Website: Email : Tel : 0918.775.368
đặt vấn đề
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều
loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau.
Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1].
Berberin đợc biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli, điều
trị bệnh lỵ. Thuốc đợc sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn,
không ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của vi khuẩn có ích ở ruột.
Hiện nay trên thị trờng có các dạng bào chế của Berberin nh: thuốc nhỏ
mắt, viên nén, viên bao . Vì vậy vấn đề kiểm tra chất l ợng nguyên liệu làm
thuốc cũng nh thành phẩm là rất quan trọng.
Dợc điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên
liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ tử
ngoại UV- VIS, dợc điển Trung Quốc (2005) định lợng Berberin bằng HPLC.
Để có cơ sở lựa chọn phơng pháp định lợng Berberin thích hợp, chúng tôi đã
tiến hành thực hiện đề tài : So sánh hai phơng pháp định lợng Berberin
nguyên liệu bằng HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang
phổ hấp thụ UV-VIS theo dợc điển Việt Nam III với những mục tiêu sau:
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLC
theo dợc điển Trung Quốc (2005)
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng đo
quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
So sánh hai phơng pháp định lợng trên để tìm phơng pháp thích
hợp cho việc định lợng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất lợng
thuốc trong nớc.
PHầN I. TổNG QUAn
1
Website: Email : Tel : 0918.775.368
1.1. vài nét Về BERBERIN:
1.1.1. Cấu trúc:
Beberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung

gây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đờng ruột) [12], [17].
- Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng sẽ không
ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của hệ vi khuẩn có ích ở ruột, khi dùng
phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các
thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đờng ruột [17].
- Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co
cơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đờng, ức chế cơn nhịp nhanh thất,
giảm viêm cho ngời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm
tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin[17].

Chỉ định: [9],[12],[17]
- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật và
đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt.
- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng, gió,
lạnh, bụi, khói ) và điều trị bệnh đau mắt hột.
- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.
1.1.6. Chống chỉ định: [17]
- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin
- Ngời dị ứng với berberin ( rất hiếm gặp)
1.1.7. Dạng thuốc và hàm lợng: [11]
3
Website: Email : Tel : 0918.775.368
- Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lợng 10 mg, hoặc 50-100
mg/ viên
- Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích
bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói)
1.2. Một số phơng pháp định lợng Berberin:
1.2.1. Phơng pháp thể tích: [5], [13]
Hòa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào trong cốc với 150ml nớc đang sôi.
Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml. Lấy chính xác 50ml

18
NO
4
Cl đợc tính bằng công thức sau:
4
Website: Email : Tel : 0918.775.368

a
As
At
P
ìì=
006,1
1
a: khối lợng ( mg) kali dichromat.
Phơng pháp 2 [6]
Xác định hàm lợng berberin clorid trong viên nén.
* Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lợng trung bình và nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác một lợng bột viên tơng đơng với khoảng 80 mg berberin
clorid, thêm 10ml nớc để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng 200ml nớc sôi,
khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức 500ml, thêm nớc tới
vạch, lắc đều. Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy chính xác 5ml dung dịch
trong ở trên đem pha loãng với nớc cất vừa đủ 100ml.
* Dung dịch chuẩn : pha tơng tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu
berberin clorid.
* Mẫu trắng: nớc cất.
* Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều
kiện tại bớc sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy 1 cm.
1.2.3. Phơng pháp cân [5]
áp dụng để định lợng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo tủa

- Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x 4 mm) đợc nhồi bởi hạt silicagel đã đ-
ợc octadecylsilan hóa có đờng kính 5 àm.
- Nhiệt độ cột: 40
0
C.
- Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat và 1,7g natri laurylsulfat trong
1000 ml hỗn hợp dung môi nớc và acetonitril (1:1).
- Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lu của berberin khoảng
10 phút.
- Detector UV ở bớc sóng 345 nm.
- Thể tích tiêm: 10 àl.
- Nồng độ dung dịch thử và chuẩn: 0,1mg/ml và cách tiến hành pha 2 dung dịch
này giống nhau.
* Tiến hành:
Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin
trong các dung dịch thử , chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng
berberin trong chế phẩm.
* Cách tính: Lợng W
t
(mg) của berberin clorid (C
20
H
18
ClNO
4
).
W
t
= W
s

* Tiến hành: Tơng tự nh 2 phơng pháp HPLC đã trình bày ở trên.
1.3. Tổng quan Phơng pháp hplc
1.3.1. Nguyên tắc
Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và
định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất
với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu
năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất
7
Website: Email : Tel : 0918.775.368
cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha
động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha,
chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là
detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị
trên màn hình hoặc đa ra máy in. [8]
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một
tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột.
Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách đợc
các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc
đồ. [8], [11]
1.3.3. Các thông số đặc trng của quá trình sắc ký:
Kết quả của quá trình sắc kí đợc detector phát hiện, phóng đại và ghi
thành sắc ký đồ( hình 1):t
t

R
- t
o.
W
0,5
: Độ rộng pic ở nửa chiều cao
W
b
: Độ rộng đáy pic.
1.3.2.1. Hệ số dung lợng k

[8]
Nếu k' nhỏ thì
t
R
cũng nhỏ và sự
tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ đợc
tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau.
1.3.2.2 Độ chọn lọc

(selectivity - factor)
=
tt
tt
'k
'k
01R
02R
1
2




=
+

=
+

+
'k1
'k
ww
tt
ww
tt
B
B
A2/1B2/1
A,RB,R
AB
A,RB,R
1
4
N
18,12
[4], [8]
Độ phân giải cơ bản đạt đợc khi R = 1,5
1.3.2.4. Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó đợc tính theo công thức:

cong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lợng đợc chấp
nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tợng kéo đuôi càng rõ. Hiện tợng đỉnh kéo
đuôi (tailing peak) có thể là do tơng tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh hoặc
cột sắc ký bẩn. Đỉnh kéo tuyến trớc (fronting peak) có thể do lợng mẫu đa vào
quá lớn so với năng lực cột [7].
1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N
Đặc trng cho hiệu lực cột.
N = 16






w
t
B
R
2
hay N=5,54






w
t
B2/1

cao đến vài trăm bar.
- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh
có đờng kính rất nhỏ (3, 5, 10 àm).
- Đờng kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.
e/ Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ
UV - VIS. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa.
f/ Thiết bị hiển thị kết quả
Có nhiều loại nhng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu
đo dới dạng pic.
Sơ đồ khối hệ thống HPLC đợc tổng quát ở hình 2
11
Cột
Binh
chứa
pha
động
BơmVan tiêm
mẫu
Website: Email : Tel : 0918.775.368
Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC
1.3.5. Cách đánh giá pic[7]
* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tơng ứng với tổng lợng
chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay ngời ta thờng dùng máy tích phân điện
tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số
1,3 %). Phơng pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đờng nền và cả
pic có đờng nền bị trôi. Phơng pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic đợc
nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao.
* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic

Cl
Với là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc vào
nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bớc sóng của ánh sáng chiếu
vào dung dịch.
1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert beer
+ Chùm tia sáng phải đơn sắc
+ Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)
+ Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang).
+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánh
sáng (UV-VIS).
1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer
+ Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) nh do
tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém.
+ Sai lệch do hoá học:
- Do sự phân ly (ion hoá): thờng gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử chất
tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly không nh
nhau.
- Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng
đơn phân tử.
+ Do phản ứng các chất lạ:
- Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện t-
ợng này xảy ra, ngời ta dùng mẫu trắng có thành phần nh dung dịch, chỉ thiếu
chất cần định lợng.
- Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hởng tới kết quả định l-
ợng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng tạo màu, phải chú ý tới điều kiện
phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng.
1.4.1.4. Một số đại lợng thông dụng[
a/ Độ truyền qua (T-Transmittance):
13
Website: Email : Tel : 0918.775.368

A = =
1
1%
cm
E
Vậy
1
1%
cm
E
chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo
có bề dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một xác định,
1
1%
cm
E
là một hằng
số.
d/ Hệ số hấp thụ phân tử (

):
Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của dung
dịch có nồng độ 1M/l, dùng cốc đo có bề dày1cm.
Cũng nh
1
1%
cm
E
, với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định
(, dung môi, nhiệt độ,...)

E
biết trớc (tra cứu).
A =
1
1%
cm
E
.C.l C =
1
1%
cm
A
E
(với l =1 cm)
Trong phơng pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bớc sóng () và mật
độ quang A bằng cách:
Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D
2
(cho một vạch sáng có bớc sóng xác định).
Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.
Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị
max
xác định cho trong tài
liệu )để kiểm tra lại máy.
Dùng dung dịch K
2
CrO
4
, K
2

c
C
C
x
=x
c
A
A
x C
c
Chú ý: nồng độ của dung dịch thử C
x
và của dung dịch chuẩn C
c
không đợc
chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quả
càng chính xác.
15

Trích đoạn Tiếng việt

---