Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp là kết quả của 4 năm miệt mài học tập trên ghế giảng
đường Đại học, cũng là bước khởi đầu để làm quen với công việc nghiên cứu khoa học
thực thụ. Vì vậy, nó vô cùng có ý nghĩa đối với mỗi sinh viên. Tuy nhiên, hoàn thành tốt
Khóa luận là một công việc không hề đơn giản, không chỉ đòi hỏi sự nỗ lực, cố gắng của
bản thân người thực hiện mà còn cần đến sự động viên, cổ vũ của gia đình, bạn bè đặc
biệt là sự giúp đỡ nhiệt thành của các thầy cô và cán bộ hướng dẫn. Qua đây, tôi xin gửi
lời cảm ơn đến những cá nhân đã nhiệt tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện Khóa luận.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phan Văn Chi – Phó
viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Hoá Sinh Protein đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi, hướng dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa
học trong suốt quá trình thực hiện khoá luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Bùi Phương Thuận, Chủ nhiệm
bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá Sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên Hà Nội đã tận tình truyền thụ và trang bị cho tôi những nền tảng kiến thức vững
chắc trong thời gian học tập tại trường để tôi có thể chủ động tiếp thu tốt hơn những
kiến thức khoa học mới khi làm khóa luận.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS. Đỗ Quỳnh Hoa, người đã trực
tiếp hướng dẫn và nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Bích Nhi, ThS. Trần Thế Thành vì những
đóng góp quý báu trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hoá sinh Protein, Viện Công nghệ
Sinh học và các thầy cô Bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá sinh đã nhiệt tình hướng dẫn,
giúp đỡ, góp ý và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực tập và hoàn thành khoá luận tốt
nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, những người đã luôn
động viên, khích lệ và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2008

2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford
..........................................................................................................................17
2.2.4. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE)...............18
2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE).......19
2.2.6. Thủy phân protein trong gel bằng enzym trypsin.......................................20
2.2.7. Phân tách các protein huyết thanh bền nhiệt bằng hệ sắc ký nanoLC-MS.
.....................................................................................................................................20
2.2.8. Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS bằng phần mềm Mascot v1.8......
.....................................................................................................................................21
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................23
3.1. Thu nhận các protein bền nhiệt bằng phương pháp biến tính nhiệt...........23
3.2. Điện di SDS–PAGE kiểm tra các protein bền nhiệt thu được......................24
3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp so màu Bradford............25
3.4. Điện di 2-DE protein bền nhiệt.........................................................................27
3.5. Điện di 2-DE protein bền nhiệt trên dải pH hẹp............................................30
3.6. Loại bỏ Tris bằng phương pháp kết tủa protein............................................32
3.7. Kiểm tra hiệu quả loại Tris trên bản điện di 2-DE........................................34
3.8. Nhận dạng các protein bền nhiệt trên gel bằng hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS..
.....................................................................................................................................36
3.9. Tìm hiểu chức năng một số protein bền nhiệt đã được nhận diện...............37
3.9.1. Haptoglobin.....................................................................................................37
3.9.2. Apolipoprotein A (Apo)..................................................................................38
3.9.3. Transthyretin (TTR).......................................................................................40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................44
3
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Bảng Trang
Bảng 1. Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư......................5

protein đối với quá trình điện di 2-DE trên dải pH 3-10.......................................35
Hình 17. Kết quả nhận dạng haptoglobin với số đăng ký gi|4826762 ..................................37
Hình 18. Phổ MS/MS ion peptide (TSTQDWVQK) của Haptoglobin gi|4826762..............38
Hình 19. Trình tự amino acid của protein haptoglobin gi|4826762.......................................38
5
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 20. Kết quả nhận dạng ApoA-I với số đăng ký gi|37499465.......................................39
Hình 21. Phổ MS/MS ion peptide (HLAPYSDELR) của apoA-I gi|37499465....................40
Hình 22. Trình tự amino acid của protein apoA-I gi|37499465.............................................40
Hình 23. Kết quả nhận dạng của transthyretin với số đăng ký gi|1181953...........................41
Hình 24. Phổ MS/MS ion peptide (GSPAINVAVHVFR) của transthyretin gi|1181953....41
Hình 25. Trình tự amino acid của transthyretin với số đăng ký gi|1181953.........................42
6
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
MỞ ĐẦU
Huyết thanh là một hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng
khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể. Những
thay đổi về hàm lượng cũng như thành phần các protein trong huyết thanh thường có mối liên
hệ chặt chẽ với các quá trình bệnh lý. Vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu
là một trong những cách tiếp cận đuợc quan tâm nhất trong nghiên cứu proteomics hiện nay.
Tuy nhiên, thách thức lớn nhất trong nghiên cứu protein huyết thanh không chỉ ở số lượng rất
lớn protein có mặt (khoảng 10000 loại), mà còn là tỷ lệ rất khác nhau của chúng. Trong khi một
số protein có nồng độ cao như albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%-10%)…, thì ngược
lại, có rất nhiều protein, peptid có nồng độ rất thấp (ng/ml) như cytokin, hormon mà tổng nồng
độ của chúng chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số. Những khác biệt rất lớn về nồng độ này
cùng với sự hạn chế về mặt kỹ thuật của những phương pháp proteomics truyền thống (định
lượng và định tính protein) đã làm cho việc nghiên cứu một số phân đoạn protein có hàm lượng
thấp trong huyết thanh trở nên khó khăn và ít được chú ý trong một thời gian dài. Song gần đây,
sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp nghiên cứu proteomics hiện đại với độ nhạy và độ
chính xác cao đã cho phép các nhà nghiên cứu phân tách, nhận diện được nhiều protein tồn tại

nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể.
Huyết thanh không chỉ là mẫu xét nghiệm lâm sàng mà còn thể hiện rất nhiều đặc tính
hữu ích cho các nghiên cứu proteomics. Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích tiềm năng
cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học [8].
1.1.2. Đặc điểm, thành phần của hệ protein huyết thanh người
Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 - 250 gam
protein. Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong
huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ
ng/ml. Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [9].
Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng
protein tổng số (hình 1), trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin,
lipoprotein, ... [30]. Ngoài ra còn có rất nhiều protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hoặc rất
thấp nhưng lại giữ những chức năng quan trọng như các protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu
giữa các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả của sự phá hủy mô, do
nhiễm vi sinh vật, .... Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết thanh do nhiều nguyên nhân
khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau để phát
hiện chúng.
8
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 1. Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh [30]
Protein trong huyết thanh được coi là một trong những hệ protein phức tạp nhất ở người.
Một số protein có hàm lượng cao (mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml
(chiếm từ 50- 70%), do sự tổng hợp hàng ngày ở gan (khoảng 12g) và có thời gian bán hủy là 21
ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng [9, 10]. IgG khoảng
5-7 mg/ml chiếm 10%. Các protein có hàm lượng thấp (ng/ml) chỉ chiếm khoảng 1% hàm lượng
protein tổng số như interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA-125), β
2
-
microglobulin ... thông thường thay đổi từ 0 - 5 pg/ml và được coi là những chất chỉ thị có độ
nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý [43].

huyết thanh thành các nhóm chính: Protein tiết từ các mô rắn, các immunoglobulin miễn dịch,
các phối tử trung gian, các phối tử địa phương, các chất tạm thời, sản phẩm giải phóng từ các
mô, các chất tiết bất thường và các protein ngoại lai.
Hệ thống phân loại này được thừa nhận rộng rãi và trích dẫn lại trong các nghiên cứu
của Anderson (2002) [9].
1.1.5. Ý nghĩa của việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh
Huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn nhất và cũng là một mẫu
nghiên cứu hấp dẫn [1, 9]. Sự hấp dẫn của huyết tương đối với việc chuẩn đoán bệnh được
quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu không chỉ phản ánh
toàn diện kiểu hình người mà còn cho biết trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào đó.
Trong khi đó, những mẫu khác như nước bọt, nước mắt, nước tiểu, da, tóc chỉ được coi là một
tập con nhỏ của huyết tương hoặc mang tính địa phương và phản ánh hoạt động của tế bào [2].
Huyết thanh là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc
và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong
cơ thể. Chính vì thành phần protein phức tạp của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc mà
việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển
10
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh trao
đổi chất như đái tháo đường và các bệnh ung thư. Những thay đổi bất thường về thành phần
protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lý (bảng 1). Nói cách khác,
huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và
chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp
lý, đã và đang được minh chứng qua những thành tựu thu được trong nhiều thập kỷ qua.
Bảng 1. Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân bị ung thư [11, 43]
Tên bệnh Protein Nồng độ
Bình thường Bị bệnh
Ung thư trực tràng,
ống tiêu hoá
CEA (Carcinoembryonine

hoạt tính sau khi đã được xử lý ở nhiệt độ 98
o
C trong 10 phút theo phương pháp của Goufman
và có thể nhận ra được bằng một số phương pháp proteomics như điện di hai chiều và khối phổ
[22]. Các protein bền nhiệt trong huyết thanh thường là những protein có nồng độ thấp và rất
thấp (có thể < 1 pmol), vượt quá giới hạn độ nhạy của các phương pháp nghiên cứu protein
truyền thống. Do đó, trong suốt một thời gian dài, các nghiên cứu về hệ protein bền nhiệt không
được phổ biến và không theo kịp với sự tiến bộ nhanh chóng trong các nghiên cứu về hệ protein
khác ở người. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chóng và vượt bậc
về mặt kỹ thuật, các phương pháp nghiên cứu protein mới như hệ sắc ký Nano đa chiều, phương
pháp nhận diện và định lượng protein bằng khối phổ đã cho phép nhà nghiên cứu thao tác trên
các protein có hàm lượng nhỏ hơn 1pg nhiều lần. Các phương pháp này đã mở ra triển vọng mới
cho việc nghiên cứu các hệ protein hàm lượng thấp, trong đó có hệ protein bền nhiệt trong huyết
thanh.
Tính bền nhiệt của các protein có mối quan hệ chặt chẽ với các cấu trúc tương ứng của
chúng. Ngoài ra, nó còn liên quan đến những cải biến và những biến đổi sinh hóa của protein
như các quá trình glycosyl hóa [31], ..... Do đó, sự thay đổi tính bền nhiệt của protein chắc chắn
có những mối liên hệ nhất định với các biểu hiện bệnh lý. Nghiên cứu các protein bền nhiệt có
thể giúp tìm ra những ứng viên chỉ thị bệnh hiệu quả và có độ nhạy cao.
1.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE)
1.2.1. Giới thiệu chung
Kỹ thuật điện di hai chiều (Two Dimensional Electrophoresis, 2-DE) là một trong những
công cụ phân tách protein truyền thống và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về hệ protein
[20, 36, 25]. Đây là phương pháp có độ phân giải cao hơn hẳn các phương pháp phân tách
protein khác hiện có như sắc ký, điện di một chiều, .... Hiện nay, sự phát triển của kỹ thuật 2-DE
cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0,1 đơn vị pI, 1kDa về khối lượng phân tử và
có thể phát hiện vệt protein có hàm lượng < 1ng. Tùy thuộc vào kích thước lỗ gel và giải
gradient pH sử dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein có mặt trong mẫu cùng
một lúc, đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của các mẫu phân tích [7]. Nhờ đó mà
nó ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp

Sự khác biệt về điểm đẳng điện pI (Isoelectric point) của các protein chính là cơ sở của
IEF. pI là giá trị pH tại đó điện tích bề mặt tổng số của protein bằng 0 (protein không di chuyển
trong điện trường). Mỗi protein có một giá trị pI xác định, do đó dưới tác dụng của điện trường
trong quá trình điện di IEF, các protein sẽ di chuyển và dừng lại tại vị trí có pH tương ứng với
pI của chúng.
1.2.3. Thế mạnh và những tồn tại của kỹ thuật 2-DE
Điện di 2-DE là một trong những công cụ mạnh trong phân tích các hỗn hợp protein
phức tạp và là phương pháp không thể thay thế trong so sánh các mẫu có liên quan như mô bệnh
so với mô thường [2, 32]. Đây là phương pháp cổ điển nhưng vẫn được áp dụng rộng rãi và
thường gắn liền với proteomics vì nó có khả năng phân tách cao, hiển thị hình ảnh so sánh
tương quan, đem lại bức tranh toàn cảnh về mức độ biểu hiện khác nhau của các protein [20].
Khả năng tập hợp dữ liệu và số hóa dữ liệu cũng là một trong những yếu tố quan trọng
cho phép 2-DE trở thành một phương pháp thực nghiệm có nhiều ý nghĩa trong việc xây dựng
các tập hợp thông tin về một hệ proteome. Nó cho phép so sánh khách quan các kết quả nghiên
14
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
cứu, điều chỉnh sự sai khác trong kết quả nghiên cứu giữa các nhóm nghiên cứu khác nhau và
phân loại được một số lượng khổng lồ các dữ liệu protein đã được phân tích [14].
Một trong những ưu điểm nữa của phương pháp điện di 2-DE là khả năng kết nối với
các hệ thống phân tích hình ảnh gel hoàn toàn tự động. Các phần mềm phân tích và xử lý hình
ảnh gel như PDQuest, Proteom Weaver, Z3, Delta2D, Decyder 2D, ... cho phép phân tích, so
sánh, định lượng , chú thích, chú giải và phân loại dữ liệu cho các protein phát hiện được. Ngoài
ra, các phần mềm này còn có khả năng kết nối đến các hệ thống nhặt điểm và cắt gel tự động và
thủy phân các điểm protein này để phục vụ cho việc phân tích trên hệ thống khối phổ [15, 45].
Tuy nhiên, điện di 2-DE cũng gặp phải một số vấn đề trong đó phổ biến nhất là tính lặp
lại tương đối của thí nghiệm điện di. Kết quả điện di của cùng một mẫu có thể có những sai lệch
giữa các lần chạy khác nhau [32, 35]. Vấn đề này càng trở nên nghiêm trọng khi sử dụng 2-DE
cho mục đích so sánh sự khác biệt giữa hai mẫu khác nhau [32].
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của điện di 2-DE
Sự thành công của điện di 2-DE phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: phương pháp chuẩn bị

pháp nhuộm truyền thống để dễ quan sát, bao gồm nhuộm bạc, Coomasie và amido đen, ...
Trong đó, phương pháp nhuộm bạc và nhuộm huỳnh quang kiểu mới cho độ phân giải cao nhất
[32].
Mặc dù có nhiều phương pháp nhuộm khác nhau, nhưng không phải tất cả các phương
pháp này đều phù hợp với những thí nghiệm phân tích tiếp theo. Ví dụ phương pháp nhuộm bạc
17
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
và cố định bằng formalin sẽ cố định các protein trong gel và ngăn cản sự thủy phân chúng bằng
enzyme khi phân tích bằng khối phổ [32].
1.2.5. Nhận diện protein bằng điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS)
Nguyên lý chung của khối phổ
Khối phổ (Mass spectrometry-MS) là kỹ thuật phân tích đo phổ về khối lượng của các
phân tử tích điện khi chúng di chuyển trong điện trường. Mẫu được ion hóa trở thành các phân
tử tích điện khác nhau và được phân tách dựa vào sự sai khác về giá trị m/z. Dữ liệu phổ khối
được tự động ghi lại và sử dụng để nhận dạng protein bằng các công cụ tin sinh học.
Cấu tạo chung của máy khối phổ
Máy khối phổ thường được cấu tạo từ các bộ phận chính sau đây: (1) bộ phận đưa mẫu;
(2) nguồn ion hóa; (3) hệ thống bơm chân không; (4) bộ phận phân tích khối (mass analyzer) đo
tỷ lệ m/z; (5) bộ phận đo tín hiệu (detector) xác định số lượng các ion ở mỗi giá trị m/z; (6) hệ
thống phân tích dữ liệu, bao gồm máy tính cấu hình cao với các phần mềm chuyên dụng [2].
Hình 5. Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với các khả năng lắp đặt khác nhau [2]
Kết hợp điện di 2 chiều - khối phổ (2DE-MS)
Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối
phổ đang là một trong những cách tiếp cận thường được sử dụng nhất trong nghiên cứu
proteomics [20, 22].
18
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hình 6. Sơ đồ kết hợp 2-DE và khối phổ MS/MS trong xác định protein [2]
Quá trình này có thể chia thành 5 giai đoạn (hình 6). Ở giai đoạn (1), hỗn hợp protein
được phân tách và tinh sạch trên gel nhờ kỹ thuật 2-DE. Sau quá trình điện di là sự phân tích

Hãng Vật liệu
Fisher Scientific Methanol (HPLC grade), Acetonitrile (HPLC grade)
Bio-Rad
Hoá chất điện di SDS-PAGE (Bio-Rad, USA), hóa chất điện di 2
chiều (strip, đệm cân bằng 1, đệm cân bằng 2…)
Merck Acetonitrile, muối NaCl...
New England Biolab Thang protein chuẩn (Protein Marker)
Promega Trypsin
Sigma
TriChloroAcetic (TCA), acrylamide, bis- acrylamide,
N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendiamine (TEMED), Ammonium
persulfate (APS), Sodium dodecyl sulfate (SDS), TriFlourAcetic
(TFA), Formic acid (FA), Dithiothreitol (DTT), Amonium
bicarbonate (NH
4
HCO
3
)
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị điện di 1 chiều SDS-PAGE và hai chiều 2-DE mua từ Bio-Rad (Hercules,
CA, Mỹ).
20
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Hệ sắc ký lỏng nanoLC đa chiều từ LC Packings (LC Packings, Amsterdam, Hà Lan)
được sử dụng để phân tách. Hệ sắc ký gồm một microautosampler FAMOS, bơm Ultimate
micro HPLC, và thiết bị chuyển cột Swichos.
Hệ máy khối phổ QSTAR® XL, sử dụng nguồn ESI (AplliedBiosystems, MDS SCIEX,
Canada). Cột sắc ký ngược pha C18 (Vydac, Mỹ), đầu đưa mẫu Sillica PicoTip (New Objective,
Mỹ).
Phần mềm Mascot v1.8 (MatrixScience, London, Anh). Phần mềm BioAnalyst QS v1.1

Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
máy biến tính nhiệt tại nhiệt độ 100
o
C trong 5 phút; (vi) Hòa tan lại protein trong đệm (8M ure,
2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte). Dung dịch protein bền nhiệt
được bảo quản ở -80
o
C.
2.2.3. Xác định hàm lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp Bradford
Hàm lượng protein trong mẫu được xác định bằng phương pháp Bradford với thuốc
nhuộm Quick Start Bradford Dye Regent 1x của hãng Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, Mỹ). Cơ sở
của phương pháp là định lượng protein dựa vào đặc điểm liên kết của thuốc nhuộm Coomassie
Brilliant Blue G-250 với protein [12]. Trong môi trường axit, Coomassie Brilliant Blue G-250
tồn tại chủ yếu ở dạng cation màu đỏ, hấp thụ hai proton (A
max
= 470 nm), còn khi thuốc nhuộm
liên kết với các gốc axit amin kiềm (arginine) hoặc thơm của protein, chúng chuyển sang dạng
màu xanh và không hấp thụ proton (A
max
= 595 nm). Dạng liên kết thuốc nhuộm - protein được
phát hiện ở bước sóng 595 nm bằng máy quang phổ. Protein chuẩn được sử dụng để định lượng
protein trong nghiên cứu này là albumin huyết thanh bò (BSA - Bovine Serum Albumin). Các
bước thí nghiệm được tiến hành như sau:
Dựng đường chuẩn bằng cách đo OD tại các nồng độ chuẩn khác nhau của BSA
• Chuẩn bị 7 ống eppendorf với các nồng độ protein chuẩn BSA như sau: 0,125
mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,75 mg/ml; 1 mg/ml; 1,5 mg/ml; 2 mg/ml.
• Rút 20 µl dung dịch BSA ở từng nồng độ kể trên trộn đều với 1ml dung dịch
Bradford 1x. Để phản ứng trong hỗn hợp xảy ra tổi thiểu 5 phút (tối đa không quá 1h) ở nhiệt độ
phòng trước khi đem đo trên máy quang phổ, tại bước sóng 595 nm. Lặp lại thí nghiệm từ 2-3
lần cho mỗi nồng độ BSA kể trên.

4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45µl 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50%
glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H
2
O, 30 µl 10% (w/v)
APS, 3 µl TEMED
Đệm hòa mẫu
5x
25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1
(w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8
Đệm điện di 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3
Quá trình điện di được thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30 phút và (ii) 150V
cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản
gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1%
(w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản
gel được tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có
thể quan sát thấy các băng protein.
2.2.5. Phân tách protein bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE)
2-DE là kỹ thuật phân tách các protein dựa trên sự khác nhau về điểm đẳng điện và khối
lượng phân tử trên gel polyacrylamide. Ở chiều điện di thứ nhất (điện di đẳng điện, isoelectric
focusing - IEF), dưới tác dụng của điện trường, các protein di chuyển đến các vị trí pH mà tại đó
điện tích tổng số của protein bằng 0, nói cách khác là di chuyển tới điểm đẳng điện pI của
chúng. Ở chiều điện di thứ hai (điện di biến tính SDS-PAGE), các protein tại những giá trị pH
nhất định tiếp tục được phân tách theo khối lượng phân tử.
23
Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
Điện di chiều thứ nhất (điện di đẳng điện)
Protein huyết thanh sau khi xử lí nhiệt và loại Tris bằng phương pháp kết tủa được hòa
trong đệm (8M urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte và 0.001%
Bromophenol Blue). Hỗn hợp mẫu được thấm vào thanh gel dài 7cm, chứa dải pH từ 3 đến 10
hoặc 17cm, chứa dải pH từ 4 đến 7 (do hãng Bio-Rad, Mỹ cung cấp) trong thời gian từ 12 giờ

Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc
đi vào phân tích bằng khối phổ MS/MS và do đó làm tăng khả năng phát hiện các thành phần
protein có nồng độ thấp trong mẫu.
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng sắc ký một chiều kết nối khối
phổ 1D nanoLC-ESI-MS/MS để phân tích và nhận dạng protein do các protein đã được phân
tách trước đó nhờ kỹ thuật 2-DE. Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân được cô đặc muối trên cột
Trap, sau đó sẽ được phân tách trên cột sắc ký ngược pha C18. Cuối cùng hỗn hợp sẽ đưa vào
hệ thống khối phổ để phân tích. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng nanoLC được tổng kết
trong bảng 4.
Bảng 4. Các thông số của hệ thống sắc ký lỏng NanoLC
Sắc ký lỏng nano
UltiMate™ / FAMOS/ Switchos™
(LC Packings/Dionex)
Cột ngược pha
300µl x 5 mm C18 PepMap100, LC Parking, Nertherland)
Cột C18
75µl ID. x 15 cm, Grace Vydac, Hesperia, CA, USA
Tốc độ dòng 200 nl/phút
Tốc độ dòng Switchos
30 µl /phút
Thể tích mẫu
20 µl (mẫu và muối)
Các loại đệm
A: 0,1% FA
B: 85% ACN trong 0,1% FA
Thời gian
90 phút, phút 10 bắt đầu tạo gradient với nồng độ đệm B
tăng từ 0-100% trong 65 phút.
Ghi phổ NanoLC-ESI- MS/MS
Máy khối phổ QSTAR