ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ NGỌC TUYẾT
NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
QUẦN THỂ THÔNG ĐỎ (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.)
TẠI LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT
SINH HỌC PHÂN TỬ
Chuyên ngành: Di Truyền Học
Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. TRẦN THU HOA
TP. HỒ CHÍ MINH – 2009
1.1.1.1 Đặc điểm hình thái 3
1.1.1.2 Đặc điểm tái sinh 3
1.1.1.3 Điều kiện sinh thái 4
1.1.2 Phân bố 4
1.1.3 Hệ thống phân loại 5
1.1.4 Giá trị sử dụng 6
1.1.5 Vấn đề bảo tồn và nhân giống thông đỏ tại Việt Nam 7
1.2 DNA lục lạp (cpDNA) ở thực vật 9
1.2.1 Bộ gen lục lạp 9
1.2.2 Vùng giữa hai gen trnL-trnF trong nghiên cứu di truyền quần thể 10
1.3 Sự đa dạng di truyền 10
1.3.1 Biến dị di truyền và cấu trúc di truyền 11
1.3.2 Dòng chảy của gen 12
1.3.3 Đặc điểm của các loài cây rừng 12
1.3.4 Ý nghĩa của sự đa dạng di truyền 13
1.4 Marker phân tử trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 14
1.4.1 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) marker 15
1.4.2 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) marker 16
1.4.3 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) marker 17
1.4.4 SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeat) marker 17
2. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1 Vật liệu, hóa chất & trang thiết bị 19
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19
2.1.2 Dụng cụ & thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu: 19
-ii-
2.1.2.1 Dụng cụ 19
2.1.2.2 Thiết bị 19
2.2 Phương pháp 21
2.2.1 Chiết tách và tinh sạch DNA 21
2.2.2 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bằng phương pháp RAPD (Random
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
bp Base pair
cpDNA Chloroplast DNA
CTAB Cetyltrimethylamonium bromide
DNA Deoxyribonucleic acide
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
EtOH Ethanol
H
2
O Dihydrogen monoxide (nước)
ORF Open Reading Frame
PCR Polymerase Chain Reaction
PVP Polyvinylpyrolidol
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
RAPD Randomly amplified polymorphic DNA
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
T. chinensis Taxus chinensis
T. fuana Taxus fuana
T. wallichiana Taxus wallichiana
Tag Thermus aquaticus
TE Tris- HCl + EDTA
U Unit
UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic mean
-iv-
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Danh sách các mẫu vật liệu 20
Hình 3.7: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPX-14 34
Hình 3.8: Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPX-15 34
Hình 3.9: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan về di truyền giữa 50 mẫu thông
đỏ trên cơ sở kiểu gen 38
Hình 3.10: Sản phẩm khuyếch đại vùng trnL-trnF trên cpDNA thông đỏ 41
Hình 3.11: Sản phẩm cắt với enzyme cắt giới hạn ApoI (A) và XbaI (B) 41
Hình 3.12: Sự sắp xếp chuỗi nucleotide vùng trình tự trnL-trnF 44 -1-
Đặt vấn đề
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.), tên tiếng anh là Himalayan Yew, là cây thân
gỗ có giá trị kinh tế cao, hiện đang được công nghệ dược phẩm rất quan tâm vì đây
là nguồn thiên nhiên cung cấp các hợp chất taxane, sử dụng trong hóa trị ung thư
như: ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư đầu và cổ, và một số
dạng di căn của ung thư da [37].
Do có giá trị kinh tế cao, thông đỏ đang bị lạm dụng khai thác ở hầu hết các nơi trên
thế giới. Thêm vào đó, thông đỏ là loài có khả năng tái sinh tự nhiên rất thấp, nên
nguồn nguyên liệu thiên nhiên này ngày càng trở nên quý hiếm. Ở Việt Nam, thông
đỏ được xem là loài có khả năng tuyệt chủng và được ghi vào sách đỏ với 2 loài:
thông đỏ bắc – Taxus chinensis Z (Pilg.) Rehd., và thông đỏ nam – Taxus
wallichiana Zucc. Cả hai loài đều có số lượng rất ít, chỉ khoảng vài trăm cá thể mỗi
loài. Lâm Đồng là tỉnh có các quần thể thông đỏ nam được biết đến nhiều nhất ở
nước ta với các quần thể tại Xuân Trường, Bidoup, Hồ Tiên, Núi Voi
Với số lượng quần thể ít, số cá thể trong mỗi quần thể cũng không cao, do đó có thể
tính đa dạng trong quần thể thông đỏ tại Việt Nam là một điều rất đáng quan tâm
đối với lĩnh vực bảo tồn và khai thác hợp lý nguồn tài nguyên này. Mức đa dạng di
truyền của quần thể càng cao thì quần thể càng có khả năng sống sót trước những
thông đỏ (khu vực) khác nhau thuộc Lâm Đồng.
2. Khảo sát mối quan hệ di truyền giữa một số cá thể thông đỏ được thu thập từ
khu vực Lâm Đồng bằng kỹ thuật PCR-RFLP trên vùng trình tự giữa hai gen
trnL-trnF của DNA lục lạp.
3. Bước đầu khảo sát trình tự vùng giữa 2 gen trnL-trnF trên DNA lục lạp của
thông đỏ Lâm Đồng.
-3-
Tổng quan
1. TỔNG QUAN
1.1 Thông đỏ Lâm Đồng - Taxus wallichiana Zucc. (Himalayan Yew)
1.1.1 Đặc điểm sinh học
1.1.1.1 Đặc điểm hình thái [1]
Thông đỏ là thực vật hạt trần, thuộc loại gỗ thường xanh, cao đến 20m. Thân có vỏ
màu hồng xám, phân nhiều cành mảnh, khi non màu lục. Lá mọc so le, thường xếp
2 dãy như 1 lá kép. Lá có hình dải rất hẹp, dáng cong, dài 2,5 - 3,5 cm, rộng 2 - 3
mm, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt trên lõm như lòng thuyền, mặt dưới có hai dãy lổ
khí. Thông đỏ có nón đực và nón cái khác gốc, mọc ở kẽ lá. Hột thông đỏ hình
trứng, vỏ cứng, được bao bọc bởi áo màu đỏ để hở đầu.
Hình 1.1 Cành lá và hột thông đỏ Lâm Đồng.
1.1.1.2 Đặc điểm tái sinh [22]
Thông đỏ có mùa ra hoa từ tháng 8 - 12 và đến tháng 6,7 năm sau thì tạo hột và hột
chín từ tháng 9 đến tháng 12, đôi khi hột còn tồn tại đến tháng 2,3 năm sau. Hột
thường chín rộ trong khoảng một tháng. Hột chín mọng có màu đỏ rực rỡ, thịt mềm
nhiều nước, hấp dẫn nhiều loại côn trùng và động vật, nhất là các loài chim, sóc,
khỉ, Khi chín, hột rụng xung quanh gốc cây mẹ một khoảng cách không xa lắm 5
– 30 m và nẩy mầm khi có điều kiện thuận lợi.
-4-
Tổng quan
km và cách quốc lộ 19 khoảng 5 km về hướng Tây-Nam.
-5-
Tổng quan
Huyện Đơn Dương thông đỏ phân bố ở khu vực Hồ Tiên thuộc tiểu khu 324,
325 (Ban Quản lý rừng Công An Huyện Đơn Dương), có cao độ 1.450 –
1.520 m, độ dốc >15
o
, cách Đà Lạt 39 km về hướng Đông nam và cách khu
vực Núi Voi, Cần Reo khoảng 5 km đường chim bay.
Hình 1.2: Sơ đồ phân bố của quần thể thông đỏ tại Lâm Đồng.
1.1.3 Hệ thống phân loại [46]
Ngành: Pinophyta
o Lớp: Pinopsida
Bộ: Pinales
Họ: Taxaceae
Chi: Taxus
Loài: Taxus wallichiana Zucc.
-6-
Tổng quan
Taxus có bốn loài ở Bắc Mỹ (Taxus brevifolia Nutt., Taxus canadensis Willd.,
Taxus floridana Nutt., Taxus globosa Schlecht.), một loài tại Châu Âu và Đông Á
(Taxus baccata L.) và rất nhiều loài khác phân bố dọc Đông và Đông Nam Á.
Việc phân loại các loài Taxus ở khu vực Đông và Đông Nam Á khá phức tạp và vẫn
chưa thống nhất. Theo De Laubenfels (1988), ngoại trừ Taxus cuspidata Siebold &
Zucc. thì tất cả các thông đỏ có ở Trung Quốc và Đông Dương đều là Taxus
sumatrana (Miq.) de Laub. Tuy nhiên, hệ thống phân loại này không nhận được sự
ủng hộ của các tác giả khác.
Các tác giả Li và Fu (1997) đã phân loại các mẫu thông đỏ mà họ thu thập được từ
Xizang (Tibet) và từ khu vực trung Nepal về hướng tây, đến Pakistan và
thể được bán tổng hợp từ các tiền chất taxoid. Do đó, bên cạnh Taxol, giờ đây giới
khoa học còn tập trung nghiên cứu nhằm chiết xuất ra những tiền chất trong con
đường sinh tổng hợp Taxol như baccatin III, 10-acetylbaccatin III (10-DAB)…
Tại Việt Nam, Taxol và tiền chất 10-DAB là hai hợp chất được nghiên cứu chiết
xuất nhiều nhất từ lá Taxus wallichiana Zucc. với hàm lượng trong khoảng dao
động từ 0.007% - 0.013% [22] và có thể cao đến 0.02% - 0.03% [9].
1.1.5 Vấn đề bảo tồn và nhân giống thông đỏ tại Việt Nam
Thông đỏ có giá trị sử dụng cao, nhu cầu lớn, nhưng khả năng tái sinh tự nhiên thì
rất thấp, do đó chúng được xếp vào nhóm có nguy cơ tuyệt chủng “CR C2a” ở nước
ta. Theo khảo sát của nhóm tác giả Lê Đình Khả (2006) thì thông đỏ Lâm Đồng chỉ
còn khoảng 200 cây [4]. Thông đỏ Lâm Đồng, Taxus wallichiana Zucc., còn được
ghi rõ trong nghị định 32/2006/NĐ-CP của chính phủ là “Thực vật rừng nguy cấp,
quý hiếm, cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại”.
Mặc dù quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng, nhưng loài thực vật này chỉ được ghi
nhận và bảo tồn tại một nơi duy nhất là vườn quốc gia Bidoup. Trong khi đó, những
-8-
Tổng quan
quần thể thông đỏ khác như Núi Voi thì vẫn chưa được quan tâm bảo tồn đúng mức
và đang phải chịu cảnh lâm tặc hoành hành.
Tuy nhiên, cũng như thế giới, nhiều nhà khoa học Việt Nam đã và đang quan tâm
rất nhiều đến các quần thể thông đỏ trong nước. Nhiều công trình khoa học tập
trung nghiên cứu vấn đề tái sinh, nhân giống nhằm bảo tồn và tạo nguồn nguyên
liệu ly trích taxol và 10-DAB cho ngành dược phẩm.
Tại trung tâm nghiên cứu lâm sinh Lâm Đồng, Trung tâm trồng và phát triển cây
thuốc Đà Lạt – Vimedimex, các nhà khoa học bước đầu đã thành công trong việc
nhân giống thông đỏ bằng kỹ thuật giâm hom. Ngoài ra, những điều kiện về sinh
thái, dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của thông đỏ cũng như thời gian thu hái
thích hợp cũng được quan tâm nghiên cứu tại các trung tâm trên.
Hình 1.3: Thông đỏ được nhân giống bằng kỹ thuật giâm hom tại Vimedimex
Tổng quan
1.2.2 Vùng giữa hai gen trnL-trnF trong nghiên cứu di truyền quần thể
Trên cpDNA có rất nhiều gen và vùng giữa hai gen được xem như những marker
tiến hóa quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về hệ thống phát
sinh loài hay khoảng cách di truyền giữa các quần thể. Điển hình là các gen rbcL,
ndhF, matK, atpB, rpl16 và vùng không mã hóa trnL intron hay khoảng giữa hai
gen trnL-trnF [54].
trnL là gen mã hóa cho tRNA (UAA), trnF là gen mã hóa cho tRNA (GAA).
Khoảng giữa hai gen trnL–trnF thường được dùng cho mục đích tái thiết lại những
giả thuyết về các mối quan hệ di truyền ở các mức phân loại khác nhau. Liên quan
tới thông đỏ, ở cấp họ, vùng này được sử dụng trong phân tích mối quan hệ giữa hai
họ taxodiaceae và cupressaceae [40]; ở cấp loài, vùng này được sử dụng trong việc
định danh phân loại các loài Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus cuspidata
[26] hay trong việc phân tích sự phát sinh loài của Taxus wallichiana thuộc Trung
Quốc và miền bắc Việt Nam [33].
1.3 Sự đa dạng di truyền [21]
Sự đa dạng di truyền trong loài thường bị ảnh hưởng bởi những tập tính sinh sản
của các cá thể trong quần thể. Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối với nhau
để sản sinh ra các thế hệ con cái hữu thụ. Một quần thể có thể chỉ vài cá thể đến
hàng triệu cá thể.
Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gen khác nhau, dù chỉ là rất ít. Gen là
một đơn vị di truyền. Những dạng khác nhau của một gen được gọi là allen. Tập
hợp một nhóm allen trên một vùng nhiễm sắc thể (NST) được gọi là một hallotype.
Sự khác nhau giữa các allen của cùng một gen thường là do đột biến.
Tổng các gen và allen trong một quần thể là nguồn gen của quần thể và những tổ
hợp của các allen mà mỗi cá thể có được gọi là kiểu di truyền. Kiểu hình của mỗi cá
thể được thể hiện bằng các tính chất về hình thái, sinh lý, hóa sinh và được đặc
trưng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trường nhất định.
-11-
Tổng quan
trường. Do đó, biến dị di truyền là nền tảng cho quá trình tiến hóa.
Cấu trúc di truyền là sự phân bố tỉ lệ của các dạng di truyền như là số allen hay kiểu
hình trong quần thể. Bất cứ sự thay đổi nào về cấu trúc di truyền của một quần thể
đều liên quan đến ít nhất một vị trí của gen và điều này được xem như là điều kiện
của sự tiến hóa. Tác nhân làm thay đổi cấu trúc di truyền của một quần thể được gọi
là nhân tố tiến hóa, bao gồm: đột biến, dòng chảy và sự di chuyển của gen, sự phân
mảnh di truyền, chọn lọc tự nhiên và hệ thống giao phối. Nói một cách khác, các
nhân tố tiến hóa có tác động phối hợp với nhau lên cấu trúc di truyền của tất cả các
cá thể sinh vật trong quần thể.
Sự biến đổi về cấu trúc di truyền không thể tìm thấy ở một cá thể riêng lẻ mà nó chỉ
xảy ra ở cấp độ quần thể. Từ thông tin di truyền của một sinh vật có thể truyền cho
con cháu của chúng tạo nên nhiều kiểu hình khác nhau. Việc theo dõi về cấu trúc di
truyền trong một quần thể hay vài quần thể đòi hỏi phải điều tra nghiên cứu về hệ
thống di truyền và tiến hóa.
1.3.2 Dòng chảy của gen
Hệ thống dòng chảy của gen được mô tả bằng sự trao đổi của các thông tin di truyền
ở trong và giữa các quần thể. Vì thực vật không di chuyển được, nên cơ quan giao
tử cái cũng ở dạng cố định. Do đó, có hai hướng nghiên cứu cơ bản quan trọng cho
sự biến động của gen chủ yếu là sự di chuyển của hạt phấn và hạt giống. Dòng chảy
của gen về sự di chuyển của hạt phấn có ý nghĩa hạn hẹp, còn sự di chuyển của cả
hạt phấn và hạt giống thì có ý nghĩa rất lớn. Điều này như là một nhân tố thiết yếu
cho không gian cấu trúc di truyền của sự phân bố các loài trong một khu vực.
1.3.3 Đặc điểm của các loài cây rừng
Cây rừng đóng vai trò quan trọng về di sản và di truyền do có độ đa dạng di truyền
cao và là nơi bảo tồn các nguồn gen quý. Các loài cây rừng đặc trưng bởi tần suất
các dị hợp tử và mức đa dạng sinh học rất cao. Chúng được ghi nhận cho quá trình
tái sinh diễn ra rất lâu khoảng hàng trăm năm. Một trong những đặc điểm quan
-13-
Tổng quan
trọng cho việc cải thiện nguồn di truyền là quá trình trưởng thành về mặt giới tính
1.4 Marker phân tử trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền
Marker di truyền đóng góp vào lĩnh vực nghiên cứu sự đa dạng quần thể thực vật
bằng cách cung cấp các kỹ thuật để phát hiện những biến đổi di truyền giữa các cá
thể, quần thể và loài. Trước đây, khi sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền chưa
phát triển, thì marker hình thái thường được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng này.
Tuy nhiên, các marker này có nhiều điểm hạn chế như: 1) các biến đổi hình thái
không phát hiện được ở một số loài; 2) các nghiên cứu sử dụng đặc điểm hình thái
nói chung thường giới hạn trong một locus; 3) nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể
quan sát được vào cuối chu kỳ sống; 4) nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà
liên tục và chồng lấp giữa các loài gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa
dạng di truyền của quần thể.
Trong những năm gần đây, khi sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền phát triển
mạnh mẽ, thì nhiều marker di truyền dựa trên DNA cũng được phát triển và mở ra
một kỷ nguyên mới cho ngành sinh học quần thể và bảo tồn. Các marker này giúp
chúng ta hiểu và từ đó có biện pháp quản lý và sử dụng sự đa dạng của quần thể một
cách tốt hơn.
Các kỹ thuật như sequencing, MHC (major histocompatibility complex),
minisatellite, microsatellite, RFLP (restriction fragment length polymorphisms) và
một số kỹ thuật mới đây dựa vào PCR như RAPD (random amplified polymorphic
DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphisms), ISSR (intersimple
sequence repeat polymorphisms) giúp phân tích tinh vi hơn cấu trúc di truyền của
quần thể và các sự kiện khác trong quá trình sinh học tiến hóa của chúng. Sự phát
triển mạnh mẽ cùng với số lượng nhiều các kỹ thuật phân tử trên đã giúp chúng ta
giải quyết được nhiều vấn đề liên quan đến sự di truyền cũng như bảo tồn các quần
thể thực vật. Các kỹ thuật này cho phép khảo sát để thu lượng lớn dữ liệu về sự biến
-15-
Tổng quan
đổi trong quần thể và loài nghiên cứu. Marker phân tử đầu tiên được phát triển là
RFLP (1980), tiếp đến là RAPD (1990).
1.4.1 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) marker [57, 66]
Mười chín năm sau khi được phát minh (1990 – 2009), RAPD đã được sử dụng
trong hàng ngàn nghiên cứu về đa dạng di truyền của rất nhiều loài trên thế giới.
Riêng đối với thực vật, tại Việt Nam, RAPD đã được sử dụng vào nghiên cứu đa
dạng di truyền ở loài Lim xanh [18], Dứa cayen [12], Cà chua [20], Gõ đỏ [7], Lan
kiếm [3], Tràm [21] Riêng với thông đỏ, RAPD đã được dùng trong nghiên cứu
về chi Taxus để nhận định loài có nhiều taxane của Taxus chinensis var. mairei [24],
để ước lượng liên hệ cây sinh loài của Taxaceae [62], để khảo sát sự đa dạng di
truyền trong quần thể Taxus canadensis [53], Taxus cuspidata var. Nana [43],
Taxus wallichiana Zucc. vùng đông bắc Ấn Độ [56] và Taxus wallichiana Zucc.
khu vực Hi mã lạp sơn [45].
1.4.2 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) marker
RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn. RFLP
biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng
các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong
các bào quan khác.
RFLP là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Nguyên tắc của kỹ thuật
này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn (RE) đối với vị trí nhận biết
của chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới
hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA
(được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt
giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.
RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và
dị hợp. Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra
nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp,
nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA
yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này.
-17-
Tổng quan
Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp
mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó
sequence repeats= SSR) chiều dài thường 1 – 100 bp. Do đó SSR có thể khuếch đại
trong ống nghiệm bằng phương pháp PCR với phát triển của primer theo miền của 2
bên trên một locus. Kết quả dựa vào độ dài và số lượng của các đoạn lập lại DNA
khác nhau giữa các động vật, thực vật và vi sinh vật để xác định được mức độ đa
dạng di truyền của các mẫu so sánh.
Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội (codominant) có khả năng phát hiện đa hình rất cao
và có khả năng tự động hoá trong quá trình thực nghiệm. Tuy nhược điểm của chỉ
thị này là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi loại primer chỉ đặc trưng cho một
loài. Nhưng marker SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các
vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền.
Copyright: Tài liệu đại học ©