6% (trẻ 49 - dưới 60 tháng) [4]. Tuy nhiên, hiện nay có rất ít nghiên cứu
đánh giá, xác định tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn Hib.
+ Trên thế giới, hầu hết các nghiên cứu về trẻ khỏe mạnh mang Hi đều
được định typ huyết thanh. Nghiên cứu của Staphanie H. Factor và cộng sự về
tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi có mang Hib tại Châu Á, cho thấy tỷ lệ chung là 6%.
Trong đó: 3% (trẻ 2 – 5 tháng); 10% (trẻ 6 - 11 tháng); 5% (trẻ 12 - 23
tháng); 8% (trẻ 24 - 35 tháng); 4% (trẻ 36 - 47 tháng) và 5% (trẻ 48 - 59
tháng) [94]. Nghiờn cứu khác của Gúmez Elizabeth và cộng sự về dịch tễ học
trẻ khỏe mạnh mang Hib tại Santo Domingo, nước cộng hòa Dominic cho
thấy tỷ lệ trẻ mang Hib: 1,5% (trẻ dưới 5 tháng); cao nhất 12,5% (trẻ 6 - 11
tháng); 6% (trẻ 12 - 23 tháng); 7,9% (trẻ 24 - 35 tháng); 9,8% (trẻ 36 - 47
tháng) [41]. Tại Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu của Muge Oguzkaya–Artan và cộng
sự cho thấy tỷ lệ trẻ nhỏ ở lứa tuổi 5 - 7 mang Hib với tỷ lệ là 4,2% [76]. Bên
cạnh đó, nghiên cứu của Lucia Ferro Bricks tại Sao Paulo Brasil với 1200 trẻ
nhỏ dưới 6 tuổi được chăm sóc tại 29 Nhà trẻ Taubatộ (trong đó, 213 trẻ
Copyright: Tài liệu đại học ©