BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
 VÕ THỊ MỸ LỘC NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP HỆ VI SINH VẬT CHỦ YẾU
TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN TỰ NHIÊN HẠT CA CAO

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã ngành: 60.54.10 LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
TS. MAI THỊ TUYẾT NGA
TS. NGUYỄN MINH TRÍ

NHA TRANG - NĂM 2013 i


LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC ……………………………………………………………………….iii
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục đích của đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài 2
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3
1. Tổng quan về ca cao 3
1.1. Tên khoa học 3
1.2. Đặc điểm, hình dạng của cây và quả ca cao 3
1.3. Các giống ca cao. 4
1.4. Tình hình trồng ca cao ở Việt Nam 5
2. Tổng quan về phương pháp lên men ca cao 6
2.1. Lên men trên nền khô 6
2.2. Lên men thành đống 7
2.3. Lên men trong rổ 8
2.4. Lên men trong thùng 8
3. Tổng quan về vi sinh vật trong lên men ca cao. 9
3.1. Nấm men 11
3.2. Vi khuẩn acetic 15
3.3. Vi khuẩn lactic 16
4. Biến đổi sinh hóa trong lên men ca cao. 19
4.1. Cấu tạo hạt ca cao 19
4.2. Biến đổi về nhiệt độ của khối lên men 19
4.3. Biến đổi pH của khối lên men. 20
4.4. Biến đổi sinh hóa 20
1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26

mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12 55
5.2. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy của vi
khuẩn acetic có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca cao tự
nhiên ở mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12 58
5.3. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy của vi
khuẩn lactic có số lượng chủ yếu phân lập được từ quá trình lên men ca cao tự
nhiên ở mẫu 10, mẫu 11, mẫu 12 61

v

5.4. Kết quả giải trình tự gen của các chủng vi sinh có số lượng chủ yếu phân
lập được trong quá trình lên men ca cao tự nhiên ở mẫu 12. 63
5.4.1. Nấm men 63
5.3.2 Vi khuẩn acetic 65
5.3.3. Vi khuẩn lactic 67
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69
KẾT LUẬN 69
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO 70
I. TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 70
II. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 70
III. MỘT SỐ TRANG WEB 73
vi
DANH MỤC BẢNG

Hình 3.6: Hàm lượng protein trong 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình mang
chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 38
Hình 3.7: Hàm lượng glucid trong 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình mang chữ
cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 39
Hình 3.8: Hàm lượng nước của cơm nhầy trong 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình
mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 39
Hình 3.9: Tỷ lệ cơm/hạt của 12 mẫu lên men. Các giá trị trung bình mang chữ cái
khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) 40
Hình 3.10 Sự biến đổi nhiệt độ của các mẫu trong suốt quá trình lên men 41
Hình 3.11 Sự biến đổi pH của 12 mẫu nghiên cứu trong quá trình lên men. 44
Hình 3.12 Sự biến đổi số lượng nấm men trong quá trình lên men 47

viii

Hình 3.13Sự biến đổi số lượng vi khuẩn acetic của 12 mẫu nghiên cứu trong quá
trình lên men 50
Hình 3.14 Sự biến đổi số lượng vi khuẩn lactic của 12 mẫu nghiên cứu trong suốt
quá trình lên men 52
Hình 3.15. Đặc điểm hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của nấm men 58
Hình 3.16. Hình thái dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của LA1 60
Hình 3.17. Hình thái tế bào của vi khuẩn lactic 62
Hình 3.18. Kết quả giải trình tự gen 28S của LN96hN2 (thuộc nhóm NM12.1) 63
Hình 3.19. Kết quả giải trình tự gen 28S của LN120hN1 (thuộc nhóm NM12.2) 63
Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn sự biến đổi số lượng của các chủng nấm men trong suốt
quá trình lên men 64
Hình 3.21. Kết quả giải trình tự gen 16S của LA-24 h N4 (thuộc nhóm LA12.1) 65
Hình 3.22. Sự biến đổi số lượng vi khuẩn acetic trong quá trình lên men. 66
Hình 3.23. Kết quả giải trình tự gen 16S của LL12.1 67
Hình 3.24. Sự biến đổi số lượng vi khuẩn lactic Lactobacillus fermentum
(LL12.1)trong suốt quá trình lên men 67

nghĩa quan trọng.
Xuất phát từ thực tiễn trên, dưới sự hướng dẫn của TS. Mai Thị Tuyết Nga
và TS. Nguyễn Minh Trí, tôi đề xuất được thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập
hệ vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao”.

2

2. Mục đích của đề tài
Nghiên cứu hệ vi sinh vật chính tham gia vào quá trình lên men tự nhiên hạt
ca cao, phân lập và định danh chúng.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập, định danh các chủng vi sinh vật chính trong quá trình
lên men tự nhiên hạt ca cao:
 Nghiên cứu phân lập và định danh các chủng nấm men chủ yếu
(chiếm ưu thế).
 Nghiên cứu phân lập và định danh các chủng vi khuẩn lactic chủ yếu
(chiếm ưu thế).
 Nghiên cứu phân lập và định danh các chủng vi khuẩn acetic chủ yếu
(chiếm ưu thế).
4. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài
- Đề tài sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học về hệ vi sinh vật chính trong lên men tự
nhiên hạt ca cao ở Việt Nam.
- Đề tài cũng là bước khởi đầu phục vụ cho quá trình nghiên cứu chuyên sâu
về lĩnh vực này.

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1. Tổng quan về ca cao.
1.1. Tên khoa học


1gram). Như thế tính trung bình mỗi năm cây có thể mang lại 3-4 kg / năm. Nếu
thời tiết thuận lợi cây có thể cho 5-7 kg / năm.

Hình 1.1 Cây ca cao, quả ca cao
Việc thu hoạch ca cao cũng cần sự khéo léo và cẩn thận vì nếu thu hoạch không
cẩn thận có thể làm ảnh hưởng và rơi rụng những nụ non đang nhú ra từ thân cây.
Trái ca cao sau thu hoạch sẽ được bổ ra để tách hạt phục vụ cho quá trình lên men.
1.3. Các giống ca cao.
Có 3 giống ca cao chính là Criollo, Forastero và Trinitario. Criollo là giống
cho hương vị đặc biệt, hạt ca cao Criollo thường được dùng để pha trộn vào các loại
ca cao khác khi chế biến, hoặc để dùng làm nguyên liệu để sản xuất ra những loại
chocolate đặc biệt. Tuy nhiên Criollo thường hay bị bệnh tật tấn công, loại ca cao
này ngày nay được trồng rất ít trên thế giới.
Forastero cho năng suất cao nên được trồng rộng rãi. Ngày nay 80% ca cao
trên thế giới được trồng là ca cao Forastero.

5

Trinitario là giống mới được cấy ghép giữa Criollo và Forastero, nó có mùi
thơm đặc biệt của Criollo và sản lượng cũng như khả năng chống chịu sâu bệnh của
Forastero. Tuy nhiên do nó là giống mới nên sản lượng trên thị trường thế giới còn
ít [36, 39, 40, 41].
Ở Việt Nam, tính đến nay thì Viện khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp Tây
Nguyên đã có khoảng trên hơn 60 giống ca cao, trong đó đã chọn được một số
giống cho năng suất cao có nhiều triển vọng. Thời gian sinh trưởng của cây có thể
kéo dài từ 25-40 năm, thích nghi ở nhiệt độ 30-32

trường xuất khẩu sản phẩm này. Lâm Đồng sẽ là một mắt xích quan trọng trong
“bản đồ ca cao” của cả nước với quy mô vùng nguyên liệu là 4.000 ha vào năm
2015 và tiến tới 5.000 ha vào năm 2020.
Năm 2011, dự án trồng và thâm canh cây ca cao đã ký hợp đồng với 12
Trung tâm Khuyến nông các tỉnh: Gia Lai, Đăk Lăk, Đăk Nông, Lâm Đồng, Bình
Thuận, Đồng Nai, Bình Phước, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tiền Giang, Vĩnh Long, Trà
Vinh và Bến Tre. Kết quả năm 2011, mô hình đạt quy mô 220 ha. Trong năm 2012,
dự án sẽ triển khai trồng mới 59 ha tại: Lâm Đồng 15 ha, Gia Lai 17 ha, Đăk Nông
10 ha và Bình phước 17 ha. Tuy nhiên bước đầu triển khai dự án còn gặp nhiều khó
khăn [43].
Thời gian gần đây, thị trường tiêu thụ của cây cao ngày càng rộng mở với
hàng chục doanh nghiệp trong và ngoài nước chế biến ca cao xuất khẩu với giá thu
mua ca cao hạt cho bà con nông dân trên 50.000 đồng / kg. Trong năm 2011, cả
nước đã xuất khẩu được 240 tấn hạt ca cao, đạt kim ngạch xuất khẩu 520.000 USD.
Nhiều điểm sơ chế và thu mua hạt ca cao (trái tươi và hạt khô) phát triển nhanh
chóng tại các vùng trồng ca cao [36,37,38,39,40,41].
2. Tổng quan về phương pháp lên men ca cao
Có một số phương pháp lên men như: lên men trên nền khô, lên men thành
đống, lên men trong rổ, lên men trong thùng.
2.1. Lên men trên nền khô [21]
Là phương pháp lên men chủ yếu ở Trung Mỹ, ở vùng này giống ca cao
được trồng phổ biến là Criollo. Hạt ca cao ẩm được làm khô trực tiếp trên nền.
Chúng được lên men và làm khô trong cả ngày. Để hạt ca cao Criollo lên men, hình
thành và phát triển hương vị thì cần thời gian từ 2-3 ngày. Đối với hạt Forastero thì
thời gian lên men cần để hình thành và phát triển hương vị khoảng từ 5-8 ngày. Mặc
dù giống Criollo được thay thế một lượng lớn bằng giống cây trồng lai tạo với
Forastero nhưng phương pháp lên men này vẫn tồn tại. Phương pháp lên men này
tạo hương vị tốt cho hạt Criollo nhưng nó không phù hợp với giống Forastero,
giống này cần thời gian lên men dài hơn để hương vị có thể phát triển tốt nhất.


Hình 1.4 Lên men trong rổ
2.4. Lên men trong thùng [21]
Phương pháp này cải tiến hơn các phương pháp khác. Nó được sử dụng cho
các khu vực có diện tích trồng ca cao lớn do lượng ca cao sử dụng trong lên men
phải lớn và ổn định. Mặc dù kích thước của các thùng lên men có khác nhau nhưng
chúng đều được thiết kế theo một tiêu chuẩn chung.
Thùng lên men có thể riêng lẻ cũng có thể được thiết kế thành hình chữ nhật
lớn, sau đó chúng được chia thành các ngăn nhỏ với diện tích khoảng 1 x 1 m. Ở
các kích thước khác nhau thì lượng ca cao lên men chứa trong thùng khác nhau.
Mỗi thùng lên men chứa khoảng từ 600 kg đến 700 kg hạt ca cao tươi. Các
thùng lên men được đặt bên trên, phía dưới có các rãnh cho phép dịch cơm nhầy bị
phân giải sau lên men thoát ra ngoài.
Thùng lên men được làm từ các tấm gỗ ghép lại, chúng có các lỗ hoặc các
rãnh giữa các tấm ván để nước dễ dàng rút đồng thời cho không khí lưu thông.
Thông thường người ta sử dụng kết hợp các thùng lên men nhỏ (0,4 x 0,4 m
hoặc 0,4 x 0,5 m) với nhau tạo thành một dãy từ 20 đến 30 thùng, và xếp thành 3
đến 5 dãy theo hình bậc thang. Đến thời gian đảo hạt người ta chỉ mở nắp thùng và

9

làm hạt từ thùng bên trên rơi xuống dãy thùng bên dưới, phương pháp này đảm bảo
cho không khí di chuyển vào bên trong khối hạt được đều hơn.

Hình 1.5: Lên men ca cao bằng thùng
Lượng hạt chứa trong các thùng lên men phải cách đỉnh thùng ít nhất 10 cm
và được che phủ bằng lá chuối hoặc bao tải giúp cho nhiệt của khối lên men không
thoát ra ngoài và ngăn chặn hiện tượng bề mặt khối lên men bị khô.
Ở Malaysia, quả ca cao sau khi thu hoạch được bảo quản 15 ngày để ổn định
thành phần trước khi tách hạt để lên men. Quá trình lên men quyết định đến hương
thơm, sự thay đổi màu sắc bên ngoài và bên trong hạt. Khi quá trình này kết thúc,

Malaysia
a
Belize
b

Vi
khuẩn
lactic
Lactobacillus
plantarum
Lactobacillus mali
Lactobacillus
collinoides
Lactobacillus
fermentum
Lactobacillus
plantarum
Lactobacillus
collinoides
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus brevis
Lactobacillus buchneri
Lactobacillus cellobiosus

Lactobacillus casei
subsp. pseudoplantarum
Lactobacillus delbrueckii

Lactobacillus

Gluconobater
oxydans
Nấm
men
Candida spp.
Hansenula spp.
Kloeckera spp.
Pichia spp.
Sacharomyces spp.
Sacharomycopsis
spp.
Schizosacharomyces
spp.
Torulopsis spp.
Candida spp.
Debaryomyces
spp.
Hanseniaspora
spp.
Hansenula spp.
Kloeckera spp.
Rhodotorula spp.
Sacharomyces spp.
Torulopsis spp.
Brettanomyces claussenii

Candida spp.
Candida boidinii
Candida cocoai
Candida intermedia

Fleet, số lượng tế bào nấm men lúc đầu là 10
4
-10
5
CFU/g, và sau 24-36 h lên men
chúng phát triển đến số lượng cực đại là 10
7
-10
8
CFU/g, sau đó số lượng bị giảm
nhưng vẫn duy trì cho đến khi quá trình lên men kết thúc [17].
Theo Luc De Vuyst và cộng sự, nấm men có mặt trong suốt giai đoạn đầu
của quá trình lên men (24 - 48 h lên men) [16]. Đối với lên men đống, số lượng tế
bào nấm men đếm được tối đa là 9,1×10
7
. Một số loài chiếm ưu thế trong phương
pháp lên men này là Candida krusei, P. membranifaciens, P. kluyveri,
Hanseniaspora guilliermondii và Trichosporon asahii [13].
Theo Nielsen và cộng sự và Ardhana & Fleet (2003), trong 24 h đầu thì H.
guilliermondii là loài chiếm ưu thế. Sau đó, thỉnh thoảng mới thấy sự có mặt của H.
guilliermondii, còn Candida zemplinina (Sipiczki, 2003) được tìm thấy trong suốt
quá trình lên men.
Theo Ardhana & Fleet nghiên cứu hệ vi sinh vật trong lên men ca cao ở
Indonesia cho thấy trong 24-36 h đầu Kloeckera apis là loài chiếm ưu thế (chiếm
70-90% tổng số nấm men trong suốt giai đoạn đầu), sau đó nó giảm xuống nhanh
chóng. Sau Kloeckera apis, là Saccharomyces cerevisiae và Candida tropicalis,
chúng có vai trò quan trọng trong quá trình lên men. Các loài nấm men này phát
triển mạnh ở giai đoạn đầu và chiếm ưu thế trong suốt giai đoạn sau của quá trình
lên men (48-120 h) [23].
Theo các nghiên cứu trên cho thấy ở mỗi nghiên cứu khác nhau thì thời điểm


Lactobacillus plantarum hay
Lactobacillus
paraplantarum

- + + + + + +
Lactobacillus pentosus
- + + + + - -
Lactobacillus paracasei subsp.
paracasei

- - + + + + +
Lactobacillus brevis
- - + + + - -
Vi khuẩn sinh acid aceticAcetobacter lovaniensis
- - + + - - -

Trong một số nghiên cứu về điều kiện phát triển của nấm men thì theo Doyle
và cộng sự, chủng S.cerevisiae có khả năng phát triển ở nhiệt độ 40
0
C, Kloeckera
apis phát triển ở 37
0
C và phát triển yếu ở 40
0
C. Tất cả các chủng S. cerevisiae và
các loài nấm khác phát triển tốt trong môi trường có ethanol từ 7% đến 10%. Các

Bên cạnh ethanol, nấm men còn sinh ra các sản phẩm khác như acid acetic,
acid malic, và acid succinic, chúng tạo nên một hệ đệm trong cơm nhầy ca cao.
Cũng như rượu, các acid béo và các este acid béo, chúng góp phần tạo nên hương
vị, các hợp chất tiền sinh hương của ca cao (Schwan và Wheals, 2004). Bên cạnh
đó, hoạt động của nấm men là nguyên nhân làm giảm độ nhớt và làm thoát nước
của khối ca cao lên men do chúng tiết ra các enzyme pectin làm phá vỡ cấu trúc
cơm nhầy (Gauthier và cộng sự 1977; Sanchez và cộng sự 1984, 1985; Schwan và
cộng sự 1995, 1997; Ardhana & Fleet 2003; Jespersen và cộng sự 2005). Khoảng
trống được tạo thành giữa các hạt do cơm của khối hạt bị lên men tạo điều kiện cho
không khí xâm nhập vào bên trong, thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn acetic và vi
khuẩn lactic. 15

3.2. Vi khuẩn acetic
Vi khuẩn acetic hoạt động trong khoảng từ 24 đến 112 h của quá trình lên
men. Quá trình này là quá trình lên men hiếu khí, nó xảy ra từ giai đoạn đầu của quá
trình lên men và tiếp tục kéo dài trong những giai đoạn sau cho đến khi kết thúc, khi
đó điều kiện cho hoạt động của vi khuẩn acetic là tối ưu nhất. Khi một lượng lớn
cơm nhầy được chuyển hóa và lượng nước mất đi cũng lớn, không khí bên trong
khối hạt tăng lên, và khi nhiệt độ tăng trên 37 °C, vi khuẩn acetic chịu nhiệt phát
triển với số lượng ban đầu từ 3-5 tăng lên tối đa là 5-8 log (CFU / g) ca cao lên men
[18].
Theo Nielsen và cộng sự thì thỉnh thoảng vi khuẩn acetic được tìm thấy trong
12 h đầu của quá trình lên men. Từ 24 h trở đi vi khuẩn acetic phát triển với một số
lượng lớn và sau 36-48 h lên men, số lượng của chúng đạt log (CFU / g) = 7,7-7,8,
ở những giai đoạn sau số lượng của chúng giảm.
Bên cạnh đó theo nghiên cứu quá trình lên men ca cao ở Indonesia cho thấy
trong 12 h đầu của quá trình lên men số lượng vi khuẩn acetic đạt tối đa là 10

O. Trong đó loài A. lovaniensis là loài duy
nhất được phân lập có khả năng oxy hóa acid acetic [34].

16

Vi khuẩn acetic có vai trò quan trọng đối với chất lượng hạt ca cao sau lên
men. Nó chuyển hóa đường và acid hữu cơ tạo thành các aldehyde, ceton và các sản
phẩm dễ bay hơi khác (Drysdale và Fleet, 1988), nó tạo ra hương thơm đặc trưng
cho hạt sau lên men (Bainbridge và Davies, 1912; Knapp, 1937; Roelofsen và Gies
Berger-, 1947) [12]. Tuy nhiên nó cũng có thể gây ảnh hưởng đến chất lượng cảm
quan của hạt [20].
Hoạt động chính của vi khuẩn acetic là oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic.
Quá trình oxy hóa này tạo ra một lượng lớn nhiệt (khoảng 496 kJ/mol ethanol bị
oxy hóa), quá trình này chủ yếu làm tăng nhiệt độ của khối lên men, có thể đạt 45-
50 °C hoặc cao hơn [18], hạn chế được sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác
[20]. Nồng độ ethanol giảm đi kèm với sự giảm nồng độ acid lactic, cho thấy quá
trình oxy hóa đồng thời ethanol tạo acid acetic và acid lactic chuyển hóa thành CO
2

và nước. Nồng độ acid acetic ở mức cao nhất khoảng 2%, sau đó chúng giảm có thể
là do nhiệt độ của khối lên men cao làm acid acetic chuyển thành CO
2
, nước và
nhiệt lượng (1754 kJ/mol acid acetic được oxy hóa). Ngoài ra quá trình oxy hóa
acid acetic và acid lactic còn làm pH của khối lên men tăng [18].
Khi ethanol đã bị oxy hóa hoàn toàn để tạo thành acid acetic, CO
2
, H
2
O thì